Část Ⅰ Adjuvantní hodnota přípravku Herba Cistanches při použití v kombinaci se statinem u myších modelů

Elaine Wat, Chun Fai Ng, Chi Man Koon, Cheng Zhang, Si Gao, Brian Tomlinson & Clara Bik San Lau

1 Institut čínské medicíny, Čínská univerzita v Hong Kongu, Shatin, New Territories, Hong Kong.

2 Státní klíčová laboratoř fytochemie a rostlinných zdrojů v západní Číně, Čínská univerzita v Hong Kongu, Shatin, New Territories, Hong Kong.

3 Divize klinické farmakologie, Oddělení medicíny a terapie, Čínská univerzita v Hong Kongu, Shatin, New Territories, Hong Kong. Elaine Wat a Chun Fai Ng přispěly k této práci stejnou měrou. Korespondenci a žádosti o materiály zasílejte na CBSL (e-mail: claralau@cuhk.edu.hk)

Další informace: emily.li@wecistanche.com

Kliknutím sem získáte více informací o Cistanche

Abstraktní

Je dobře známo, že statiny mají problémy se svalovou toxicitou.HerbaCistanches(HC) je čínská bylina tradičně používaná při bolestech beder a kolen. Naše předchozí studie in vitro naznačila, že by mohl chránit před svalovou toxicitou vyvolanou statiny. Jeho ochranný účinek in vivo však nebyl nikdy zkoumán. Cílem této studie bylo zjistit, zda vodný extraktHerbaCistanche(HCE) by mohla zabránit svalové toxicitě vyvolané simvastatinem u potkanů ​​a zda by Herba Cistanche E mohla také vykazovat příznivé účinky na snížení hypercholesterolemie vyvolané vysokým obsahem tuků a zvýšeného jaterního cholesterolu, a tím snížit dávku simvastatinu při použití v kombinované terapii. Z našich výsledků vyplývá, že Herba Cistanche E významně obnovila simvastatinem indukovanou redukci svalové hmotnosti a snížila zvýšenou plazmatickou kreatinkinázu u potkanů.HerbaCistancheE také zlepšila simvastatinem indukované snížení hladiny svalového glutathionu, potenciál svalové mitochondriální membrány a snížilo simvastatinem indukovaný svalový zánět. Kromě toho by HCE mohla způsobit snížení hmotnosti jater, celkových hladin jaterních lipidů a hladin lipidů v plazmě u myší s vysokým obsahem tuku. Závěrem, naše studie poskytla in vivo důkaz, žeHerba CistancheE má potenciální ochranné účinky na toxicitu vyvolanou simvastatinem ve svalech a také příznivé účinky na nealkoholické ztučnění jater vyvolané dietou a hyperlipidémii, pokud se používá samostatně nebo v kombinaci se simvastatinem ve snížené dávce.

Inhibitory HMG-CoA reduktázy, také známé jako statiny, jsou dobře zdokumentovány jako přínosné pro hypercholesterolemické pacienty se středním a vysokým rizikem kardiovaskulárních onemocnění1. Statiny, jedna z nejprodávanějších tříd léků na předpis na světě, působí prostřednictvím inhibice redukce HMG-CoA na kyselinu mevalonovou během rané fáze mevalonátové dráhy, aby se snížila endogenní syntéza cholesterolu2, 3. Ačkoli jsou statiny obvykle dobře tolerovány , jedním z nejdůležitějších a nejznámějších klinických nežádoucích účinků jsou abnormality kosterního svalstva, které se mohou pohybovat od benigní myalgie až po těžkou myopatii4, 5. Ve velkém průzkumu na 10 409 francouzských subjektech provedeném prostřednictvím telefonického rozhovoru bylo 10 procent pacientů dostávajících léčba statiny hlásila svalové symptomy, z nichž 30 procent těchto symptomatických pacientů vedlo k přerušení léčby6. National Lipid Association Statin Safety Task Force poskytla doporučení pro léčbu svalových symptomů u pacientů podstupujících léčbu statiny. Obecně se doporučuje u pacientů se závažnými příznaky, jako je zvýšená kreatinkináza (CK) více než 5× ULN, podávání statinů, dokud se hladina CK opět nenormalizuje5. Vzhledem k výskytu těchto vedlejších účinků a vzhledem k tomu, že neexistuje žádná účinná léčba svalové toxicity vyvolané statiny, existuje potřeba hledat nové terapie pro léčbu svalových problémů vyvolaných statiny.

