Část 1: Akteosid potlačuje osteoklastogenezi zprostředkovanou RANKL inhibicí indukce C-Fos a dráhy NF-KB a zeslabením produkce ROS
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Abstraktní
Četné studie uvádějí, že zánětlivé cytokiny jsou důležitými mediátory pro osteoklastogenezi, čímž způsobují nadměrnou kostní resorpci a osteoporózu.Akteosid z byliny cistanche, hlavní účinná látka Rehmannia glutinosa, která je široce používána v tradiční orientální medicíně, má protizánětlivý a antioxidační potenciál. V této studii jsme to zjistiliakteosidvýrazně inhibovala diferenciaci a tvorbu osteoklastů z makrofágů kostní dřeně (BMM) a makrofágů RAW264.7 stimulovaných receptorovým aktivátorem ligandu nukleárního faktoru kappaB (NF-kB) (RANKL).Akteosidpředběžné ošetření také zabránilo kostní resorpci zralými osteoklasty způsobem závislým na dávce. Akteosid (10 mM) zeslabil RANKL-stimulovanou aktivaci p38 kinázy, extracelulárním signálem regulovaných kináz a c-Jun N-terminální kinázy a také potlačil aktivaci NF-kB inhibicí fosforylace podjednotky p65 a inhibitoru kBa. Navíc RANKL zprostředkované zvýšení exprese c-Fos a jaderného faktoru aktivovaných T-buněk, cytoplazmatického 1 (NFATc1), a produkce tumor nekrotizujícího faktoru-a, interleukinu (IL)-1b a IL-6 byly zjevně inhibovány předběžnou léčbou akteosidy. Dále ústníakteosidsnížení kostní ztráty vyvolané ovariektomií a produkce zánětlivých cytokinů na kontrolní hladiny. Naše data naznačují, že akteosid inhibuje diferenciaci a zrání osteoklastů z osteoklastických prekurzorů potlačením RANKL-indukované aktivace mitogenem aktivovaných proteinkináz a transkripčních faktorů, jako jsou NF-kB, c-Fos a NFATc1. Souhrnně tyto výsledky naznačují, že akteosid může působit jako antiresorpční činidlo ke snížení ztráty kostní hmoty blokováním aktivace osteoklastů.
Úvod
Kost je neustále remodelována vyváženou aktivitou osteoklastů a osteoblastů [1]. Osteoklasty vznikají z hematopoetických prekurzorových buněk monocytární/makrofágové linie, zatímco osteoblasty jsou mezenchymální linie [2]. Abnormální aktivace osteoklastů nebo snížená osteoblastogeneze mohou narušit kostní homeostázu a případně způsobit onemocnění, jako je osteoporóza, artritida a rakovina kostí [3,4]. Osteoporóza je běžné onemocnění kostí, které vede ke zvýšenému riziku zlomenin. Nejběžnější forma osteoporózy je způsobena nedostatkem estrogenu u žen v menopauze. Léky, jako jsou kortikosteroidy a antiepileptika, mohou také způsobit nerovnováhu mezi resorpcí a tvorbou kosti, což může vést k osteoporóze [5].
K léčbě osteoporózy bylo použito mnoho antiresorpčních inhibitorů včetně bisfosfonátů, kalcitoninu, estrogenu a selektivních modulátorů estrogenových receptorů. Tyto inhibitory udržují kostní hmotu inhibicí funkce osteoklastů [6]. Estrogenová substituční terapie je nejoblíbenější léčbou k prevenci a léčbě postmenopauzální osteoporózy. Dlouhodobá estrogenová substituční terapie však může zvýšit riziko rakoviny endometria a prsu. Mnoho výzkumníků proto zaměřilo své úsilí na vývoj nového antiresorpčního činidla, které nemá vedlejší účinky [7–10]. Protože osteoklasty fungují při kostní resorpci, byla specifická inhibice osteoklastů považována za hlavní cíl v mnoha studiích.
