Zásadní role TRPM6 v cirkadiánní regulaci krevního tlaku
Mar 19, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Význam renálního iontového kanálu TRPM6 v cirkadiánní sekreci reninu ke zvýšení krevního tlaku
Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto & Hiroaki Miki
Krevní tlakmá denní vzorec s vyššími hodnotami v aktivním období. Jeho elevace na začátku aktivního období podstatně zvyšuje riziko fatálních kardiovaskulárních příhod. Sekrece reninu stimulovaná renálními sympatickými neurony je považována za zásadní pro tento proces; jeho regulační mechanismus však zůstává velkou neznámou. Zde ukazujeme důležitostpřechodný receptorový potenciál související s melastatinem 6 (TRPM6), Mg2 plus -permeabilní kationtový kanál, při zvyšování sekrece reninu v aktivním období.TRPM6exprese je významně snížena v distálním stočeném tubulu hypotenzních Cnnm2-deficientních myší. Vytváříme specifické pro ledvinyTRPM6-deficientní myši a pozorují pokles vkrevní tlaka vymizení jeho cirkadiánních variací. Sekrece reninu se konzistentně v aktivním období nezvyšuje. Kromě toho je sekrece reninu po farmakologické aktivaci -adrenoreceptoru, cíle neuronální stimulace, zrušena a exprese receptoru je snížena v buňkách sekretujících renin. Tyto výsledky naznačují zásadní roleTRPM6 v cirkadiánní regulacikrevní tlak.
Odhaduje se, že přibližně jedna miliarda lidí na celém světě má hypertenzi, což významně zvyšuje riziko různých onemocnění, včetně potenciálně smrtelných onemocnění, jako je ischemická choroba srdeční a mozková mrtvice. Je známo, že tyto smrtelné příhody související s hypertenzí se často vyskytují brzy ráno, na začátku aktivního obdobíkrevtlakprudce stoupá. Má se za to, že klíčovou roli v tom hraje sekrece reninu spouštěná renálními sympatickými neuronykrevní tlakelevaci, ale její regulační mechanismus není dobře pochopen².
Je široce přijímáno, že některé minerální látky, zejména sodík a draslík, hrají důležitou roli při kontrolekrevtlak. Hořčík je hlavním základním prvkem zapojeným do různých biologických aktivit. Epidemiologické studie prokázaly významný nepřímý vztah mezi hladinami hořčíku ve stravě a rizikem hypertenze3-6. Navíc vylučování hořčíku močí, o kterém se předpokládá, že je přibližně v rovnováze s absorpcí hořčíku ve střevě, nepřímo koreluje s rizikem hypertenze. Tato zjištění naznačují úzkou souvislost mezi homeostázou hořčíku v organismu akrevní tlakregulace, zdůrazňující význam Mg2 plus kanálů a/nebo transportérů při regulacikrevní tlak.
Velké množství hořčíku se neustále reabsorbuje v ledvinách. Většina hořčíku v glomerulárním filtrátu je reabsorbována v tlusté vzestupné větvi Henleovy kličky, ale poslední krok reabsorpce nastává v distálním stočeném tubulu (DCT)8. Tento druhý proces je přísně regulován, aby se upravilo množství reabsorpce na úroveň vhodnou pro udržení homeostázy hořčíku. Genomické analýzy vrozených onemocnění se symptomy hypomagnezémie odhalily několik klíčových molekul zapojených do tohoto procesuTRPM6, kódovánípřechodný receptorový potenciál související s melastatinem 6(TRPM6), který je mutován u pacientů s recesivní hypomagnezémií se sekundární hypokalcémií2,10.TRPM6tvoří Mg2 plus -permeabilní iontový kanál lokalizovaný na apikální membráně DCT buněk a zprostředkovává Mg2 plus příjem z tubulárního lumenu1. Další klíčovou molekulou je cyklin M2 (CNNM2) a transportér Mg2 plus lokalizovaný na bazolaterální membráně DCT buněk12,13. Cnnm2 mutace způsobují familiární dominantní hypomagnezémii, která je charakterizována poruchami reabsorpce hořčíku v ledvinách12. Cnmm2-deficitní myši vykazují podobné příznaky hypomagnezémie s úbytkem hořčíku v ledvinách14. Přesná molekulární úloha CNNM2 je stále kontroverzní, ale několik linií důkazů naznačuje, že zprostředkovává Mg2 plus eflux z DCT buněk přes bazolaterální membránu15, čímž přispívá k reabsorpci hořčíku. Další analýzy myší s deficitem Cnnm{16}}odhalily, že tyto myši mají také výrazně nižšíkrevtlaknež kontrolní myši4. Nicméně, mechanické detaily a zapojení dalších Mg2 plus kanálů/transportérů v tomtokrevtlakregulace zůstává neznámá.
