ČÁST Ⅰ: Zánětlivý proces moduluje expresi a lokalizaci WT1 v podocytech, což vede k poškození ledvin
Mar 23, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
Úvod
gen Wilmova tumoru-1(WTI) je jedním z hlavních genů podílejících se na přežívání podocytů a neefektivní renální filtraci. Zánětlivé procesy vedou kledvinaselhánía to by mohlo nastat prostřednictvím modulace WT1 (gen Wilmova tumoru-1). WT1(gen Wilmova tumoru-1) kóduje transkripční faktor, protein se zinkovým prstem, který má čtyři hlavní izoformy alternativním sestřihem v exonu 5(17AA±) a exonu 9(KTS±)(1). KTS-isoforma má vyšší afinitu k DNA, KTS plus se v cytoplazmě ko-lokalizuje se spliceosomovými proteiny (2, 3).WT1(gen Wilmova tumoru-1) hraje klíčovou roli v embryogenezi, především v gonadálních aledvinarozvoj; u dospělých je jeho exprese omezena na specializované viscerální buňky vledvina(podocyty) a je nezbytný pro udržování a modulaci několika genů, jako je podokalyxin, nefrin (NPHS1) a transkripční faktor v párovém boxu (4-6). Mutace nebo snížení exprese WTl mohou vést ke snížené expresi nefrinu a podokalyxinu a jsou spojeny s nefropatiemi, jako je glomeruloskleróza(5, 7-10).
Nefrotický syndrom je nejčastějším renálním syndromem v dětském věku, jeho histologická klasifikace je Minimální nefrotická změna, fokální segmentální glomeruloskleróza a difuzní mezangiální skleróza a podle rozsahu odpovědi na steroidy je klasifikován jako senzitivní a rezistentní nefrotický syndrom (11). .
účinky cistanche: protizánětlivé
Mutace WT1(gen Wilmova tumoru-1) je běžně hlášena u dětí s nefrotickým syndromem rezistentním na steroidy, což je vzácné onemocnění, které postihuje 10-15 procent pacientů s nefrotickým syndromem(12,13). Asi 80 procent všech dětí se sporadickým nefrotickým syndromem reaguje na léčbu steroidy, avšak u WT1 nebyly nalezeny žádné mutace(gen Wilmova tumoru-1) ve velké kohortové studii(14).Snížení exprese steroid-rezistentního nefrotického syndromu a v menší míře u pacientů s steroid-senzitivním nefrotickým syndromem(15).Na myším modelu systémového zánětu indukovaného lipopolysacharidem (LPS), 24 hodin po podání LPS, WT1(gen Wilmova tumoru-1) byl translokován do cytoplazmy a byl spojen se snížením exprese nefrinu, klíčové složky pro udržení štěrbinové diafragmy v podocytech a nezbytné pro správnou glomerulární filtraci, čímž vykazuje WT1(gen Wilmova tumoru-1) působí jako transkripční faktor pro upregulaci genu pro nefrin(16).
U buněk rakoviny plic A459 léčených tumor nekrotizujícím faktorem alfa (TNFa) došlo k translokaci WT1(gen Wilmova tumoru-1) byl pozorován protein do cytoplazmy, což naznačuje, že zánětlivý stimul může změnit jeho intracelulární lokalizaci a transkripční funkci (17). Fosforylace může hrát roli při modulaci transkripční regulační aktivity WT1(gen Wilmova tumoru-1) interferencí s jadernou translokací a také inhibicí WT1(gen Wilmova tumoru-1) Vazba DNA(18) prostřednictvím cAMP-dependentní proteinkinázy zprostředkované fosforylací Ser-365 a Ser{5}} v doméně zinkového prstu (19).
Sepse je výsledkem systémové zánětlivé reakce a je charakterizována uvolňováním prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů indukovaných infekcí. Akutní poškození ledvin je běžné u kriticky nemocných pacientů v přítomnosti akutního zánětu a má silnou vazbu na progresi chronického poškození ledvin [20,21]. Existují důkazy, že zánět hraje důležitou roli při poškození různých orgánů, včetněledviny(22). V této práci jsme hodnotili účinek prozánětlivých cytokinů na modulaci WT1(gen Wilmova tumoru-1) exprese a její translokace do cytoplazmy.