Zatímco je navržena směs mechanismů, které by mohly být odpovědné za nepříznivé účinky statinu, předpokládá se, že mitochondriální mechanismy se podílejí na nežádoucích účincích statinu na svalovou toxicitu1. Mevalonát není jen prekurzorem cholesterolu, ale je také prekurzorem důležitých sloučenin, jako jsou selenoproteiny, dolichol a ubichinon7, 8. Statin může down-regulovat selenoprotein, jako je glutathionperoxidáza (GPx), čímž snižuje hustotu antioxidantů a přispívá k jeho nepříznivým účinkům. efekty 4. Statiny by také mohly vést k depleci ubichinonu, což by způsobilo sníženou spotřebu kyslíku a syntézu ATP9. Kromě toho zvyšující se studie in vitro a in vivo prokázaly, že statin by mohl také působit přímo na tkáňové mitochondrie způsobující zvýšené reaktivní formy kyslíku (ROS) a mitochondriální oxidační stres, což vede k buněčné smrti, a tím přispívá k poškození jater a svalů10, 11.

HerbaCistanches, celá sušená rostlina zCistanchedeserticolaYC Ma (čeleď Orobanchaceae), jsou parazitické rostliny, které rostou převážně v pouštních oblastech severní a severovýchodní Číny12. Podle teorie čínské medicíny má Herba Cistanches chuť sladké, teplé a slané13. Jedná se o Yang povzbuzující čínské tonikum, které se primárně používá k léčbě nedostatku ledvin s příznaky, jako je impotence, neplodnost, předčasná ejakulace. Je to také čínská bylina, která se tradičně předepisuje pacientům při bolestech beder a kolen a běžně se používá v čínských přípravcích pro léčbu svalových problémů12, 14. Je zajímavé, že to je také v souladu s moderními vědeckými studiemi, které prokázaly anti -únavové aktivity extraktu Herba Cistanches bohatého na polysacharidy a fenylethanoidy u potkanů ​​po cvičení snížením poškození svalů a zlepšením ukládání ATP15. Kromě toho nedávná práce ukázala, že methanolový extrakt z Herba Cistanches by mohl zvýšit mitochondriální tvorbu ATP16.HerbaCistanchesbylo také prokázáno, že je silným antioxidantem a lapačem volných radikálů v různých orgánech, snižuje oxidační stres a aktivity ROS in vivo studií17, 18. V nedávné studii provedené naší laboratoří jsme prokázali, že našeHerbaCistanchesvodný extrakt významně zabránil toxicitě vyvolané simvastatinem v buňkách kosterního svalstva L6, stejně jako na dávce závislému obnovení snížení produkce ATP v buňkách L6 vyvolané simvastatinem, což naznačuje potenciálHerbaCistanchesvodný extrakt v ochraně proti svalové toxicitě vyvolané statiny19. Nicméně důkazy in vivo chybí.

Proto jsme to předpokládaliHerbaCistanchesvodný extrakt (HCE) by mohl mít příznivé účinky na svalovou toxicitu vyvolanou simvastatinem. Cílem této studie tedy bylo zjistit, zda by použití HCE mohlo snížit svalovou toxicitu vyvolanou simvastatinem pomocí in vivo zvířecího modelu, a navíc, zda by HCE mohla mít také příznivé účinky na snížení hypercholesterolémie vyvolané dietou s vysokým obsahem tuků a zvýšeného cholesterolu v játrech. , čímž se sníží dávka užívaného simvastatinu.

Materiály a metody

Autentizace a extrakce rostlinných materiálů.

Rostlinný materiál zHerbaCistanches(Cistanche deserticola, pocházející z Vnitřního Mongolska) byla zakoupena od Zi Xin, renomovaného dodavatele v Guangzhou, Čína. Herba Cistanches byla chemicky ověřena pomocí chromatografie na tenké vrstvě a ultravýkonné kapalinové chromatografie v souladu s Čínským lékopisem 201013, jak bylo popsáno dříve19, sverbascosideaechinakosid(zakoupeno od Národního institutu pro kontrolu farmaceutických a biologických produktů, Čína) jako chemické markery. Po chemické autentizaci, herbářový poukazový vzorekHerbaCistanchesbyl uložen v Muzeu Institutu čínské medicíny na Čínské univerzitě v Hongkongu pod číslem kupónu 2014-3434.

HerbaCistanchesvodný extrakt byl připraven jak bylo popsáno dříve19. Stručně řečeno, 1 kg surové byliny se namočil po dobu 1 hodiny, poté se dvakrát extrahovalo zahříváním po dobu 1 hodiny pod zpětným chladičem při 100 stupních za použití 10x destilované vody. Vodné extrakty (HCE) byly poté spojeny a zfiltrovány a filtrát byl zahuštěn za sníženého tlaku při 60 stupních. Koncentrovaný extrakt byl lyofilizován do sucha. Procento výtěžku bylo 50,1 procenta w/w. Veškerý extrahovaný prášek byl vakuově zabalen a skladován až do použití.