Je také známo, že ledvinová DCT hraje kritickou rolikrevtlakregulace, protože významně reabsorbuje sodík a reguluje objem tělesných tekutin6. Na apikální membráně DCT a na některých tyto proteiny zprostředkovávají příjem Na plus do buněk DCT z tubulárního lumenu. Intracelulární Na plus je pak vytlačován z buněk přes bazolaterální membránu Na plus/K plus -ATPázou, aby se dosáhlo jeho reabsorpce. Kromě přímého zapojení do regulace objemu tělesných tekutin je DCT umístěna v blízkosti macula densa, která řídí sekreci reninu, hormonu s hlavní rolí přikrevní tlakregulace17,18. Snímáním hladin Cl- v moči stimulují buňky macula densa blízké juxta-glomerulární (JG) buňky k sekreci reninu.
V této práci provádíme transkriptomové analýzy s ledvinami hypotenzních myší s deficitem Cnnm{0}}. Vidíme výrazný poklesTrpm6, což nás pobízí k vytvoření specifické pro ledvinyTrpm6- nedostatkové myši. Analýzy tohoto myšího kmene neočekávaně odhalily fenotyp kvalitativně odlišný od fenotypu Cnnm2-deficientního: ztrátu cirkadiánní variacekrevtlak. Zjišťujeme také, že tento fenotyp je způsoben poruchou sekrece reninu, akrevní tlak- zvyšující hormon, jehož hladina v krvi je během aktivní fáze normálně zvýšená.
cistanche kulturistika
Výsledek
DownregulaceTRPM6 (přechodný receptorový potenciál související s melastatinem 6)u myší s deficitem Cnnm2-. Prozkoumat molekulární mechanismuskrevní tlaksnížení počtu Cnnm2-deficientních myší, provedli jsme analýzy DNA microarray, abychom prozkoumali změny genové exprese v ledvinách Cnnm2f/il; Šest2-Cre myší, kterým v ledvinách chybí obě alely Cnnm2l4. Mezi odlišně exprimovanými geny (tabulka 1) jsme zvolili analýzu Pvalb aTrpm6, které jsou oba vyjádřeny v DCT919. Kvantitativní PCR (qPCR) analýzy to odhalilyTrpm6exprese byla podobně snížena v ledvinách obou Cnnm2fi; Šest2-Cre a Cnnm2 plus / myší. Protože Cnnm2 plus /A i Cnnm2fi/; Šest2-Cre myší bylo hypotenzních4, jak jsme analyzovaliTRPM6 výraz podrobněji. Imunoblotovací analýzy ledvinových lyzátů potvrdily významný poklesTRPM6na proteinové úrovni deficitem Cnnm{0}}, zatímco hladiny NCC a fosforylovaného NCC (aktivní forma) nebyly výrazně ovlivněny, exprese CNNM2 byla potvrzena následnou imunoprecipitací a imunoblotovacími analýzami. Pokles oTRPM6v ledvinách Cnnm2f/i; Šest2-myší Cre bylo také potvrzeno imunofluorescenční analýzou.
Také jsme zkoumaliTRPM6exprese u myší postrádajících CNNM4, které také vykazují příznaky hypomagnezémie20, ale jsou zvýšenékrevní tlak4. Imunoblotovací a imunofluorescenční analýzy to ukázalyTRPM6exprese je zvýšena v buňkách DCT myší s deficitem Cnnm{0}}, což naznačujeTRPM6výraz je úzce spojen skrevní tlakhodnot, ale to není přímo spojeno s hladinami hořčíku v krvi.
RegulaceTRPM6exprese intracelulárním Mg2 plus v buňkách DCT. Charakterizovat molekulární mechanismusTRPM6 downregulace u Cnnm2-deficientních myší jsme použili buněčnou linii MDCT21 odvozenou z DCT, která mezi geny rodiny Cnnm exprimuje dominantně Cnnm2 a středně Cnnm3 a Cnnm4. Protože CNNM2 a CNNM4 mají silnou Mg2 plus efluxní aktivitu, zatímco CNNM3 nemá žádnou Mg2 plus efluxní aktivitu15, provedli jsme malou interferující RNA (siRNA) zprostředkovanou knockdown buď Cnnm2, Cnnm4 nebo obou. Knockdown Cnnm2 zvýšil intracelulární hladiny Mg plus ([Mg plus ]) a současné snížení Cnnm4 vedlo k mírnému zvýšení průměru [Mg2]; hodnota, která nebyla statisticky významná. Dále jsme zkoumaliTrpm6expresi pomocí qPCR a zjistili významný pokles po knockdown Cnnm2 a mnohem větší pokles po dvojitém knockdownu Cnnm2 a Cnnm4. Proto,Trpm6Zdá se, že exprese je negativně regulována intracelulárními hladinami Mg2 plus, což je v souladu s předchozími zprávami23. Abychom přímo prozkoumali důležitost Mg2 plus, kultivovali jsme MDCT buňky v médiu s různými koncentracemi Mg2 plus 0,1 h, přičemž snížení extracelulární koncentrace Mg2 plus vedlo ke snížení intracelulární hladiny Mg2 plus a zvýšeníTrpm6expresi, což naznačuje supresivní roli Mg2 plus. V případě dvojitého knockdownu (Cnnm2/Cnnm4) MDCT buněk,Trpm6exprese byla potlačena se snižujícím se Mg2 plus
plus koncentrace až na 0,2 mm, ale další snížení zrušilo supresivní účinek; jak intracelulární Mg2 plus, tak iTrpm6hladiny nebyly významně odlišné od kontrolních buněk transfekovaných siRNA v podmínkách 0.1 a 0.02 mM. Tyto výsledky naznačují regulační mechanismus závislý na Mg2 plusTrpm6výraz, který vysvětlujeTrpm6downregulace v ledvinách Cnnm2-deficientních myší.
