ČÁST 1 Příprava a hodnocení transdermálního podávání fenylethanoidových glykosidů Cistanche Tubulosa na bázi mikroemulze
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
JIANHUA YANG1*, HUANHUAN XU1-3* a kol.
Abstraktní.
Primárním cílem této studie bylo vyvinout novou mikroemulzní (ME) formulaci k dodánífenylethanoidní glykosid z cistanche(PG) pro použití v zesvětlovačích pokožky a opalovacích krémech. Olejová fáze byla vybrána na základě rozpustnosti léčiva, zatímco povrchově aktivní látka a kosurfaktant byly protříděny a vybrány na základě jejich solubilizační kapacity a účinnosti, se kterou tvořily ME. Pseudoternární fázové diagramy byly zkonstruovány pro vyhodnocení ME oblastí a jako vehikula bylo vybráno pět formulací ME olej ve vodě. Byly provedeny in vitro experimenty prostupu kůží za účelem optimalizace ME formulace a vyhodnocení její propustnosti ve srovnání s fyziologickým roztokem. Fyzikálně-chemické vlastnosti optimalizovaného ME a permeační schopnost PG(fenylethanoidní glykosid z cistanche) dodané tímto MŽP byly také šetřeny. Optimalizovaná ME formulace se skládala z isopropylmyristátu (7 procent, hmotn./hmotn.), Cremorphor EL (21 procent hmotn./hmotn.), propylenglykolu (7 procent, hmotn./hmotn.) a vody (65 procent hmotn./hmotn.). Kumulativní množství PG(fenylethanoidní glykosid z cistanche) který pronikl přes vyříznutou myší kůži, když byl nesen ME, byl ~1,68krát větší, než když byl PG nesen pouze fyziologickým roztokem. Kumulativní množství PG v mikroemulzi (4149,650±37,3 µg·cm-2 ) bylo významně vyšší než množství PG ve fyziologickém roztoku (2288,63±20,9 µg· cm-2). Kromě toho koeficient propustnosti ukázal, že optimalizovaná mikroemulze byla účinnějším nosičem pro transdermální podávání PG než kontrolní roztok (8,87±0,49 cm/hx10-3 vs. 5,41±0,12 cm/hx10-3). Celkově vzato byla permeační schopnost PG neseného ME významně zvýšena ve srovnání s fyziologickým roztokem.
Úvod
Herba cistanche,tonizující bylina běžně rozšířená v pouštních oblastech se často používá v tradiční čínské medicíně. K dnešnímu dni bylo provedeno mnoho studií, které zkoumaly jeho biofarmaceutické vlastnosti, včetně zlepšení paměti, sexuální potence, pohlcování volných radikálů a aktivity proti stárnutí (1). Hlavní složkou H. cistanche jefenylethanoidní glykosid (PG). Předchozí studie odhalily, že PG inhibuje aktivitu tyrosinázy, enzymu omezujícího rychlost syntézy melaninu v lidském těle (2). Kromě toho PG(fenylethanoidní glykosid z cistanche) bylo popsáno, že je zodpovědný za vychytávání 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylových radikálů (3) a chrání keratinocyty před ultrafialovým (UV) zářením. Proto může mít tato složka potenciál při depigmentaci kůže. Topická léčba se běžně používá v kosmetických oborech, přičemž léčivo je podáváno přímo na povrch těla (4). Mikroemulze (ME) jsou novým systémem dodávání léčiv, který se běžně skládá z oleje, povrchově aktivní látky, kosurfaktantu a vodné fáze (5) a bylo popsáno, že zlepšují rychlost a absorpci lipofilních léčiv (6). Navíc se vzhledem k jeho uspokojivé rozpustnosti, nízké dráždivosti kůže a vysoké permeabilitě očekává jeho použití při topickém dodávání léčiv (7,8). Pokud je nám známo, bylo provedeno několik studií, kde byl PG podáván topickou medikací pomocí mikroemulze. V této studii byl zaveden systém dodávání nanoemulze typu olej ve vodě (O/W) pro transdermální podávání a do nanoemulze byl začleněn PG (9,10). Mezitím byla provedena příprava a charakterizace nanoemulze na bázi PG zkoumáním transdermálního uvolňování in vitro.