Osteoklasty jsou mnohojaderné obří buňky tvořené mononukleárními progenitory z rodiny monocytů/makrofágů prostřednictvím sekvenční proliferace, diferenciace a fúze hematopoetických prekurzorových buněk [11]. Faktor stimulující kolonie makrofágů (M-CSF) a receptorový aktivátor nukleárního faktoru (NF)-kB (RANK) ligand (RANKL) jsou zásadní faktory pro diferenciaci osteoklastů [12]. Kromě toho několik zánětlivých cytokinů, jako je tumor nekrotizující faktor (TNF) a interleukin (IL)-1b, přispívá k osteoklastogenezi modulací indukce RANKL, osteoprotegerinu a M-CSF [7,13]. Vazba RANKL na buněčný povrchový RANK receptor má za následek vznik komplexů RANKL/RANK/TNFR asociovaných faktorů (TRAF), které sekvenčně aktivují NF-kB a mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK), včetně c-Jun N-terminální kinázy (JNK), p38 kináza a kináza související s extracelulárním signálem (ERK) [14]. Tato aktivace hraje klíčovou roli při zprostředkování diferenciace, aktivace a přežití osteoklastů. RANKL také aktivuje expresi transkripčních faktorů, jako je nukleární faktor aktivovaných T-buněk, cytoplazmatický 1 (NFATc1) a c-Fos, které jsou nezbytné pro vývoj osteoklastů [7,9]. Signalizace RANKL je proto považována za hlavní cíl antiresorpčních látek, které potlačují aktivaci osteoklastů a ztrátu kostní hmoty.
Akteosidje hlavní účinnou látkou Rehmannia glutinosa, která je široce používána v tradiční orientální medicíně [15,16]. Akteosid je silný antioxidant a má antihepatotoxické, protizánětlivé a antinociceptivní účinky [17–20]. Již dříve jsme zjistili, že akteosid snižuje aktivitu tyrosinázy a biosyntézu melaninu regulací signalizace ERK [21], chrání před poškozením gingivy zprostředkovaným reaktivními formami kyslíku (ROS) [22] a potlačuje poškození buněk zprostředkované mykotoxiny [23]. Tyto účinky úzce souvisí se schopností nukleosidů odstraňovat ROS a regulovat signalizaci zprostředkovanou MAPK. Zejména se předpokládá, že ROS zprostředkovávají RANKL-indukované signální dráhy a buněčné události v osteoklastech. Předběžná léčba antioxidanty inhibovala RANKL-indukovanou aktivaci NF-kB, ERK a IkBa, a tím potlačila osteoklastogenezi [24]. Tato zjištění silně naznačují, že kromě protizánětlivé aktivity je pro antiresorpční činidlo klíčová antioxidační aktivita, takže akteosid může potlačit osteoklastogenezi indukovanou RANKL.
V této studii jsme zkoumali, zda má akteosid terapeutický účinek na ztrátu kostní hmoty. Zkoumali jsme účinky akteosidu na diferenciaci osteoklastů a kostní resorpci a související buněčné mechanismy pomocí in vitro a in vivo experimentálních systémů.
Akteosid Cistanche potlačuje osteoklastogenezi indukovanou RANKL
Materiály a metody
Etické prohlášení
Postupy péče o zvířata a jejich používání byly schváleny Výborem národní univerzity Chonbuk pro etiku v péči o laboratorní zvířata a jejich používání (povolení č. CBU 2010-0007). Všechny experimenty v této studii byly provedeny podle pokynů Výboru pro péči o zvířata a použití na univerzitě.