Pokusná zvířata.

Simvastatin byl zakoupen od SR Pharmasolutions Ltd. Samci krys Sprague Dawley (180–200 g) a samci myší C57Bl/6J (ve věku 8-týden) byli dodáni Centrem laboratorních zvířat, Čínská univerzita v Hong Kongu. Pokusy na zvířatech byly schváleny Etickou komisí pro experimentování na zvířatech Čínské univerzity v Hong Kongu (Ref. č. 12/074/MIS). Všechny experimentální metody byly prováděny podle schválených pokynů specifikovaných Etickou komisí pro experimentování na zvířatech Čínské univerzity v Hong Kongu. Všechny krysy (3 zvířata na klec) a myši (5 zvířat na klec) byly umístěny v normálních standardních klecích při konstantní teplotě 21 stupňů s 12-hodinovým cyklem světlo-tma. Každá standardní klec obsahovala osiku jako materiál podestýlky. Všem zvířatům byl umožněn ad libitum přístup ke stravě a vodě.

Studie statiny indukované svalové toxicity u potkanů.

Všichni potkani byli náhodně rozděleni do 5 skupin (n=5–10). Všechna zvířata byla na normální stravě. Také jim byla denně podávána destilovaná voda nebo simvastatin a intragastricky s léčbou HCE nebo bez ní. Zvířatům, u kterých se vyžaduje podávání simvastatinu i HCE, byl HCE podáván 3 hodiny po podání simvastatinu, aby se zabránilo jakékoli přímé chemické interakci bylina-lék. Bylinný extrakt nebo simvastatin byl rozpuštěn v 0,5% methylcelulóze v destilované vodě o známé koncentraci. Každému zvířeti byl intragastricky podán předem vypočítaný objem podle hmotnosti jedince tak, aby vypočítaný objem obsahoval požadované množství navrhované dávky. Podrobnosti o těchto skupinách jsou následující:

Skupina a) Normální strava plus destilovaná voda (normální kontrolní skupina)

Skupina b) Normální strava plus simvastatin (640 mg/kg)

Skupina c) Normální strava plus simvastatin (640 mg/kg) plus nízká dávka HCE (1,1 g/kg zvířete)

Skupina d) Normální strava plus simvastatin (640 mg/kg) plus vysoká dávka HCE (2,2 g/kg zvířete)

Skupina e) Normální strava plus vysoká dávka HCE (2,2 g/kg zvířete)

Denně byl zaznamenáván příjem potravy a dvakrát týdně byla měřena tělesná hmotnost. Léčba byla podávána po dobu 4 týdnů. Poté byla zvířata anestetizována pomocí směsi ketaminu (100 mg/kg) a xylazinu (10 mg/kg) intraperitoneálně. Krev byla odebrána srdeční punkcí a nechala se srazit. Plazma byla poté oddělena centrifugací (3, 000 rpm po dobu 10 minut). Různé svaly (quadriceps, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior a extensor digitorumlongus) byly vyříznuty a skladovány při teplotě -80 stupňů až do analýzy.

Měření plazmatické kreatinkinázy. Plazmatická kreatinkinázová (CK) aktivita byla stanovena pomocí soupravy Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, USA) podle pokynů výrobce.

Měření svalové glutathionperoxidázy. Svalová glutathionperoxidáza (GPx) byla měřena pomocí komerčně dostupné soupravy (703102, Cayman Chemical, USA) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, svalové tkáně byly opláchnuty PBS při pH 7,4, aby se odstranily všechny červené krvinky, a homogenizovány v 5–10 ml studeného lyzačního pufru, poté byl homogenát centrifugován při 10,000 g po dobu 15 minut při 4 stupních. Supernatant byl poté odstraněn a testován na aktivitu GPx za použití komerční soupravy.

Příprava svalových mitochondriálních a cytosolických frakcí. Mitochondriální a cytosolové frakce ze svalových vzorků byly připraveny pomocí Mitochondria Isolation Kit (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, vzorky čerstvé svaloviny byly předem ošetřeny extrakčním máslem, nakrájeny na malé kousky a homogenizovány v extrakčním pufru. Tkáňové homogenáty byly poté odstředěny. Supernatant byl shromážděn a rezervován pro analýzu cytosolové frakce. Mitochondriální pelety byly poté promyty a znovu odstředěny a použity pro analýzu mitochondriálních frakcí.