Materiály a metody Reagencie.
Cremorphor EL a isopropylmyristát (IPM) byly zakoupeny od Sigma Aldrich; Merck Millipore (Darmstadt, Německo). Ethanol, kyselina olejová (OA) a Tween-80 byly zakoupeny od společnosti Guangcheng Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, Čína). Ethyloleát byl zakoupen od Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Všechny použité chemikálie a rozpouštědla byly analytické čistoty. Příprava a vyhodnocení transdermálního podání fenylethanoidových glykosidů Cistanche tubulosa JIANHUA YANG1*, HUAN HUAN XU1-3*, SHANSHAN WU2, BOWIE JU2, DANDAN ZHU2, YAO YAN1, MEI WANG2 a JUMPING na bázi mikroemulze } Oddělení farmacie, První přidružená nemocnice; 2 Ústav přírodních léčiv, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830011; 3 Department of Pharmacy, Kanghua Hospital, Dongguan, Guangdong 523003, PR China Obdrženo 2. prosince 2015; Přijato 29. listopadu 2016, DOI: 10.3892/MMR.2017.6147 Korespondence pro: Dr. Junping Hu, Ústav přírodních léčiv, College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, 393 Xinyi Road, Urumqi, Xinjiang 830011: PR5 Čína @yeah.net * Přispěl rovným dílem Klíčová slova: fenylethanoidní glykosid, mikroemulze, transdermální podání, zesvětlovač pokožky, opalovací krém yang et al: ME-BASED PG PRO KOSMETICKÉ APLIKACE 1110 Příprava PhGs. PhG(fenylethanoidní glykosid z cistanche) byl připraven tak, jak je rutinně popsáno (11).
Sušené na vzduchuC. tubulosabyl napájen a extrahován perkolací 80 procent EtOH. Perkolát se odpaří pod tlakem a zbytková kapalina se odfiltruje. Filtrát byl zakoncentrován a chromatografován na koloně s makroporézní pryskyřicí SP-825 s použitím 0, 30, 50, 70 a 90 procent EtOH ve vodě jako eluentů. Eluenty 30-50 procent EtOH byly zakoncentrovány a vysušeny, aby se získala frakce bohatá na PhG. UV spektrofotometrie ukázala obsah PhG(fenylethanoidní glykosid z cistanche) bylo 87,6 procenta. Screening olejů, povrchově aktivních látek a kosurfaktantů pro ME. Byly provedeny testy rozpustnosti, aby se vybraly vhodné složky pro přípravu ME formulace s vysokou kapacitou nanášení léčiva. V tomto procesu bylo nadbytečné množství PG přidáno do 4 ml každého z následujících činidel: IPM, tekutý parafín, OA, Cremophor EL, Tween‑80, absolutní ethanol, propylenglykol, glycerin a PEG400 , resp. Poté byla výsledná směs recipročně třepána při 37 °C po dobu 72 hodin, následovala centrifugace při 12 830 xg po dobu 10 minut. Následně byla peleta resuspendována v methanolu a PG byl stanoven pomocí UV spektrofotometrie při 333 nm. Jako slepá kontrola sloužily vhodné zředěné roztoky olejů, povrchově aktivních látek a korozpouštědel v methanolu. Konstrukce fázového diagramu. Pro získání koncentračního rozsahu složek pro existující hranici mikroemulze byly zkonstruovány pseudo ternární fázové diagramy pomocí metody vodní titrace, jak bylo popsáno dříve (12). Byly připraveny třífázové diagramy s hmotnostními poměry povrchově aktivní látky ku kosurfaktantu 1:3, 1:1 a 3:1. Olejová fáze a směs povrchově aktivních látek byly poté smíchány v hmotnostních poměrech 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 a 9:1. . Směs oleje a surfaktantu byla homogenně smíchána a byla po kapkách zředěna purifikovanou vodou za magnetického míchání (300 ot./min) při teplotě místnosti, dokud nebyl získán transparentní ME. Koncentrace