přínos cistanche tubulosa: proti rakovině a protinádor
Materiály a metody
Zvířecí model. Samice myší BALB/c (ve věku 8-10 týdnů) byly získány z Harland Mexico (Mexico City, Mexiko). Myši byly chovány v klecích za kontrolované pokojové teploty, vlhkosti a světla (12/12h cyklus světlo-tma) s vodou a potravou ad libitum.LPS Escherichia coli O111:B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Mexico City, Mexiko) a jeden injekce LPS byla podávána v dávce 8 mg/kg intraperitoneálně (16); fyziologický roztok byl použit pro kontrolní neléčené myši. Myši byly usmrceny intraperitoneální injekcí 200 mg/kg roztoku pentobarbitalu sodného ve 12, 24, 36, 48 a 72 h, s n=5 v každém časovém bodě, a potéledvinabyly odebrány tkáně a krev. Před usmrcením zvířat byla odebrána moč.
Dvě myši proledvinaexplantáty byly injikovány 1 mg/kg LPS každé 2 dny k vyvolání chronickéledvina zraněníjako pozitivní kontrola (21). Všechny experimenty byly provedeny v souladu s předchozím souhlasem Výboru pro ústavní péči o zvířata a jejich použití Fakulty biologických věd (CEIBA-2016-034).
ledvinyexplantáty. zledvinaZ myší BALB/c byly připraveny plátky tkáně o tloušťce 250-300 um Krumdieckovým kráječem tkáně (Alabama Research and Development, Munford, AL, USA) při 4 stupních s konstantním průtokem pufru Krebs Henseleit bikarbonát (KB) která byla provzdušňována 5 procenty CO2. Řezy byly sklizeny v KB pufru při 4 stupních.ledvinyexplantáty byly umístěny na 12-jamkové destičky s Dulbeccem modifikovaným Eagleovým médiem/F12 médiem doplněným 10 procenty fetálního bovinního séra a 5 procenty antibiotika a antimykotika a inkubovány při 37 °C, s 5 procenty CO a za míchání při 25 ot./min. Explantáty byly ošetřeny 10 ng/ml TNFa (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml interleukinu 1 (IL1; R&D Systems) a 100 ng/ml LPS a analyzovány při 6, 12 a o 24 hodin později.
Močový protein. Vzorky moči byly odebrány v každém časovém bodě výše. Koncentrace proteinu byla měřena pomocí soupravy DC Protein Assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a albuminurie byla hodnocena pomocí elektroforézy na gelu dodecylsulfát-polyakrylamidu sodného a na základě velikosti pásu hovězího sérového albuminu (16).
Prozánětlivé cytokiny. Hladiny IL6, IL1 a TNFa byly měřeny pomocí sendvičových souprav pro imunosorbentní testy s enzymatickými vazbami (PeproTech, Mexico City, Mexiko).
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (qPCR). Celková RNA byla izolována z renálních tkání pomocí Trizolw Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podle pokynů výrobce. Jednovláknová cDNA byla syntetizována reverzní transkripcí pomocí vysokokapacitní cDNA reverzní transkripční sady (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) podle instrukcí výrobce. PCR v reálném čase byla provedena pomocí systému 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) s testy genové exprese TaqMan. Srovnávací testy PCR v reálném čase byly provedeny pro každý vzorek v triplikátech. Základní nátěry pro WT1(gen Wilmova tumoru-1) byly předány:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; obráceně:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';a sonda FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ;protokol byl proveden při 95 stupních po dobu 10 minut a 40 cyklech při 94 stupních po dobu 30 s a 64 stupňů C po dobu 30 s. Relativní výraz WT1(gen Wilmova tumoru-1) gen byl vypočítán pomocí rovnice 2-AACT(23) s genem pro glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (GAPDH) (Applied Biosystems) použitým pro normalizaci.
léčit onemocnění ledvin cistanche extrakt
Exprese nefrinové mRNA byla stanovena pomocí 3 ug cDNA a následujících primerů: Vpřed: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'a obráceně:5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3''při 94 stupních po dobu 30 s,60 stupně stupně po dobu 30 s a stupně 72 stupně po dobu 30 s po dobu 30 cyklů (372 bp)(16). Pro expresi GAPDH byly použity primery: Vpřed:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',reverzní:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', s následujícími reakčními podmínkami: 94 stupňů po dobu 40 s, 60 stupňů po 30 s a 72 stupňů po 40 s po 35 cyklů (452 bp). Exprese WT1(gen Wilmova tumoru-1):Vpřed 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', vzad 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3' při 94 stupních po dobu 40 s, 64 stupních po 30 s a 72 stupních po 30 s po 35 cyklů (160 bp). Výraz WT1(gen Wilmova tumoru-1) isoformy KTS± a 17 AA±(F2-R2 primery pro detekci 17 AA plus /-a F3-R3 pro detekci KTS plus /-sestřih izoforem) bylo provedeno konvenční PCR podle Oji et .al.(24). Stanovení exprese -aktinu bylo provedeno podle Lauxet al. (25). Produkty byly pozorovány za použití 10% polyakrylamidové gelové elektroforézy pro KTS±isoformu a 2% agarózového gelu pro 17AA±isoformu.
