Cistanche: Echinacosid potlačuje růst buněk adenokarcinomu pankreatu indukcí apoptózy prostřednictvím mitogenem aktivované proteinkinázové dráhy

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG a XINFENG LI

Abstraktní.

Klinické využití přírodních produktů pocházejících z tradiční čínské medicíny si získalo pozornost u chemoterapeutik proti rakovině.Echinakosid(ECH), jeden z fenylethanoidů, izolovaný ze stonkůCistanche(čínský bylinný lék) má tkáňovou ochranu a antiapoptotické účinky na centrální nervový systém. Zůstává však do značné míry nepolapitelné, zda ECH má tumor-supresivní aktivitu. V této studii bylo prokázáno, že ECH může výrazně inhibovat proliferaci buněk adenokarcinomu pankreatu indukcí produkce reaktivních forem kyslíku a narušení mitochondriálního membránového potenciálu, a tím spuštěním apoptózy. Dále bylo objasněno, že ECH(Echinakosid)potlačuje růst nádorových buněk prostřednictvím modulace aktivity MAPK. Na závěr tato studie odhaluje novou funkci ECH (Echinakosid) při prevenci rozvoje rakoviny a znamená, že použití ECH by mohlo být potenciální chemoterapeutickou strategií pro rakovinu.

Úvod

Dráha tumor supresoru p53 prostřednictvím indukce tumor supresoru, ARF, zmírňuje onkogenní E3-ligázou myší double minute (MDM)2- zprostředkovanou degradaci p53 (3). Jedná se o autoregulovaný, sebeochranný mechanismus, který brání buňkám před maligní transformací. Zejména p53 může potlačit aktivitu Myc transkripční aktivací, například miR-145, který cílíMoje CmRNA pro umlčení translace (4,5), čímž se vytvoří regulační smyčka negativní zpětné vazby.

Nejpřímější a nejúčinnější strategií léčby rakoviny je zabíjení rakovinných buněk. Ukázalo se, že běžně používaná protirakovinná léčiva, jako je cisplatina (6), aktinomycin D (7) a adriamycin (8), inhibují růst nádoru podporou apoptózy. V poslední době přibývá důkazů, že řada přírodních produktů a derivátů z rostlin, zejména z léčivých rostlin používaných v tradiční čínské medicíně (TCM), vykazuje tumor-supresivní funkci indukcí apoptózy rakovinných buněk a má potenciál pro klinické použití. v terapii rakoviny (9). Například přírodní antrachinon emodin je izolován z mnoha typů rakovinných buněk (10,11). Camptothecin, odvozený z čínského „šťastného stromu“,Camptotheca bystrý, je cenným přírodním produktem, který inhibuje ligaci DNA po zlomech vláken zprostředkovaných topo I (12). V další retrospektivní populační kohortové studii s celkem 729 pacientkami s pokročilým karcinomem prsu bylo navrženo, že terapie TCM může přispět k léčbě rakoviny. Z této kohorty bylo 115 pacientů uživateli TCM, zatímco 614 pacientů TCM neužívalo. Multivariační analýza prokázala, že ve srovnání s neuživateli bylo užívání TCM spojeno s významně sníženým rizikem mortality ze všech příčin (13). Všechna výše uvedená zjištění naznačovala, že TCM je důležitou doplňkovou a alternativní medicínou, kterou lze využít při léčbě rakoviny.

myši s akutním poškozením plic (16,17). Také ECH(Echinakosid)bylo prokázáno, že má ochranné účinky na nervovou tkáň a zlepšuje poruchy chování u myších modelů Parkinsonovy choroby (18). Zejména bylo zjištěno, že ECH podporuje buněčnou proliferaci a inhibuje apoptózu v myších střevních epiteliálních buňkách MODE-K (19). Potenciální roli ECH v prevenci rakoviny se však dosud věnovala menší pozornost.

V této studii bylo zkoumáno, zda léčba ECH ovlivňuje růst a proliferaci nádorových buněk a zda ECH(Echinakosid)indukuje apoptózu, zvyšuje produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) a snižuje mitochondriální membránový potenciál (MMP) a následně potlačuje růst nádorových buněk. Kromě toho se tato studie zaměřila na identifikaci molekulárních mechanismů odpovědných za inhibici růstu buněk zprostředkovanou ECH.

Materiály a metody

Buňka čára, činidlo, a protilátky.Buňky pankreatického adenokarcinomu SW1990 (ATCC, Manassas, VA, USA) byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra, 50 U/ml penicilinu a 0,1 mg/ml streptomycinu při 37 °C 5 procent CO2 zvlhčená atmosféra. ECH(Echinakosid)byl zakoupen od Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, Čína). Protilátky proti AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 a GAPDH byly zakoupeny od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); anti-Bax a anti-Bcl-2 byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA); a anti-Caspase{10}} byla zakoupena od společnosti Abcam (Shanghai, Čína).