Podmíněné narušeníTrpm6 (přechodný receptorový potenciál související s melastatinem 6)v ledvině. Dále jsme se zaměřili na generováníTrpm6-deficientní myši dále zkoumat významTRPM6v regulacikrevní tlak. Použili jsme klon embryonálních kmenových (ES) buněk nesoucích rekombinantTrpm6alela (Trpm6-), která obsahuje sestřihovou akceptorovou sekvenci, která vynucuje předčasný sestřih mRNA a vede k mRNA zkrácené po exonu 6. Chimérické heterozygotní myši byly získány injekcí blastocyst ES buněk a rekombinace byla potvrzena pomocí PCR. Tyto jsme protínaliTrpm6plus /- myši, ale neTrpm6-/--off_jaro. Tento výsledek je v souladu s předchozími zprávami ukazujícími embryonální letalitu uTrpm6-deficientní myši24,25
Proto jsme provedli ledvinově specifické podmíněné narušeníTrpm6pomocí Six{0}}Cre, což umožňuje účinnou a specifickou expresi Cre rekombinázy fúzované s GFP v embryonální ledvině.Trpm6fl/, šest2-myší Cre (specifické pro ledvinyTrpm6-deficientní myši) se narodily v očekávaném mendelovském poměru. K určení výrazuTRPM6jsme provedli imunoblotovací analýzy pomocí anti-TRPM6protilátka.TRPM6hladiny proteinů byly výrazně sníženy v ledvináchTrpm6fl/fl, Six{0}}Cre myši, ale v jiných orgánech nebyly pozorovány žádné významné změny. Imunofluorescenční analýzy barvení také neukázaly žádnou expresiTRPM6v NCC-pozitivních DCT buňkách. Nezaznamenali jsme žádné významnéTRPM6-pozitivní signál ve více než 100 takových shlucích NCC-pozitivních buněk, což naznačujeTRPM6exprese je téměř úplně potlačena v DCT buňkách Trpmfi/; Šest2-myšek Cre. Tyto výsledky potvrzují úspěšnou generaci specifických pro ledvinyTrpm6- nedostatkové myši.
Nejprve jsme zkoumali účinek specifických pro ledvinyTrpm6- nedostatek homeostázy hořčíku. Myši jsme udržovali v metabolických klecích a odebírali vzorky moči a séra, které byly poté podrobeny kolorimetrické kvantifikaci hladin hořčíku pomocí Xylidyl Blue-I. Hladiny hořčíku v séru byly výrazně nižšíTrpm6l/l; Šest2-myší Cre ve srovnání s těmi, které kontrolovalyTrpm6plus / plus ; Šest2-Cre myší, zatímco hladiny hořčíku v moči byly vyšší. Provedli jsme také analýzy emisní spektroskopie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-ES) k měření několika hlavních kovových prvků v séru a zjistili jsme, že v Trpmd/ byly významně ovlivněny pouze hladiny hořčíku; Šest2-myšek Cre. Tyto výsledky jasně ukazují, že myši s deficitem Trpm6-specifického pro ledviny mají hypomagnezémii s úbytkem hořčíku ledvinami, jak bylo pozorováno u micel s deficitem Cnnm2-specifických pro ledviny4.