Imunofluorescence. Theledvinyz myší ošetřených LPS a kontrol byly fixovány v 10% formalínu a zpracovány pro barvení hematoxylinem a eosinem, imunohistochemii a imunofluorescenci.
Chcete-li určit umístění WT1(gen Wilmova tumoru-1) u myší léčených LPS byly použity {{0}}um silné řezy ledvinové tkáně připevněné na mikroskopická sklíčka. Vzorky byly zbaveny vosku, permeabilizovány Tritonem X-100 [0,1 procenta Tritonu s 1 procentem citrátu sodného ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS)] a třikrát promyty PBS. Tkáně byly blokovány 20% fetálním bovinním sérem v PBS po dobu 30 minut a inkubovány při 4 stupních přes noc s monoklonální protilátkou proti WT1(gen Wilmova tumoru-1) sc{{0}}(F-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) zředěný 1:100 v 10% fetálním hovězím séru v PBS. Po promytí PBS byla přítomnost navázané protilátky identifikována barvením kozím anti-myším IgG Texas Red sc-2979 (Santa Cruz Biotechnology). Sklíčka byla kontrastně obarvena 4',6-diamidino-2-fenylindolem. Nakonec byla sklíčka připevněna a kvalitativně zkoumána pomocí konfokálního mikroskopu Olympus BX61W1 s objektivem pro imerzi 40x do vody a softwarem Fluoview 4.0a (Olympus, Tokio, Japonsko).
Imunohistochemie. Pro stanovení fosforylovaného (p)-WT1(gen Wilmova tumoru-1) v podocytech z myší ošetřených LPS, polyklonální protilátky proti p-WT1(gen Wilmova tumoru-1) serin 393,sc-12933 a 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA）. Sklíčka obsahující 4-μm řezy ledvinové tkáně byla zbavena vosku a permeabilizována Imunohistochemie byla provedena pomocí Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) podle protokolu výrobce. Sklíčka byla zkoumána pomocí světelného mikroskopu se 100× olejovým imerzním objektivem (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Německo). .
Western blot. Celkový protein byl izolován pomocí 200 ul lyzačního pufru (1 procento Triton, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,6) a koncentrace byla měřena pomocí soupravy DC Protein Assay kit (Bio-Rad). Protein (50 ug) byl separován pomocí elektroforézy na 12% dodecylsulfátu sodného-polyakrylamidovém gelu a analyzován westernovým přenosem pomocí WT1(gen Wilmova tumoru-1) [F6] protilátka sc-7585(Santa Cruz Biotechnology). Vzorky byly normalizovány pomocí anti-GAPDH (AB2302; Sigma, San Louis, MO, USA). Proteiny byly vizualizovány pomocí systému Lumi-Light Western blotting sc-2048(Santa Cruz Biotechnology).
přínos cistanche: chrání ledviny
Výsledek
Vyvoláníledvinapoškozeníu BALB/c myší pomocí LPS. Je dobře známo, že poškození podocytů je spojeno se zvýšenou proteinurií. Albumin a celkový protein v moči byly stanoveny elektroforézou na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu a soupravou DC Protein Assay kit (Bio-Rad). Významné zvýšení (p=0.001) močového albuminu bylo pozorováno 12 hodin po léčbě LPS, s maximálním zvýšením za 24 hodin (215,87 ± 1,41 ug/ml) ve srovnání s kontrolou (15,53 ±5,0 ug/ml））(obrázek 1A）. Koncentrace celkového proteinu v moči byla pozorována jako vrchol za 36 h (26,02±2,43 mg/ml) a byla významně vyšší ve srovnání s kontrolou (p=0,01). jak je znázorněno na obrázku 1. Poškození ledvin vyvolané LPS bylo analyzováno histologicky. 24 hodin po léčbě byla v tkáni ledvin pozorována fokální glomerulonefritida, přičemž největší poškození bylo zjištěno po 36 hodinách, kdy se zvětšila velikost glomerulu s mezangiálním Po 48 hodinách bylo pozorováno postupné zotavení glomerulu až do 72 hodin, jak je znázorněno na obrázku 1C.