složek byla zaznamenána, aby se doplnil pseudo ternární fázový diagram. Na základě těchto diagramů byly vybrány vhodné koncentrace materiálů pro přípravu ME na bázi PG. Příprava ME a vodného roztoku PG. Celkem 5 ME (ME{41}}) bylo vybráno podle fázových diagramů s hmotnostním poměrem povrchově aktivní látka:kosurfaktant 3:1 (tabulka I). Mikroemulzní systémy byly připraveny smícháním oleje se směsí povrchově aktivní látky a kosurfaktantu a voda byla přesně přidána do olejových fází za magnetického míchání (300 ot./min) při 37˚C. Systémy byly ekvilibrovány za použití jemného magnetického míchání po dobu 30 minut s následným rozpuštěním příslušného množství PG za použití ultrazvuku. Vodný roztok byl připraven se stejným obsahem PG rozpuštěným v čištěné vodě. Charakterizace mikroemulze. Průměrná velikost kapiček a index polydisperzity ME byly hodnoceny fotonovou korelační spektroskopií (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, UK). Všechny vzorky byly zředěny vodou v poměru 1:5 a byly filtrovány přes 0,22 um filtr. Test byl proveden v termostatické komoře při 25 °C v trojím provedení. Morfologie PG mikroemulzí byla sledována pomocí transmisní elektronové mikroskopie (JEM-100CXII; JEOL Ltd., Tokio, Japonsko). Stručně řečeno, jedna kapka zředěného vzorku byla nanesena na filmem potaženou měděnou mřížku, poté následovalo obarvení jednou kapkou 2% vodného roztoku kyseliny fosfowolframové.
Průměrné průměry kapiček mikroemulzí byly stanoveny přístrojem pro fotonovou korelační spektroskopii (BI{{0}}SM; Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY, USA) při teplotě místnosti. Viskozita ME vozidel byla měřena při 25˚C pomocí digitálního viskozimetru NDJ-8S (Shanghai Precision and Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China) s č. 1 rotor nastavený na 60 ot./min. stanovení pH. Hodnoty pH ME byly stanoveny při 25 °C pomocí digitálního acidimetru Phs‑3C (Shanghai REX Instruments Factory, Shanghai, Čína). Indexy lomu byly měřeny termostatickým Abbe refraktometrem (Optical Instrument Factory, Shanghai, Čína). Příprava kožních tkání. Samci myší Kunming o hmotnosti 20 g byli zakoupeni od Experimental Animal Center of Xinjiang Medical University (Xinjiang, Čína). 10 myší (ve věku 6 týdnů) bylo podrobeno adaptivnímu krmení po dobu 1 týdne v cyklu 12 h světlo/12 h tma, při pokojové teplotě (24±2˚C) s vlhkostí 50±15 procent. Všechna zvířata měla přístup ke standardní stravě a vodě. Vlasy byly odstraněny elektrickým zastřihovačem. Po konečné anestezii chloralhydrátem (10 procent) subkutánní injekcí byly z břišní oblasti vyříznuty kožní tkáně a odstraněn podkožní tuk a pojivová tkáň. Tkáně byly umístěny přes noc do chladničky při 4 °C. Protokoly studie byly schváleny etickou komisí lékařské univerzity Xinjiang (Xinjiang, Čína). Studie permeace in vitro. Permeační experimenty byly prováděny tak, jak bylo popsáno dříve (12). Vyříznutá kůže byla upnuta mezi dárcovskou a receptorovou komoru vertikální difúzní cely s účinnou difúzní plochou 2,8 cm2. Receptorová komora byla naplněna čerstvým, normálním fyziologickým roztokem. Difuzní cela byla udržována na 37 °C pomocí recirkulační vodní lázně a roztok v receptorových komorách byl nepřetržitě míchán při 200 ot./min. Poté byl testovaný přípravek (1,0 ml) opatrně umístěn do donorové komory. Následně byly 3 ml roztoku v receptorové komoře odebrány a nahrazeny stejným objemem čerstvého normálního fyziologického roztoku v předem stanovených intervalech (0, 2, 4, 6, 8, 10 a 24 h). Vzorek získaný z receptorové komory byl použit ke stanovení PG(fenylethanoidní glykosid z cistanche)úrovně pomocí UV spektroskopie při vlnové délce 333 nm. Kumulativní množství PG, které proniklo přes vyříznutou myší kůži, bylo vypočteno podle následujícího vzorce:
Kde Qn bylo akumulované množství v daném čase t, Cn je koncentrace léčiva v přijímacím roztoku v každém čase odběru vzorků, Ci je koncentrace léčiva ve vzorku, S je účinná difúzní plocha (S{{0 }}.8 cm2) a V0 a Vi jsou objemy roztoku v nádobě a vzorku. Kumulativní množství (Qn) PG(fenylethanoidní glykosid z cistanche)permeovaná byla vynesena do grafu jako funkce času (t) pro každou formulaci. Rychlost permeace PG v ustáleném stavu (Jss, ug/cm-2/h-1) myší kůží byla vypočtena ze směrnice lineární části grafů Qnversus času. Koeficient propustnosti (Kp, cm/h) byl vypočten podle následujícího vzorce:
Kde Kp je koeficient permeability, Jss je eflux vypočítaný v ustáleném stavu a C0 představuje koncentraci léčiva, která zůstala konstantní ve vehikulu. Studie retence kůže. Následující části podrobně popisují srovnání ex vivo permeačního chování, kumulativního množství, permeační rychlosti, koeficientu propustnosti a charakteristik retence pokožky mezi optimalizovanými ME formulacemi (obsah PG, 2 procenta, w/w) a vodným roztokem. Na konci permeačního experimentu byla pomocí homogenizační metody stanovena hladina zbytkového léčiva v kůži. Po promytí normálním fyziologickým roztokem byla kůže nařezána na malé části a umístěna do skleněné zkumavky obsahující 3 ml methanolu v ledové lázni. Vzorek byl homogenizován rychlostí 12000 ot./min. rpm po dobu 2 minut a poté centrifugujte při 12 830 xg horizontálně po dobu 30 minut při 25 °C. Supernatant se nechal projít přes mikroporézní filtr (0,45 um) a PG(fenylethanoidní glykosid z cistanche)hladiny v supernatantu byly stanoveny UV spektroskopií při vlnové délce 333 nm. Studie stability. Fyzikální stabilita ME s obsahem PG byla zkoumána pomocí čirosti, analýzy velikosti částic a separace fází, která byla pozorována při 2‑8˚C a při pokojové teplotě po dobu 3 měsíců. Centrifugace byla provedena při 12 830 xg po dobu 30 minut při 25 °C, aby se vyhodnotila fyzikální stabilita ME. Fázová separace a koncentrace PG byly zkoumány měsíčně za účelem posouzení optimální skladovací teploty. Chemická stabilita byla hodnocena na formulacích naplněných léčivem, skladovaných při 2‑8˚C a při pokojové teplotě, s obsahem PG stanoveným UV spektrofotometrií při 333 nm. Test citlivosti kůže. Testy kožní citlivosti byly provedeny na králících (o hmotnosti 2,02,5 kg), aby se vyhodnotil dráždivý potenciál místní aplikace vyvinuté formulace, jak bylo popsáno dříve (13). Devět holandských králíků (ve věku 16 týdnů; vážící 2.0-2,5 kg; 5 samců a 4 samice) bylo získáno z Experimental Animal Center of Xinjiang Medical University. Zvířata byla podrobena adaptivnímu krmení po dobu 1 týdne v cyklu 12 h světlo/12 h tma, při teplotě místnosti (24 ± 2 °C), s vlhkostí 50 ± 15 procent. Všechna zvířata měla přístup ke standardní stravě a vodě. K oběti byla použita vzduchová embolie. Protokoly použité v této studii byly schváleny etickou komisí lékařské univerzity Xinjiang (Xinjiang, Čína). Chloupky na zádech byly odstraněny ~24 hodin před podáním ME formulací. Zvířata byla rozdělena do následujících skupin: Skupina s optimalizovaným ME (n=3) s topickým podáváním optimalizovaného ME obsahujícího 2 procenta (hmot.) PG; skupina s PG fyziologickým roztokem (n=3), s místním podáváním fyziologického roztoku obsahujícího 2 procenta (hmotn./hmotn.) PG; a kontrolní skupina s fyziologickým roztokem (n=3), podléhající místnímu podávání normálního fyziologického roztoku. Aplikace byla prováděna dvakrát denně po dobu 5 dnů. Zvířata byla pozorována na jakékoli známky svědění nebo změn na kůži, včetně erytému, papuly, šupinatosti a suchosti (14). Po vysazení léku pokračovalo sledování jednorázového nebo vícenásobného podání po dobu 3 dnů. Skóre podráždění testované oblasti bylo hodnoceno posouzením rozsahu erytému a edému podle následujících kritérií: 1, žádná viditelná reakce; 2, mírná reakce; 3, střední reakce a 4, těžká reakce (15,16). Nakonec bylo vypočteno celkové skóre podráždění pro každý stav pomocí následující rovnice:
Statistická analýza. Data jsou prezentována jako průměr ± standardní odchylka. Analýza dat byla provedena pomocí jednosměrné analýzy rozptylu následované testem nejméně významného rozdílu. Data byla analyzována pomocí softwaru SPSS verze 19.0 (IBM SPSS, Armonk, NY, USA). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Výsledky a diskuse
Screening olejů, povrchově aktivních látek a pomocných povrchově aktivních látek pro ME. PG(fenylethanoidní glykosid z cistanche)byl téměř nerozpustný v kapalném parafinu a kyselině olejové, ale mírná rozpustnost byla pozorována v IPM (tabulka II). IPM zvyšuje koeficient difúze v kůži a vede ke zvýšení koeficientu permeace (17,18). Kromě toho je IPM běžně vybírán pro přípravu ME díky svým dobře známým vlastnostem zvyšujícím permeaci a biokompatibilitě. Výběr povrchově aktivní látky je rozhodující pro úspěšnou formulaci ME, protože přispívá ke snížení mezifázového napětí vytvořením filmu na rozhraní oleje a vody (19). V této studii vykazoval PG vyšší rozpustnost v Cremophoru-EL (40,193 mg/ml; tabulka II) ve srovnání s Tween-80 (28,051 mg/ml; tabulka II). Proto byl CremophorEL vybrán pro použití v dalších studiích kvůli svému profilu rozpustnosti a nízké úrovni toxicity jako neiontové povrchově aktivní látky. Kromě toho jeho vodný roztok prokázal dobrou rozpustnost PG. Nejvyšší rozpustnost PG mezi spolupůsobícími povrchově aktivními látkami byla pozorována v propylenglykolu (48,714 mg/ml; tabulka II). Kromě toho má propylenglykol schopnost tvořit ME s IPM a CremophorEL. Dohromady byly IPM, CremophorEL a propylenglykol použity jako olejová fáze, povrchově aktivní látka a kosurfaktant, v daném pořadí, pro formulaci ME s obsahem PG. Konstrukce pseudoternárních fázových diagramů. V této studii byly sestrojeny fázové diagramy pro výběr koncentračního rozsahu složek pro mikroemulze a označené oblasti označují čistou oblast O/WME (obr. 1). Již dříve byl popsán úzký vztah mezi hydratačním účinkem stratum corneum a dermální permeací (20) a termodynamická aktivita léčiv u ME byla významnou hnací silou uvolňování a pronikání léčiv do kůže (20,21). ). Termodynamická aktivita léčiv v ME s nižším obsahem směsi povrchově aktivních látek byla prokázána jako důležitá hnací síla pro uvolňování a penetraci léčiva do kůže (22,23).