Nedostatek cirkadiánních variacíkrevtlaka reninovou aktivitu. Dále jsme se podrobiliTrpm6i/l; Šest2-myšek Crekrevtlakměření pomocí radiotelemetrie. Systolický a diastolickýkrevní tlakobě hodnoty byly výrazně nižšíTrpm6l/; Šest2-myšek Cre než u kontrolních myší. Je pozoruhodné, že obvyklá cirkadiánní variacekrevní tlak, s vysokými hodnotami během tmavého období a nízkými hodnotami během světlého období u myší, nebyl pozorován vTrpm6f/l; Šest2-myšek Cre. Abychom prozkoumali, zda cirkadiánní rytmus probíhá normálně, použili jsme radiotelemetrii k měření pohybové aktivity myší a potvrdili jsme velmi jasné cirkadiánní variace vTrpm6l/; Šest{{0}}myšek Cre. Také jsme zkoumali krevní hladiny vazopresinu (AVP) a hladiny mRNA dvou hodinových genů Bmall a Per2 v mozku a ledvinách; o všech je známo, že vykazují typické cirkadiánní variace27,28. Analyzovali jsme v šesti různých časových bodech (v časech 0,4,8 zeitgeber (ZT) pro období světla a ve 12,16,20 ZT pro období tmy). Kontrolní myši vykazují jasné cirkadiánní vzorce jejich exprese, jak bylo uvedeno dříve28, a opět jsme nenašli žádné významné abnormality vTrpm6/il; Šest2-myšek Cre. Také jsme zkontrolovali úroveň exprese Trpm7, který kóduje Mg2 plus -propustný kanál úzce související sTRPM6, v ledvině. Vzorce výrazů byly u obou velmi podobnéTrpm6plus / plus ; Six2-Cre a Trpm6f/; Šest2-Cre myší a nevykazovaly jasné cirkadiánní vzorce. Dohromady docházíme k závěru, že cirkadiánní rytmus probíhá normálněTrpm6i; Šest2-myšek Cre. Uvažovalo se o tomkrevtlakzvýšení během aktivního období (období tmy u myší a světlé období u lidí) u lidí i myší nastává v reakci na zvýšení sekrece reninu do krve2. Měřili jsme aktivitu reninu ve vzorcích krve odebraných v šesti různých časových bodech popsaných výše. Jasné zvýšení aktivity reninu v krvi bylo pozorováno během období tmy u vzorků od kontrolních myší, ale žádné významné zvýšení nebylo pozorováno u vzorků od myšíTrpm6/lSix2-myši Cre. Měřili jsme také hladinu noradrenalinu v krvi, o jehož uvolňování je známo, že je stimulován aktivací systému renin-angiotenzin29,30. Jak se dalo očekávat, jejich cirkadiánní variace také zmizelyTrpm6, Šest2-myšek Cre. Mezitím hladina proteinu krevního angiotenzinogenu (AGT), další molekuly omezující rychlost pro aktivaci systému renin-angiotenzin u myší31, nebyla ovlivněnaTrpm6 nedostatek. Výsledky naznačují, že zhoršená cirkadiánní variace reninu je důležitá pro ztrátu cirkadiánní variace reninu.krevtlakpodleTrpm6-nedostatek.
BlízkostTRPM6-exprimující buňky do buněk vylučujících renin. Renin je exprimován a vylučován z JG buněk v ledvinách17,18. JG buňky jsou v přímém kontaktu s macula densa, která se nachází v blízkosti DCT a stimuluje sekreci reninu z JG buněk v reakci na snížení hladiny Cl v moči18. Imunofluorescenční barvení na renin a neuronální syntázu oxidu dusnatého (nNOS), marker macula densa, neprokázalo žádné abnormality ve vzoru ani intenzitě pozitivních signálů pozorovaných v blízkosti glomerulů.Trpm6F/; Šest2-myšek Cre. Zdá se tedy, že buňky přímo zapojené do sekrece reninu a jeho regulace nejsou výrazně ovlivněnyTrpm6nedostatek. Tak jakoTRPM6je koexprimován s NCC v DCT, dále jsme zkoumali prostorový vztah mezi nimiTRPM6/NCC-exprimující buňky (DCT) a macula densa nebo JG buňky. Konfokální snímky sagitálních řezů DCT ukázaly téměř úplné překrytíTRPM6a NCC signály v celé DCT. Poté jsme barvili na nNOS a NCC a zjistili jsme, že oblasti pozitivní na nNOS a NCC jsou spojeny, aniž by se překrývaly signály. Kromě toho dvojité barvení na renin aTRPM6/NCC odhalil, že někteříTRPM6/NCC-exprimující buňky jsou v blízkosti renin-exprimujících JG buněk, což naznačuje, žeTRPM6Buňky exprimující NCC, stejně jako macula densa, mohou mít významný vliv na sekreci reninu.