Buňka životaschopnosttest. K posouzení rychlosti růstu nádorových buněk byla použita sada Cell Counting {{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) podle pokynů výrobce. Buněčné suspenze byly nasazeny v množství 5000 buněk na jamku s ošetřením ECH po dobu 0, 12, 24, 48 nebo 72 hodin na 96 -jamkové kultivační destičky. Inhibice růstu buněk byla stanovena přidáním činidla WST-8 ze sady CCK‑8 v konečné koncentraci 10 procent do každé jamky a absorbance vzorků byla měřena při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Multikan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst 33342 barvení.Buňky (60% konfluence) byly ošetřeny Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Čína) v konečné koncentraci 1µg/ml, inkubováno v inkubátoru při 37 °C po dobu 15 minut, dvakrát promyto fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, fixováno ve 4% paraformaldehydu po dobu 30 minut při pokojové teplotě a připevněno na sklíčka. Morfologické změny buněčných jader byly pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem (Olympus BX51, Melville, NY, USA). Normální jádra byla kulatá a zbarvená světle modře, zatímco apoptotická jádra byla scvrklá a zbarvená jasně modře.

Aktivováno fluorescencí buňka třídění (FACS) analýzy.Pro hodnocení apoptózy byla použita souprava fluorescein isothiokyanát (FITC)-Annexin V Apoptosis Detection kit (BD Biosciences, Shanghai, Čína) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, 5x1{4}}4 buňky byly promyty ledově chladným PBS, resuspendovány v 0,1 ml vazebného pufru (Beyotime Institute of Biotechnology) a obarveny 10 ml FITC-konjugovaného Annexinu V (10 mg/ml) a 10 ml propidiumjodidu (PI) (50 mg/ml). Po inkubaci po dobu 15 minut při teplotě místnosti ve tmě a přidání 400 ml vazebného pufru byly buňky analyzovány průtokovým cytometrem (C6; BD Biosciences, Shanghai, Čína).

Měření z reaktivní kyslík druh (ROS).K vyhodnocení produkce ROS byla použita souprava Reactive Oxygen Species Assay kit (Vigorous Biotechnology, Beijing, Čína) podle pokynů výrobce. Stručně, buňky (80 procent konfluence) byly sklizeny a promyty PBS před barvením roztokem dihydroethidia (DHE) (Beyotime Institute of Biotechnology). Buňky byly poté analyzovány průtokovou cytometrickou analýzou.

Měření z mitochondriální membrána potenciál (MMP).

K detekci změn v MMP byla použita testovací souprava tetramethylrhodamin methyl ester (TMRM) Assay kit (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA). Stručně, buňky (80 procent konfluence) byly sklizeny, promyty PBS a barveny TMRM po dobu 15-20 minut v inkubátoru při 37 °C. Buňky byly poté jednou promyty PBS a podrobeny analýze průtokovou cytometrií.

Imunoblottinganalýzy. Buňky (80 procent konfluence) byly sklizeny a lyžovány v RIPA pufru (Jrdun Biotechnology) sestávajícím z 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 procento NP-40, 1 procento sodné soli deoxycholové kyseliny a 0,1 procenta SDS a čerstvě přidané inhibitory proteazomu. Stejná množství čirého buněčného lyzátu byla použita pro imunoblotovací analýzu, jak bylo popsáno dříve (20).

Statistický analýza.Kvantitativní data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka. Statistické rozdíly byly vyhodnoceny nepárovým Studentovým t-testem pomocí statistického softwaru SPSS 15.0. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Výsledek

ECH (Echinakosid)potlačuje nádor buňkarůst. Ačkoli bylo hlášeno, že ECH(Echinakosid)vykazuje ochrannou roli inhibicí apoptózy a zánětlivých signálů v somatických buňkách, jako jsou neuronální a střevní epiteliální buňky (16-19), zůstává nepolapitelné, zda ECH řídí růst a proliferaci rakovinných buněk. Aby se to otestovalo, byl proveden test přežití buněk ošetřením buněk SW1990, odvozených z adenokarcinomu pankreatu stupně II, titrovanými dávkami ECH, jak je znázorněno na obr. 1. Zejména bylo prokázáno, že ECH významně zpomaluje proliferaci nádorových buněk v dávce -závislým způsobem během 5-denního kultivačního období (obr. 1).ECH spouštěčeapoptóza. Vzhledem k tomu, že ztráta apoptózy je jedním z hlavních příčinných mechanismů, které jsou základem nekontrolované proliferace buněk rakoviny slinivky břišní (21), tato studie provedla soubor experimentů, aby zjistila, zda ECH spouští apoptózu. Za prvé, barvením jader nádorových buněk Hoechst 33342 bylo prokázáno, že ECH vede k apoptóze způsobem závislým na dávce (obr. 2A). Kromě toho byly provedeny analýzy FACS za použití barvení Annexinem V/PI, aby se dále potvrdil apoptotický účinek ty ECH (obr. 2B). Průměrné procento apoptotických buněk bylo 1,1 procenta za normálních kultivačních podmínek, zatímco toto procento se významně zvýšilo na 10,6, 21,4 a 51,3 procenta v reakci na léčbu ECH v závislosti na dávce (obr. 2C). Tyto výsledky spolu s testem buněčné životaschopnosti ukázaným na obr. 1 ukazují, že léčba ECH potlačuje proliferaci nádorových buněk spuštěním apoptózy.