Myši, chemikálie a laboratorní zboží
Čtyřtýdenní samice myší ICR byly zakoupeny od Orient Bio Inc. (Seoul, Korea) a umístěny při 2261 uC a 5565 procentech vlhkosti v 12hodinovém cyklu světlo/tma s volným přístupem k potravě a vodě. Akteosid (3,4-dihydroxy-bfenethyl-Oa-rhamnopyranosyl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glukopyranosid; C29H36O15) (obr. S1) byl izolován z listů Rehmannia glutinosa. Akteosid byl před použitím rozpuštěn ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 a M-CSF byly zakoupeny od R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Protilátky specifické pro c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATcl, IkBa, p-IkBa a b-aktin byly získány od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Protilátky pro p-p38 a p38 byly zakoupeny od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Sady Calcium Assay a Osteocalcin (OC) EIA Kit byly zakoupeny od BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) a Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), v daném pořadí, pro stanovení biochemických parametrů séra. K měření hladiny TRAP5b v séru byla také použita testovací souprava myší tartrát-rezistentní kyselá fosfatáza (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA). Pokud není uvedeno jinak, další chemikálie byly získány od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) a laboratorní zboží bylo od SPL Life Sciences (Pochun, Jižní Korea).
Buněčné kultury
Buňky kostní dřeně byly získány z tibie a femora 6 týdnů starých samic myší ICR podle metod popsaných dříve [25]. Suspenze kostní dřeně byla inkubována v 100-mm kultivační misce v přítomnosti 50 ng/ml M-CSF. Po 3 dnech byly adherentní buňky použity jako makrofágy kostní dřeně (BMM) k indukci osteoklastické diferenciace. Některé buňky kostní dřeně byly také inkubovány po dobu 48 hodin bez M-CSF a adherentní buňky byly kultivovány v médiu pro diferenciaci osteoblastů, jak je popsáno jinde [25]. Makrofágové buňky RAW264.7 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS), 2 mM L-glutaminu a antibiotiky. Tyto buňky byly použity jako protějšek buněčné linie pro BMM ke zkoumání účinku akteosidu na osteoklastogenezi.
Osteoklastická diferenciace a barvení TRAP
BMM byly předem ošetřeny různými koncentracemi (0–50 mM).akteosidpo dobu 2 hodin před stimulací 100 ng/ml RANKL. Kultivační médium bylo nahrazeno čerstvým médiem ve dnech 2 a 5. Po 7 dnech inkubace byly kultury fixovány v 4% PBS-pufrovaném paraformaldehydu a obarveny TRAP za použití soupravy Sigma Aldrich podle pokynů výrobce. TRAP-pozitivní buňky byly spočítány pomocí optické mikroskopie a buňky obsahující 3 nebo více jader byly považovány za osteoklasty. Buňky RAW 264.7 byly také vystaveny 100 ng/ml RANKL po předběžném ošetření akteosidem po dobu 2 hodin a po 7 dnech inkubace byly buňky zpracovány pro barvení TRAP.
Měření životaschopnosti buněk
Životaschopnost buněk byla stanovena pomocí činidla ve vodě rozpustné tetrazoliové soli (WST)-8. Stručně řečeno, buňky BMM nebo RAW264.7 kultivované v růstovém médiu obsahujícím 10 procent FBS a antibiotika byly ošetřeny 10 mM akteosidem nebo fenolickou sloučeninou, jako je kvercetin, luteolin, apigenin nebo epigalokatechin-3-galát (EGCG). Činidlo WST-8 bylo přidáno do kultur po 48 hodinách inkubace. Po inkubaci po dobu dalších 4 hodin byla měřena specifická absorbance WST{10}} při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).
Test kostní resorpce
BMM (16105 buněk/ml) byly suspendovány v a-MEM obsahujícím 50 ng/ml M-CSF a 100 ng/ml RANKL, poté rozděleny na 24-jamkovou destičku potaženou nanokrystaly fosforečnanu vápenatého (OAAS{6}) Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Jižní Korea) při hustotě 26104 buněk/cm2 s a bez akteosidu. Po inkubaci po dobu 7 dnů byly buňky odstraněny z destiček pomocí 5% chlornanu sodného a pod optickým mikroskopem byla pozorována tvorba důlků. Resorbovaná plocha byla také měřena obrazovým analyzátorem a vyjádřena jako procento kontrolní hodnoty.