Zhoršená sekrece reninu tímTrpm6 (přechodný receptorový potenciál související s melastatinem 6)nedostatek. Obecně platí, že autonomní nervový systém hraje klíčovou roli při organizování progrese cirkadiánního rytmu. Předpokládá se, že sekrece reninu z JG buněk během aktivního období je stimulována noradrenalinem vylučovaným z renálních sympatických neuronů32. Abychom přímo prozkoumali účinek takové stimulace na sekreci reninu, připravili jsme řezy ledvin a stimulovali je isoproterenolem, agonistou -adrenoreceptoru (AR). Výsledky ukázaly velmi jasný pokles renin-pozitivního signálu zbývajícího v řezu po stimulaci isoproterenolem po dobu 30 minut. Kvantitativní analýzy ukázaly, že procento glomerulů obklopených renin-pozitivním signálem se po stimulaci isoproterenolem snížilo z přibližně 80 procent na 30 procent, což ukazuje na výskyt masivní sekrece reninu. Nepozorovali jsme však významný vliv stimulace isoproterenolem na signál reninu v řezech ledvin zTrpm6/1; Šest2-myšek Cre. Pro potvrzení výsledku jsme také měřili aktivitu reninu v krvi po podání isoproterenolu. Výsledky ukazují, že významné zvýšení aktivity reninu v krvi bylo pozorováno pouze u kontrolních myší, zatímco zvýšení srdeční frekvence bylo běžně pozorováno u obou kmenů. Tyto výsledky naznačují, že JG buňky vylučující renin nemohou reagovat na stimulaci renálních sympatických neuronů, což je v souladu s vymizením cirkadiánního zvýšeníkrevtlaka reninovou aktivitou vTrpm6l/fl; Šest2-myšek Cre.
JG buňky mohou být také stimulovány k sekreci reninu v reakci na prostaglandiny, mezi nimiž je prostaglandin E2 (PGE2) považován za nejvýznamnější, protože je fyziologicky vylučován buňkami macula densa, když se hladiny Cl- v moči snižují17,18. Navíc je také známo, že PGE, ošetření ledvinových plátků, může účinně stimulovat sekreci reninu33. Stimulace JG buněk pomocí PGE2 a isoproterenolu běžně aktivuje produkci cAMP, která nakonec způsobí sekreci reninu. Proto jsme také testovali účinek PGE a membránově propustného analogu cAMP, dibutylyl-cAMP(db-cAMP).PGE2 a db-cAMP úspěšně stimulovaly sekreci reninu v řezech ledvin z Trpmdi/A, Six2- Myši Cre a kontrolní myši. To naznačujeTrpm6 nedostatek neruší obecný aparát zapojený do snímání vnějších podnětů, předávání intracelulárních signálů a provádění sekrece reninu, ale specificky ovlivňuje odpověď na -AR.
Snížení exprese -AR v buňkách JG oTrpm6 (přechodný receptorový potenciál související s melastatinem 6)nedostatek. Zhoršená odezva -AR receptoruTrpm6l/l; Šest2-Cre myší nás vedlo ke zkoumání stavu exprese receptoru -AR, a proto jsme provedli imunofluorescenci 1-AR, hlavního podtypu -AR exprimovaného v buňkách JG34. Jak bylo uvedeno dříve34, našli jsme pruhový vzor barvení v renálních řezech kontrolních i Trpmdi/l, Six{7}}Cre myší. Je známo, že 1-AR je silně exprimován jak v krevních cévách, tak v JG buňkách34 a konzistentně byly 1-AR-pozitivní buňky na konci páskového barvení v ledvinách kontrolní myši také pozitivní pro barvení reninu (zobrazeno hrotem šipky). Naproti tomu barvení Trpm6l/fl; Ledvina šesti2-Cre myší vykazovala menší počet 1-AR/renin dvojitě pozitivních buněk, což naznačuje, že 1-exprese AR byla u buněk JG snížena. Abychom toto zjištění potvrdili, izolovali jsme JG buňky pomocí metody centrifugace s hustotním gradientem Percoll podle předchozí zprávy35. Imunoblotovací analýzy odhalily, že renin-pozitivní JG buňky jsou obohaceny ve frakci pásu 3, což je v souladu s jejich zprávou35, a 1-exprese AR v této frakci pásu 3 byla specificky mnohem nižší v Trpmdi/1; Šest2-myšek Cre. Dohromady jsme to našliTrpm6nedostatek snižuje hladinu exprese 1-AR v buňkách JG, což je v souladu se zhoršenou sekrecí reninu.
Vliv umělé intervence na cirkadiánníkrevtlakvariace. V závěrečné sadě experimentů jsme testovali vliv různých intervencí na cirkadiánníkrevtlakvariace. Abychom potvrdili důležitost reninu, podali jsme myším divokého typu klinicky dostupný inhibitor reninu aliskiren36. JakoTrpm6ablace, podání aliskirenu chirurgickou implantací osmotické minipumpy významně potlačilo cirkad.krevtlakvariace. Dále jsme provedli operace renální denervace, protože aktivace -AR na buňkách JG prostřednictvím sympatického nervového systému je hlavní cestou pro stimulaci sekrece reninu cirkadiánním způsobem2. Opět jsme zjistili, že zásah potlačilkrevtlakvariace. Tyto výsledky jsou v souladu s naším modelem, že za ztrátu jsou zodpovědné defekty v odpovědi -AR a sekreci reninukrevní tlakvariace v Trpmdl/l; Šest2-myšek Cre.