generovat ethidium, které interkaluje s DNA, bylo v této studii použito k hodnocení produkce ROS. Bylo zjištěno, že stejně jako ostatní protinádorová léčiva také ECH stimuluje produkci ROS v závislosti na dávce, jak ukazuje zvýšená intenzita fluorescence po léčbě ECH (obr. 3).

ECH (Echinakosid)snižuje MMP.Bylo prokázáno, že mitochondriální dysfunkce se podílí na indukci apoptózy. Bylo prokázáno, že otevření přechodového póru mitochondriální permeability indukuje depolarizaci transmembránového potenciálu a uvolnění proapoptotických faktorů (23). Proto bylo testováno, zda ECH může vyvolat ztrátu MMP v nádorových buňkách provedením testu TMRM, což je dobře zavedený přístup, protože intenzita fluorescence TMRM je úměrná membránovému potenciálu. Bylo prokázáno, že léčba ECH významně snižuje MMP v závislosti na dávce (obr. 4).ECH řízení nádor buňka růst přes mitogenem aktivovaný proteinmolekulární základ smrti nádorových buněk zprostředkované ECH, byla zkoumána aktivita několika životně důležitých signálních drah, jako jsou MAPK a AKT (24,25), které kontrolují přežití a smrt buněk. MAPK jsou evolučně konzervované, prolinem řízené Ser/Thr protein kinázy, včetně extracelulárních signálem regulovaných kináz (ERK), c-Jun NH{6}}terminální kinázy (JNK) a členů rodiny p38, které jsou aktivovány prostřednictvím tří- tier kinázové signalizační kaskády (26,27). V této studii byla hodnocena exprese MAPK a AKT, stejně jako jejich aktivovaných fosforylovaných forem, a bylo zjištěno, že ECH výrazně potlačuje aktivitu JNK a ERK1/2, ale zvyšuje aktivitu p38 (obr. 5). Zejména bylo prokázáno, že aktivita AKT, která je také kriticky důležitá pro buněčnou proliferaci, není ovlivněna léčbou ECH (obr. 5). Kromě toho se ukázalo, že léčba ECH zvyšuje expresi Bax a kaspázy-3 a zároveň snižuje expresi Bcl{17}} (obr. 5), což je v souladu s obr. 2. Výsledky tedy naznačují, že ECH spouští apoptózu nádorových buněk cestou MAPK.

Diskuse

Podle našich nejlepších znalostí se jedná o první studii, která ukazuje, že ECH má tumor-supresivní funkci tím, že spouští apoptózu (obr. 2), podporuje produkci ROS (obr. 3) a indukuje depolarizaci mitochondriálního membránového potenciálu (obr. 4) což následně vede k inhibici růstu nádorových buněk (obr. 1). Dále bylo ukázáno, že k molekulárnímu základu smrti nádorových buněk zprostředkované ECH dochází regulací signálních drah MAPK (obr. 5). Tato zjištění demonstrují novou funkci ECH v prevenci tumorigeneze, a tak naznačují, že může být kandidátem na léčbu rakoviny.