Obrázek 1. Vliv systémového zánětu na ledvinu.Koncentrace močového albuminu (A) a močového proteinu (B) jako markerů poškození ledvin u myší léčených lipopolysacharidem. C: Reprezentativní obraz renální histologie myši (barvení hematoxylinem a eosinem) v různých časech (12, 24, 36, 48 a 72 h) po injekci lipopolysacharidu, s porovnáním modelu chronického zánětu, zvětšení 100×. Výrazně se liší v: *n<><0,0]><0.00>
Produkce prozánětlivých cytokinů TNFa a IL1 v séru z myší léčených LPS. Aby se potvrdilo, že poškození ledvin bylo indukováno LPS, byly hladiny prozánětlivých cytokinů měřeny enzymatickým imunosorbentním testem. Zvýšení TNFa a I1 bylo pozorováno po 12 h (3,6±0,9 ng/ml, 11,9±5 ng/ml) a až po 36 hodinách (4,44±0,1 ng/ml,18 ±0,9 ng/ml v uvedeném pořadí) léčby LPS, poté začal klesat (obrázek 2A a B). Exprese IL6 byla zvýšena po 12 h (49,5 ng/ml) a 36 h (23,5 ng/ml) po léčbě, což je významně vyšší hodnota než u kontroly (obrázek 2C).
Obrázek 2. Časový průběh hladin prozánětlivých cytokinů tumor nekrotizujícího faktoru-alfa (TNFa).(A), interleukin 1 (LL1)(B) a IL6(C) v séru myší po intraperitoneálním podání lipopolysacharidu. Výrazně se liší při: *p Menší nebo rovno 0.{5}}5,**p Menší nebo rovno 0,01 a ***p Menší nebo rovno 0,001 .
Exprese genu WTI v ledvinové tkáni od myší ošetřených LPS. Abychom odpověděli na naši ústřední otázku, zda WT1(gen Wilmova tumoru-1) byl modulován zánětlivým procesem, a to mělo renální účinky, celková exprese WT1(gen Wilmova tumoru-1) gen byl stanoven ve vzorcích ledvin od myší se systémovým zánětem v různých časech průběhu zánětu. WT1(gen Wilmova tumoru-1) mRNA byla vždy nižší ve srovnání s kontrolou, s nejnižší relativní expresí za 36 hodin a nejvyšší za 12 hodin po indukci systémového zánětu, jak je znázorněno na obrázku 3A. Kromě toho bylo stanoveno, zda léčba LP indukovala modifikaci exprese exonu 5(17 AA±) izoformy a KTS±WTI pomocí PCR. Data ukázala, že nedošlo k žádné deregulaci exprese těchto izoforem, protože stejné chování bylo pozorováno jako u kontrolní skupiny bez léčby během systémového zánětlivého procesu vyvolaného LPS (obrázek 3B). Protein WT1 se pomocí western blotu snižoval v průběhu zánětlivého procesu, s mírným zotavením 36 hodin po léčbě, avšak množství WT1 bylo menší než u neošetřené kontroly (obrázek 3C a D).
Obrázek 3. Účinek lipopolysacharidu (LPS) na expresi genu Wilms'tumor I (WT1) v tkáni ledvin od myší se systémovým zánětem.A: Relativní exprese WTI mRNA.B: Relativní exprese izoforem KTS±a 17IAA±z WT1.C: Hladiny proteinu WTI imunoblotováním po ošetření LPS a D: Hustota imunoblotu pro WT1.Významně odlišné při:**p Méně než nebo rovno 0.01 a ***p menší nebo rovno 0,001,
Fosforylace a lokalizace WTI v biopsiích ledvin myší léčených LPS. Důležitou událostí v posttranslační modulaci proteinu WTI je fosforylace aminokyseliny 393, která indukuje vytěsnění proteinu do cytoplazmy. Byla stanovena fosforylace a lokalizace WT1 ve vzorcích ledvin od myší léčených LPS. Fosforylace WT1 byla analyzována histochemicky, což ukazuje na přítomnost fosforylovaného WT1 v cytoplazmě buněk v řezech renální tkáně počínaje 12 hodinami po indukci systémového zánětu a udržovala se až do 72 hodin. WT1 byl fosforylován na aminokyselinách 393 a 363 jak je znázorněno na obrázku 4A. Umístění proteinu WT1 bylo analyzováno imunofluorescencí. Umístění WT1 v podocytech ve vzorcích ledvin od myší ošetřených LPS bylo převážně cytoplazmatické, zatímco v podocytech z kontrolních vzorků bylo umístění nejasné (obrázek 4B).