Testovali jsme také účinek zvýšení obsahu hořčíku ve stravě. Za tímto účelem byly myši divokého typu krmeny stravou s vysokým obsahem hořčíku obsahující 0,6 procenta (normální strava:0,3 procenta hořčíku) po dobu 1 měsíce. Jak se očekávalo, tyto myši vykazovaly zvýšené hladiny Mg v krvi. Poté jsme zkontrolovali úroveň expreseTRPM6na DCT; drasticky se snížil při podávání stravy s vysokým obsahem hořčíku a rozsah se snížilTRPM6exprese byla větší než renální ablace Cnnm2. Když jsme měřilikrevní tlaku těchto myší jsme zjistili, že myši krmené stravou s vysokým obsahem hořčíku vykazovaly výrazně menší hodnotykrevtlakvariace nežTrpm6-deficientní myši, což je v souladu s naší představou, že ledvinyTRPM6je důležitý pro cirkadiánníkrevní tlakvariace.
Tabulka 1 Geny, které byly upregulovány nebo downregulovány v ledvinách Cnnm2flfl/flfl; Šest2-myšek Cre.
Diskuse
V této studii jsme prokázali důležitostTRPM6 (přechodný receptorový potenciál související s melastatinem 6)v regulacikrevní tlak. Zejména ukazujeme téměř úplné vymizení cirkadiánních variacíkrevní tlakspecificky pro ledvinyTrpm6- nedostatkové myši. Také jsme zjistili, že sekrece reninu, klíčového hormonu řídícího krevní tlak, byla vážně zrušenaTrpm6-deficientní myši, což je v souladu s pozorovanýmkrevní tlakfenotyp. Několik zpráv ukázalo, že TRPM7, další Mg2 plus -propustný kanál, velmi podobnýTRPM6, také ovlivňuje krevní tlak37,38. TRPM7 zabraňuje nárůstukrevní tlakpo podání angiotenzinu II potlačením odpovědi vaskulárních endoteliálních buněk na angiotenzin II37. Naopak, nedávno bylo oznámeno, že TRPM7 také usnadňuje elevacikrevní tlakpo podání leptinu zprostředkováním Mg2 plus influxu do buněk karotického těla38. Role TRPM7 tedy vkrevní tlakregulace je nejednoznačná. Protože však hladina exprese TRPM7 v ledvinách nebyla ledvinami ovlivněnaTrpm6ablace (doplňkový obr. 5), zdá se, že TRPM7 není přímo zapojen do fenotypů pozorovaných v této studii.
Jak bylo pozorováno u myší s nedostatkem Cnnm2-,krevní tlakhodnoty byly sníženy vTrpm6-deficientní myši(obr.2)14. Je však třeba poznamenat, že mezi těmito myšmi byl jasný rozdíl. Narušení Cnnm2 obecně sníženokrevní tlak, ale cirkadiánní variace byla stále jasně pozorovatelná. Naproti tomu tato variace zmizela vTrpm6- nedostatkové myši. Takový kvalitativní rozdíl je také v souladu s naším pozorováním, že cirkadiánní variace reninu byla zachována u Cnnm2-deficientních myší (doplňkový obrázek 9). Je třeba poznamenat, že jak CNNM2, takTRPM6Předpokládá se, že jsou důležité pro renální Mg2 plus reabsorpci zprostředkováním vektorového Mg2 plus transportu přes DCT, a skutečně myši s deficitem kteréhokoli genu vykazovaly identický renální fenotyp Mg2 plus - chřadnutí (obr. 1 a odkaz 39). Kvalitativní rozdílkrevní tlakfenotyp mezi Cnnm2-aTrpm6-deficientní myši naznačují, že Mg2 plus transport v DCT, společná funkce těchto dvou molekul, není přímo zapojen do cirkadiánní variacekrevní tlaka sekrece reninu, což naznačuje, že CNNM2-nezávislá roleTRPM6je základem těchto zajímavých fenotypů.