Většina protirakovinných léčiv může indukovat apoptózu nádorových buněk, stárnutí a/nebo zastavení buněčného cyklu, což vede k inhibici růstu a proliferace nádorových buněk. Zastavení buněčného cyklu je buněčná reakce na signály mírného stresu, které umožňují buňkám opravit poškozenou DNA před zahájením replikativní syntézy DNA nebo mitózy, zatímco apoptóza a senescence (trvalé zastavení buněčného cyklu) nastávají v reakci na stresové signály, které eliminují neopravitelné nebo maligní buňky ( 28,29). Proto byl v této studii hodnocen pouze apoptotický účinek ECH na nádorové buňky, protože zabíjení rakovinných buněk je hlavním kritériem pro hodnocení účinnosti protirakovinného činidla. Zejména bylo prokázáno, že ECH indukuje expresiBax(Obr. 5), proapoptotický gen, transkripčně aktivovaný tumor supresorem p53 (30). Proto stojí za to vyzkoušet, zda ECH může aktivovat signální dráhu p53. Pokud ano, ECH může být také schopen vyvolat p53-závislou zástavu buněčného cyklu, senescenci, apoptózu nebo autofagii. V této studii byla objasněna tumor-supresivní funkce ECH v buněčné linii SW1990 adenokarcinomu pankreatu. Jsou však nutné další studie sledující více buněčných linií rakoviny slinivky břišní. Bylo prokázáno, že mutace v onkogenním proteinu RAS a tumor supresoru p53 jsou spojeny se vznikem rakoviny pankreatu (31); buněčná linie SW1990 však nenese žádnou mutaci p53, podle databáze p53 IARC (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Proto je důležité prozkoumat, zda ECH může ovlivnit růst a proliferaci jiných buněčných linií rakoviny pankreatu s různými mutacemi p53. Kromě toho by bylo zajímavé určit, zda je ECH schopna podporovat apoptózu a inhibovat růst jiných typů nádorů.

Elevace ROS a snížení MMP, které byly způsobeny léčbou ECH, se ukázaly jako zásadní pro indukci apoptózy (22). Navíc bylo zjištěno, že ROS může vyvolat oxidaci mitochondriálních pórů, což přispívá k uvolňování cytochromu.c, meziprodukt v apoptóze, v důsledku narušení MMP (22). Zbývá tedy určit, zda ECH narušuje MMP nepřímo prostřednictvím indukce ROS. Navíc se také ukázalo, že oxidační stres vyvolaný ROS je zapojen do modulace nesčetných signálů řídících buněčný růst, včetně p53, NF-κB, HIF a PI3K (32). Zbývá určit, zda a pokud ano, jak ECH reguluje tyto důležité signální dráhy. Zejména oxidační stres způsobuje různá neurodegenerativní onemocnění kvůli vysoké spotřebě kyslíku, slabým antioxidačním systémům a charakteristikám terminální diferenciace centrálního nervového systému (33). Několik studií však ukázalo, že ECH má ochranné a antiapoptotické účinky na nervovou tkáň. V tomto ohledu je rozumné předpokládat, že ECH může snížit produkci ROS v terminálně diferencovaných nervových buňkách. Zbývá tedy také určit, zda je regulace produkce ROS pomocí ECH závislá na stavu buněčné diferenciace. Současné výsledky spolu s dalšími studiemi tedy odhalují, že ECH, široce používaná TCM, může být důležitou chemoterapeutickou strategií nejen pro léčbu neurodegenerativních onemocnění, ale také maligních karcinomů.

V poslední době získává stále více pozornosti využití TCM v léčbě rakoviny. Potenciál přírodních produktů z léčivých rostlin používaných v TČM uznala vědecká komunita i v západním světě (9). Je třeba vyvinout úsilí k objasnění základních mechanismů účinku těchto přírodních produktů, což může nakonec vést k vývoji účinných a bezpečných léků pro léčbu rakoviny.

Závěrem lze říci, že tato studie prokázala nádorovou inhibiční funkci ECH a také rozpracovává molekulární základ ECH-zprostředkované nádorové suprese, což naznačuje potenciální klinickou aplikaci ECH v terapii rakoviny.

Poděkování

Tato studie byla financována a podpořena z Klíčového programu vědeckého výzkumu FMU (grant č. 09ZD014). Autoři by rádi poděkovali společnosti Biomedworld (Shanghai, Čína) za pomoc s úpravou rukopisu.

Reference

1. Hanahan D a Weinberg RA: Charakteristické znaky rakoviny: Příští generace. Buňka 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transkripce: Transkripční účinky MYC. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ a Roussel MF: Myc signalizace prostřednictvím tumor supresoru ARF reguluje p53-závislou apoptózu a imortalizaci. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K a Mo YY: p53 potlačuje c-Myc prostřednictvím indukce nádorového supresoru miR-145. Proč Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X a Lu H: Nové poznatky o funkcích p53 prostřednictvím jeho cílových mikroRNA. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB a Lippard SJ: Cisplatina a oprava DNA v chemoterapii rakoviny. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H a Korc M: Aktinomycin D indukuje apoptózu a inhibuje růst buněk rakoviny slinivky břišní. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P a Dass ČR: Doxorubicin: Aktualizace protirakovinného molekulárního působení, toxicity a nových systémů dodávání léků. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS a Kaina B: Od tradiční čínské medicíny k racionální terapii rakoviny. Trends Mol Med 13: 353-361, 2007.