Analýza Western Blot
Celé proteinové lyzáty byly připraveny v lyzačním pufru, jak je popsáno jinde [26]. Cytosolické a jaderné proteiny byly připraveny tak, jak bylo popsáno dříve [25]. Stejná množství proteinového extraktu byla oddělena 12–15 procenty SDS-PAGE a blotována na polyvinyldifluoridové membrány. Bloty byly sondovány primárními protilátkami přes noc při 4 uC před inkubací se sekundární protilátkou v blokovacím pufru po dobu 1 hodiny. Skvrny byly
vyvinuta se zvýšenou chemiluminiscencí (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) a exponována na rentgenový film (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).
Test aktivity MAPK
Buňky byly předem ošetřenyakteosidpo dobu 2 hodin a poté stimulována pomocí RANKL po dobu dalších -30 min. Aktivity MAPK byly stanoveny pomocí imunometrických testovacích souprav, jako je souprava pro test kinázy p-p38 (Assay Designs, Inc., MI, USA), souprava pro enzymový test p-ERK (Assay Designs) a souprava pro sendvičovou ELISA p-SAPK/JNK. (Cell Signaling Technology, MA, USA). Všechny postupy se řídily pokyny výrobce a absorbance byla měřena čtečkou mikrodestiček.
Elektroforetický test posunu mobility (EMSA)
Vazebné reakce DNA-protein byly prováděny po dobu 30 min při pokojové teplotě, s 10–15 mg proteinu ve 20 ml pufru obsahujícím 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poly (dI-dC), 5 procent glycerolu 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 30, 000 cpm oligonukleotidů značených [a-32P] dCTP a Klenowův fragment DNA polymerázy. Vzorky byly separovány na 6% polyakrylamidových gelech, které byly vysušeny a exponovány na rentgenový film (Eastman Kodak Co.) po dobu 12–24 hodin při 270 uC. Sekvence oligonukleotidových primerů specifické pro NF-kB byly 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 a 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
NF-kB luciferázový test
Makrofágy RAW264.7 v 24-jamkových destičkách byly transfekovány 0,8 mg kB-luciferázovým reportérovým vektorem za použití 2 ml Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podle pokynů výrobce. 24 hodin po transfekci byly buňky stimulovány RANKL v přítomnosti a nepřítomnosti akteosidu po dobu 24 hodin. Buňky byly resuspendovány ve 100 ml reportérového lyzačního pufru
(Promega, Madison, WI, USA). Stejná množství proteinových vzorků byla umístěna do 96-jamkových mikrodestičky a smíchána s luciferázovým substrátem. Luminiscence byla měřena pomocí mikrodestičkového luminometru (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Německo). V tomto experimentu byl jako pozitivní kB inhibitor použit propustný NF-kB inhibiční peptid (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA).
Měření cytokinů
Buňky BMM nebo RAW264.7 byly stimulovány RANKL v přítomnosti akteosidu v 24-jamkových kultivačních destičkách. Po 48 hodinách inkubace byly supernatanty kultur shromážděny a hodnoceny metodou ELISA s použitím souprav OptEIATM specifických pro TNF-a, IL-1b- a IL-6- podle pokynů výrobce.