Obrázek 4. Fosforylace a lokalizace Wilmsova tumoru I (WTI) ve vzorcích ledvin od myší ošetřených lipopolysacharidem.A: Imunohistochemické barvení na fosforylovaný (p)-WTI ukazující zvýšení fosforylovaného serinu 393 a 363 počínaje 12 hodinami po podání LPS (100x zvětšení na světelném mikroskopu). B: Lokalizace WTI imunofluorescencí v ledvině; příklady ukazující menší jadernou lokalizaci WT1 (čtverečky) 36 h po podání lipopolysacharidu (zvětšení 40× na konfokálním mikroskopu).DAP1:4,6-Diamidino-2-fenylindol.
Modulace exprese WTI a nefrinu v ledvinách z myší léčených LPS. Umístění WT1 v buňce ovlivňuje jeho biologickou aktivitu. Bylo publikováno, že cytoplazmatický WT1 nevykazuje transkripční aktivitu; z tohoto důvodu byla exprese WT1 a mRNA nefrinu analyzována pomocí PCR ve vzorcích ledvin od myší léčených LPS (obrázek 5A). ), zatímco exprese mRNA WTI se zvýšila za 12 hodin a poté se snížila během kritických hodin zánětu a poškození ledvin (24 a 36 hodin) a (obrázek 5B).
Obrázek 5. Analýza exprese mRNA nefrinu (NPHS1) a Wilmsova tumoru 1(WT1).A: Při analýze exprese mRNA se NPHSI a WTI snížily 24, 36 a 48 hodin po indukci systémového zánětu pomocí lipopolysacharidu. B: Kvantifikace pásů ukázaných v A pomocí denzitometrie a normalizovaných expresí na glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázu.
Explantáty ledvin ošetřené TNFa a IL1 modulují expresi WTI a nefrinu. Pro stanovení, zda cytokiny modulují expresi WT1, byly renální explantáty kultivovány a ošetřeny cytokiny TNFa a IL1 po dobu 6, 12 a 24 hodin, aby se analyzovala exprese WT1 a nefrinu pomocí PCR. Exprese mRNA nefrinu se snížila a exprese mRNA WTI se zvýšila po 24 hodinách v renálních explantátech ošetřených TNFa a ILlb (obrázek 6).
Obrázek 6. Analýza exprese mRNA nefrinu (NPHS1) a Wilmsova tumoru 1 (WT1) v renálních explantátech.A: Hladiny exprese mRNA NPHSi a WTI v různých časech v renálních explantátech vystavených 10 ng/ml tumor nekrotizujícího faktoru-alfa (TNF) a 20 nglml interleukinu 16 (IL16)B: Relativní exprese získaná pomocí denzitometrické analýzy signální produkt. Pásy byly kvantifikovány normalizací na glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenázu.
Lokalizace WTI v renálních explantátech imunofluorescencí. Aby se určilo, zda TNFa a IL byly zodpovědné za změnu v lokalizaci proteinu WT1, byly explantáty myší ledvin ošetřeny TNFa a L1 a LPS po dobu 24 hodin. U explantátů ošetřených ILlb a LPS byla patrná jaderná/cytoplazmatická lokalizace proteinu WTl a v explantátech ošetřených TNFa byla pozorována cytoplazmatická lokalizace proteinu WT1; mezitím u neléčených kontrol byla pozorována hlavně jaderná lokalizace WT1 (obrázek 7).
Obrázek 7. Lokalizace proteinu Wilmsova tumoru 1 (WTI) imunofluorescencí pomocí Red TX (WT1) a 4',6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI)(jádro) v podocytech z explantátů ledvin léčených s 10 ng/ml tumor nekrotizujícího faktoru-alfa (TNFa), 20 ng/ml interleukinu 16 (L1B) a lipopolysacharidu (LPS).Snížená jaderná lokalizace WTas ukázaná v explantátech ošetřených TNFa ve srovnání s jadernou/cytoplazmatickou lokalizací WTI při ošetření IL1 a LPS. Zvětšení, 40×.