Několik mechanismů stimuluje sekreci reninu z buněk JG, aby se udrželakrevní tlak. Mezi nimi je vstup z renálních sympatických neuronů považován za hlavní roli při augmentacikrevní tlakběhem aktivního období cirkadiánních variací32. Tyto neurony vylučují noradrenalin, který se váže na a aktivuje -AR na JG buňkách, aby stimuloval produkci cAMP, což nakonec vede k sekreci reninu1732. V našich experimentech s použitím ledvinových plátků získaných zTrpm6-deficientní myši, stimulace isoproterenolem, agonistou -AR, nevykazovala žádný účinek na sekreci reninu, zatímco stimulace PGE2 nebo db-cAMP účinně zvýšila sekreci reninu (obr. 4). PGE2 je vylučován macula densa v reakci na nízké hladiny Cl- v moči a aktivuje receptory EP2 a EP4 na buňkách JG, což, podobně jako aktivace -AR, nakonec stimuluje produkci cAMP40. Tyto výsledky tedy naznačují, že signalizace -AR je v buňkách JG selektivně zrušenaTrpm6-deficientní myši, bez ovlivnění downstream cAMP-zprostředkované signální dráhy. Imunofluorescence řezů myší ledviny a imunoblotování izolovaných JG buněk konzistentně odhalilo, že exprese -AR byla významně snížena v JG buňkáchTrpm6-deficientní myši (obr. 5). Taková snížená exprese -AR by měla způsobit, že JG buňky nebudou schopny vylučovat renin v reakci na stimulaci sympatického nervu během aktivního období, čímž se odstraní cirkadiánní variace hladiny reninu v krvi akrevní tlak. Je třeba poznamenat, že existuje studie využívající 1/ 2-AR knockout myší, která prokázala snížení cirkadiánníhokrevní tlakvariace jakoTrpm6-deficientní myši41. Připisovali to snížené lokomotorické aktivitě, ale zůstává možné, že snížená cirkadiánní variace reninové aktivity přispívá ke snížení cirkadiánní variace reninu.krevní tlake. Alternativně může neobvyklé pozadí jejich myší (smíšené pozadí C57BL6/J, 129 a VFB; použili jsme čisté pozadí C57BL6/) maskovat účinek -AR nakrevní tlakvariace; genetické pozadí je kritické pro cirkadiánníkrevní tlakvariace42.
cistanche kulturistika
Jak ztrátaTRPM6 (přechodný receptorový potenciál související s melastatinem 6)v buňkách DCT vede ke snížení exprese -AR v buňkách JG zůstala nepolapitelná. Experimenty s jinými typy buněk ukázaly, že exprese -AR je regulována různými molekulami, o nichž je známo, že zprostředkovávají mezibuněčnou signalizaci: Přidání glukokortikoidů do kultivačního média buněčné linie odvozené z vas deferens DDT1 MF-2 zvyšuje expresi -AR43. Také bylo hlášeno, že oxid dusnatý (NO) potlačil degradaci -AR v srdečních buňkách prostřednictvím S-nitrosylace GRK24. Mezi těmito molekulami je pozoruhodné, že NO je vylučován z renálních buněk macula densa, stimuluje JG buňky parakrinním způsobem ke zvýšení sekrece reninu45. Zatímco exprese nNOS, enzymu produkujícího NO v ledvinách, je omezena na buňky macula densa, jsou v přímém kontaktu s buňkami DCT, dalším segmentem renálního tubulu6. Je tedy možné, žeTrpm6-nedostatek v buňkách DCT vede ke snížené expresi -AR v buňkách JG ovlivněním produkce nebo uvolňování NO ze sousedních buněk macula densa.
Je známo, že JG buňky také komunikují s jinými buňkami vytvářením mezerových spojů s okolními buňkami, jako jsou mezangiální buňky, a přijímají Ca2 plus k potlačení sekrece reninu7. Ačkoli buňky JG a buňky DCT nejsou v přímém kontaktu, jsou stále blízko umístěné (odkaz 46 a obr. 3) a je možné, že tyto buňky využívají komunikaci pomocí mezerových spojů prostřednictvím intervenujících buněk, jako jsou mezangiální buňky; všechny tři typy buněk údajně exprimují Cx3747,48, izoformu konexinu, která oligomerizuje a tvoří mezerová spojení. Další analýza může identifikovat molekulu a cestu zodpovědnou za mezibuněčnou signalizaci mezi DCT a JG buňkami, což je důležité pro odhalení celkového mechanismu narušeného cirkadiánníhokrevní tlakvariace podleTrpm6-nedostatek.
vTrpm6-deficientní myši, cirkadiánní variace krevních hladin nejen reninu, ale i noradrenalinu zmizely. Aktivace systému renin-angiotenzin stimuluje uvolňování noradrenalinu do krevního oběhu29,30, a proto se zdá rozumné, že účinekTrpm6 (přechodný receptorový potenciál související s melastatinem 6)ablace hladin reninu a noradrenalinu v krvi byla podobná. Protože noradrenalin také působí na -AR buněk JG, aby podpořil sekreci reninu, předpokládá se, že tyto dvě molekuly tvoří smyčku pozitivní zpětné vazby, která vzájemně stimuluje sekreci. Je však třeba poznamenat, že výsledky experimentů s podáváním isoproterenolu explicitně ukazují defekt sekrece reninu (obr. 4), a zdá se tedy, že je primární příčinou ztráty cirkadiánní variace reninu i noradrenalinu.