Reverzní transkripčně-polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-PCR)
Exprese mRNA osteoklastických markerů, jako je c-Fos, NFATcl a TNF-a, byla stanovena pomocí RT-PCR v reálném čase. Stručně řečeno, celková RNA byla extrahována z makrofágů pomocí činidla Trizol podle pokynů výrobce (Invitrogen). cDNA byla syntetizována s 1 mg celkové RNA za použití SuperScript reverzní transkriptázy II a primerů (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) byl použit k detekci akumulace produktu PCR během cyklování se systémem detekce sekvence ABI 7500 (Applied Biosystems). Po denaturaci při 95 uC po dobu 10 minut byla provedena PCR
provedeno pomocí čtyřiceti 3-krokových cyklů denaturace při 95 uC po dobu 15 sekund, žíhání při 60 uC po dobu 1 sekundy a extenze při 72 uC po dobu 30 sekund. Všechny PCR reakce byly provedeny alespoň v triplikátech a úrovně exprese byly normalizovány na provozní gen HPRT ve stejné reakci. Tato studie použila stejné sekvence primerů popsané jinde [7].
Měření intracelulárního ROS
Zásobní roztok 29,79-dichlordihydrofluorescein-diacetátu (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Německo) byl připraven v DMSO a skladován při 220 uC v temnu. Stručně řečeno, BMM (106 buněk/ml v 6-jamkových destičkách) byly kultivovány s 50 ng/ml M-CSF po dobu 24 hodin a poté ošetřeny různými koncentracemi (0–10 mM)akteosid2 h před stimulací 100 ng/ml RANKL. Po 1 hodině společné inkubace byly tyto buňky následně inkubovány s 25 mM DCFH-DA po dobu 30 minut. Zelená fluorescence 29,79-dichlorfluoresceinu (DCF) byla zaznamenána při 515 nm (FL 1) pomocí systému FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) a 10,000 události byly počítány na vzorek.
Indukce osteoporózy vyvolané ovariektomií
Pro tuto studii byly použity samice myší ICR (6 týdnů staré). Myši podstoupily falešnou operaci (Sham, n =10) nebo chirurgickou ovariektomii (OVX, n =20) v anestezii. Jeden týden po operaci byly OVX myši náhodně rozděleny do 2 skupin po 10 myších: bilaterální OVX a bilaterální OVX doplněné 200 ml
PBS obsahující 1 mM akteosid orálně (AC skupina). Orální akteosid byl podáván jednou za 3 dny po dobu 8 týdnů po operaci a
stejné množství PBS bylo podáváno skupinám Sham a OVX. Po 1 dni od posledního podání byly myši usmrceny a poté byly analyzovány biochemické parametry v séru a 3-rozměrná kostní struktura.
Stanovení biochemických parametrů séra
Vzorky krve byly odebrány srdeční punkcí a sérum bylo odebráno centrifugací. Vzorky séra byly skladovány při 280 uC pro analýzy biochemických parametrů. Sérové hladiny IL-1b a IL-6 byly odhadnuty pomocí soupravy ELISA, jak je popsáno výše, zatímco aktivita alkalické fosfatázy (ALP) byla stanovena pomocí biochemického kolorimetrického testu, který měří množství p -nitrofenol vyrobený z p-nitrofenolfosfátového substrátu, jak je popsáno jinde [27]. K odhadu biomarkerů tvorby a resorpce kosti byly také stanoveny hladiny OC, vápníku a TRAP5b v séru podle pokynů výrobců.
Analýza struktury kostí a morfometrických parametrů
Stehenní kosti myší (Sham, OVX a AC skupiny) byly vypreparovány a naplněny fyziologickým roztokem pro mechanické testování. Mechanická pevnost femuru byla měřena tak, jak je popsáno jinde [28]. Lomové zatížení bylo zaznamenáno jako maximální síla v newtonech v bodě, kdy došlo ke zlomenině středního dříku pravého femuru. Kromě toho byl světlý femur každého zvířete histomorfometricky analyzován pomocí systému mikropočítačové tomografie (micro-CT) (mikrofokusový rentgenový systém SkyScan 1076, Kontich, Belgie). Stručně řečeno, kosti ve skladu se 4 procenty formaldehydu byly povrchově vysušeny na papírovém ubrousku před zabalením do plastové „přilnavé fólie“ nebo do parafilmu, aby se zabránilo vysychání během skenování. Každá kost obalená plastem byla umístěna do zkumavek z plastu/polystyrenové pěny, které byly namontovány svisle vodorovně v komoře na vzorky skeneru 1076.
mikro-CT zobrazování. Skenování bylo prováděno pomocí 100 kV zdrojového napětí a 140 mA zdrojového proudu s rozlišením 35 mm.