The decreased concentration of surfactant in dispersed systems may also increase the rate of drug release and its permeation in the skin (24,25). Thus, the water content ranged between 50 and 70%, while that of the surfactant and cosurfactant ranged between 20 and 45%. The microemulsion domain was determined by visual inspection for clarity and fluidity. The rest of the region in the phase diagrams represents turbid and conventional emulsions based on visual observation (Fig. 1). No liquid crystalline structure was observed using the cross polarizer. The area of the O/W ME region was expanded following the increase of the Km value (Fig. 1). These findings were consistent with previous studies, which demonstrated that a higher level of surfactant reduces interfacial tension of the colloidal solution more effectively, thereby improving the fluidity of the interface and increasing the entropy of the system (21,24). Thus, it is reasonable to speculate that the effect of CremophorEL on ME regions depends on the other ME components, especially the cosurfactant. The combination of short to medium carbon chain length alcohols, including propylene glycol, with single-chain surfactants, may lower interfacial tension due to increased fluidity at the interface. Additionally, medium carbon chain length alcohols may induce elevation of miscibility of the aqueous and oily phases due to the partitioning behavior between the two phases. Finally, in the presence of a Km ratio of 3:1, the ratio of the surfactant mixture to oil was 1:9 or 2:8. MEs prepared with a ratio of surfactant mixture to oil >2:8 byly zakalené a nestabilní (obr. 2).
Konečná složení ME1‑5 jsou uvedena v tabulce I. Příprava a charakterizace ME. Fyzikální vlastnosti ME1-5 jsou uvedeny v tabulce III. Disperzní systémy byly makroskopicky identické, homogenní a transparentní, bez jakýchkoliv sraženin. Střední velikosti kapiček těchto ME se pohybovaly mezi 30,56 a 79,21 nm (obr. 3; tabulka III), s hodnotami indexu polydisperzity v rozmezí 0,187 a 0,321 (Tabulka III). To indikovalo uniformní ME s úzkou distribucí velikosti. Kromě toho se velikost kapiček zvětšovala úměrně s obsahem oleje, ale zmenšovala se s obsahem směsi povrchově aktivních látek. Tento jev lze přičíst expanzi ME olejového jádra a vysoké koncentraci povrchově aktivní látky, která silně snižuje mezifázové napětí olej-voda, aby se zmenšila velikost kapiček. Kromě toho se zvýšila viskozita ME v důsledku zvýšené hladiny povrchově aktivní látky a snížení vody. Hodnoty pH všech ME spadaly do vhodného rozsahu 5.{15}}.5 (tabulka III), a tak byly kompatibilní s hodnotami kožních tkání. Pokud jde o fyzikální stabilitu, nebyla u žádného z testovaných ME pozorována separace fází, lámání nebo precipitace léčiva, což ukazuje, že ME mají uspokojivou termodynamickou stabilitu proti centrifugaci. Test rozpustnosti barviva odhalil, že ve vodě rozpustné barvivo (methyloranž) se rovnoměrně distribuuje v celém systému ME, což znamená, že vytvořený ME byl typu O/W (data nejsou uvedena). Mikrofotografie odhalily samostatné jednotlivé kapky ME5 se sférickým obrysem (obr. 4). Exvivo studie permeace kůží. Permeační profily všech testovaných vehikul sledovaly kinetiku uvolňování nultého řádu (26,27) a ME5 poskytl nejvyšší transdermální tok PG (86,795±0,23 µg/cm{{28 }} /h-1; obr. 5; tabulka III). V této studii byly stanoveny účinky obsahu oleje a směsi povrchově aktivních látek na permeaci PG pokožkou. Výsledky ukázaly, že povrchově aktivní látky zvyšují prostup kůží zvýšením fluidity membrány, solubilizací léčiva a extrakcí lipidu ze stratum corneum. Rychlost permeace ME5 (86,795±00,23µg/cm-2/h-1) byla významně zvýšena ve srovnání s rychlostmi permeace ME1 (69,57±{ {48}},78, P=0.0094), ME2 (44,326±0,84, P{{50}} .0052), ME3 (79,859±0,12, P=0,039) a ME4 (58,332±0,39 µg/cm-2/h-1 , P=0.0063, Obr. 5; Tabulka III) To bylo v souladu s výsledky předchozí studie, ve které se termodynamická aktivita nákladu ME drog může snižovat se zvyšováním hladin povrchově aktivních látek (12,28 ). Viskozita ME5 (30,43±0,12 mPa.s) byla nižší ve srovnání s ostatními ME1 (80,51±0,87 mPa.s, P=0,0076), ME2 (47,52±0,54 mPa.s, P{{88 }}.0089), ME3 (60,49±1,34 mPa.s, P=0,0094) a ME4 (43,27±0,21 mPa.s, P=0,0059).