Dosud byla vyvinuta a používána řada účinných léků k léčbě hypertenzních pacientů. Značný počet pacientů však vykazuje rezistenci ke konvenční léčbě, která používá kombinaci hlavních antihypertenziv s různými funkčními mechanismy4. Chirurgická denervace renálních sympatických neuronů pomocí endovaskulárních katétrů byla provedena na zkušebním základě k léčbě takové rezistentní hypertenze50. Jeho praktická účinnost při zlepšováníkrevní tlakkontrola byla kontroverzní51,52, ale nedávno publikované studie prokázaly významné sníženíkrevní tlakve srovnání s falešnými kontrolami53,54. Existují také smíšené výsledky o účinku renální denervace na cirkadiánní variacekrevní tlak. Některé zprávy ukázaly, že rozsahkrevní tlaksnížení renální denervací bylo větší během aktivních období53, ale jiní neuváděli žádnou změnu v cirkadiánních variacíchkrevní tlak55,56. Při analýze na laboratorních zvířatech naše operace renální denervace u myší potlačily cirkadiánní variacekrevní tlak(obr. 6). Podobné operace byly provedeny také na krysách, ale ani kontrolní krysy divokého typu nevykazují téměř žádný cirkadiánkrevní tlakv první řadě variace57,58, což ztěžuje hodnocení efektu operace. K objasnění dopadu renální denervace na cirkadiánní je zapotřebí více studiíkrevní tlakvariace, což by nám také pomohlo pochopit podrobnější mechanismuskrevní tlakdysregulace tímTrpm6-nedostatek.
Telemetrická měřeníkrevní tlaksrdeční frekvence a pohybová aktivita. Telemetrická měřeníkrevní tlakbyly provedeny následovně4.Krevní tlakpřevodníky (TAl1PA-C10, Data Sciences International) byly chirurgicky vloženy do levé společné karotidy 2- 3-měsíčním myším v anestezii (intraperitoneálním podáním 0,3 mg/ kg medetomidinu, 4 mg/kg midazolamu a 5 mg/kg butorfanolu). Po 3 týdnech zotavení, systolický a diastolickýkrevní tlakhodnoty byly zaznamenávány s 2-min plánovaným vzorkováním každých 60 minut pomocí softwaru Dataquest ART (Data Sciences International). Záznamy byly získány po dobu alespoň pěti po sobě jdoucích dnů a průměry měření provedených každý den ve stejnou dobu byly stanoveny pro každou myš a použity pro další statistické analýzy, s výjimkou doplňkového obr. 4. Na základě Nakamori et al.68, renální denervace byla provedena 2 týdny před zavedenímkrevní tlakpřevodníky následovně. Ledviny byly exponovány abdominální incizí a byla vypreparována pojivová tkáň kolem ledvinových cév. Poté byly ledvinové cévy ponořeny do 95% ethanolu na 2 minuty a poté do PBS na 2 minuty. Falešná operace byla provedena za použití ekvivalentního postupu bez ponoření do ethanolu. Aliskiren byl podáván v dávce 25 mg/kg/den subkutánním zavedením osmotické pumpy (10}04, ALZET) a záznam byl zahájen den po zavedení pumpy. Pro suplementaci hořčíku byly myši krmeny hořčíkem obohacenou stravou obsahující 0,6 procenta hořčíku (CLEA Japan) po dobu 1 měsíce předkrevní tlakměření.
Srdeční frekvence byla měřena stejným radiotelemetrickým systémem, kromě toho, že záznam byl prováděn s 30-s naplánovaným odběrem každou minutu a pro další analýzu bylo použito jediné měření.
Pohybové aktivity byly hodnoceny za použití stejného radiotelemetrického systému sledováním změn síly signálu z převodníku v důsledku lokomoce zvířete. V tomto případě byly snímače chirurgicky zavedeny do podkožního prostoru v pravém boku. Záznamy byly prováděny ve stejných časových intervalech, jak je popsáno výše.
cistanche kulturistika
Reference
1. Giles, TDCirkadiánní rytmuskrevní tlaka vztah ke kardiovaskulárním příhodám.J. Hypertens. 24, S11-S16 (2006).
2. Smolensky, MH, Portaluppi, F.& Hermida, RC inKrevní tlakMonitoring in Cardiovascular Medicine and Therapeutics, 3rd EDT.(eds White, WB)Part II, Cha.6, 105-128(Springer,2016).
3. Witteman, JCet al. Prospektivní studie nutričních faktorů a hypertenze u amerických žen. Circulation 80,1320-1327(1989).
4. Ascherio, A. et al. Prospektivní studie nutričních faktorů a hypertenze u mužů v USA. Circulation 86,1475-1484 (1992).
5. Ascherio, A. et al. Prospektivní studie nutričních faktorů,krevní tlaka hypertenze u amerických žen. Hypertenze 27,1065-1072(1996).
Poznámka:výše uvedené není úplný seznam referencí