Trojrozměrné modely trabekulárních kostí femuru byly rekonstruovány pomocí SkyScan CT Analyzer verze 1.11. Strukturální parametry, jako je hustota trabekulární kosti (BMD, g/cm3), procentuální objem kosti (objem kosti (BV)/objem tkáně (TV), procenta), tloušťka (Tb.Th, mm), separace (Tb.Sp Poté byly změřeny , mm) a počet (Tb.N, 1/mm).
Test osteogenní diferenciace a mineralizace Buňky kostní dřeně kultivované v {{{{10}}}}jamkových kultivačních destičkách byly ošetřeny DAG (10 nM dexamethason, 50 mM kyselina askorbová a 20 mM b-glycerofosfát) v přítomnost 10 mM akteosidu. Po 2 týdnech diferenciace byly buňky fixovány ledově chladným 70% (obj./obj.) ethanolem po dobu 1 hodiny a barveny 0,2% alizarinovou červení S v destilované vodě po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Poté, co byly buňky odbarveny a vysušeny na vzduchu, byly destičky pro buněčné kultury vyhodnoceny světelnou mikroskopií za použití inverzního mikroskopu (Nikon TS100, Japonsko). Pro kvantifikaci množství červeného barviva bylo barvivo eluováno 10% acetylpyridiniumchloridem třepáním po dobu 20 minut a absorbance byla měřena při 560 nm. Množství vápníku uloženého v buněčných vrstvách bylo také měřeno pomocí soupravy Calcium C (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonsko) podle pokynů výrobce. Kromě toho byla pomocí RT-PCR v reálném čase stanovena exprese kostně specifických mRNA markerů, jako je transkripční faktor související s runt{20}} (Runx2), osterix, kostní sialoprotein (BSP) a OC. Oligonukleotidové primery těchto markerů byly navrženy s velikostí produktu menší než 200 bp pomocí Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems), jak je popsáno jinde [27].
cistanche akteosid podporuje tvorbu kostí
Výsledek
Akteosid inhibuje tvorbu osteoklastů makrofágy způsobem závislým na dávce
Pro ověření účinku akteosidu na diferenciaci BMM na osteoklasty byly buňky kultivovány s různými koncentracemi (0–20 mM) akteosidu po dobu 7 dnů v přítomnosti 50 ng/ml M-CSF a 100 ng/ml RANKL. Akteosid snižoval počet osteoklastů způsobem závislým na dávce. Když byly buňky předem ošetřeny 10 mM akteosidem po dobu 2 hodin, počet osteoklastů se snížil o 43 procent ve srovnání s buňkami doplněnými M-CSF a RANKL (obr. 1A). Obr. 1B ukazuje diferenciaci osteoklastů zprostředkovanou RANKL a její inhibici kombinovanou léčbou s akteosidem. V souladu s tímto výsledkem předběžné ošetření akteosidy snížilo RANKL-stimulovanou diferenciaci buněk RAW264.7 a tvorbu osteoklastů (obr. 1C a D). Když byl antiosteoklastický potenciál akteosidu na BMM porovnán s antiosteoklastickým potenciálem několika fenolických sloučenin ve stejné koncentraci (10 mM), luteolin vykazoval nejvyšší aktivitu (obr. 2A). Avšak samotný luteolin, kvercetin nebo apigenin snižovaly životaschopnost buněk (obr. 2B). Všechny sloučeniny inhibovaly osteoklastickou diferenciaci makrofágy RAW264.7 s následujícími relativními aktivitami: luteolin. kvercetin=apigenin .
Akteosid Cistanche Inhibuje Osteoklast