Měření svalových mitochondriálních reaktivních druhů kyslíku (ROS). ROS bylo měřeno protokolem upraveným z předchozí literatury20. Stručně, ROS byla měřena z mitochondriální frakce (50 ug proteinu/ml) pomocí roztoku DCFDA (C6827, Invitrogen, USA). Směs byla inkubována při 37 stupních po dobu 10 minut ve tmě, poté byla inkubována s roztokem substrátu (10 mM pyruvát, 15 mM malát) pro fotoaktivaci. Intenzita fluorescence byla měřena každých 5 minut po dobu 60 minut pomocí BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader při excitaci 485 nm a emisi 520 nm. Pro měření tvorby ROS byly vypočteny intenzity fluorescence.

Svalový mitochondriální membránový potenciál. Mitochondriální membránový potenciál mitochondriální frakce ze svalových vzorků byl stanoven podle protokolu výrobce (MITOISO, Sigma-Aldrich Corporation, USA). Tento postup je test s pevným bodem měřící příjem JC-1 s tvorbou J-agregátů. Stručně, mitochondriální suspenze byla naředěna tak, aby obsahovala 20 ug proteinu a byla inkubována s JC-1 barvivem po dobu 7 minut při teplotě místnosti. Tato 7-minuta je doba optimalizovaná a ověřená výrobcem za použití různých sloučenin (jak je uvedeno v protokolu výrobce), protože pozorovaná fluorescence roztoku po 5–10 minutách stoupne na plató a následuje drastický pokles fluorescence JC{10}} v důsledku vyrovnání koncentrací JC{11}} uvnitř a vně mitochondriální matrice. Intenzita fluorescence byla měřena pomocí BioRad Fluostar Optima 413-101 BMG Fluorescent Microplate Reader při 490nm excitaci a 590nm emisi. Pro měření potenciálních gradientů byly vypočteny intenzity fluorescence.

Svalová histologie a hodnocení zánětu. Imunohistochemie zánětlivých buněk ve svalech byla hodnocena barvením CD68 a CD163, jak bylo popsáno dříve21–23. Parafn řezy 5 μm byly nařezány a přilepeny na sklíčka Superfrost™ Plus (Menzel-Gläser, Německo). Primární myší anti-krysí CD68, ED1 a CD163 protilátky, ED2, (Bio-Rad, USA) byly aplikovány na řezy v ředění 1:100. Specifické barvení bylo detekováno systémem EnVision™ Systems (Dako, Dánsko) s použitím sekundární protilátky, EnVision-HRP polymer-konjugovaný anti-myší IgG v ředění 1:200, a detekován pomocí roztoku DAB (Dako, Dánsko). kontrastním barvením hematoxylinem. Řezy byly poté upevněny v dibutylftalátu v histonu (DPX). Přítomnost neutrofilů ve svalech byla detekována pomocí kvantitativní imunohistochemie pomocí softwaru ImageJ.

Analýza svalové genové exprese. PCR test, který profiluje geny související s oxidačním stresem, byl proveden pomocí Rat Oxidative Stress and Antioxidant Defense PCR-arrays (PARN-065Z, SABiosciences, Frederick, USA). PCR pole bylo provedeno podle pokynů výrobce. Stručně, celková RNA byla izolována selektivní vazbou na membránu na bázi silikagelu po lýze a homogenizaci svalových vzorků v denaturačním guanidinthiokyanátovém pufru (RNeasy kit, Qiagen). RNA byla reverzně transkribována do cDNA pomocí RT2 First Strand Kit (SABiosciences, Frederick, USA). Tato cDNA byla poté přidána do RT2 SYBR Green qPCR Master Mix (SABiosciences, Frederick, USA). Dále byl každý vzorek rozdělen na alikvoty na potkaních polích pro oxidativní stres a antioxidační obranu (SABiosciences, Frederick, USA). Všechny kroky byly provedeny podle protokolu výrobce.

Studie hyperlipidemie a jaterní steatózy u myší vyvolané dietou s vysokým obsahem tuku.

Všechny myši byly náhodně rozděleny do 5 skupin (n=8–10) a obdržely následující: Skupina a) Dieta s normální stravou (tabulka 1); Skupiny b až e) Strava s vysokým obsahem tuku (obsahuje 21 procent tuku a 0,15 procent cholesterolu) (tabulka 2). Po dobu 8 týdnů byla zvířatům podávána dieta k vyvolání obezity. Po 8 týdnech byla všem skupinám s vysokým obsahem tuků podávána destilovaná voda nebo simvastatin denně a nebo léčba HCE intragastricky, 3 hodiny po podání simvastatinu. Bylinný extrakt nebo simvastatin byl rozpuštěn v 0,5% methylcelulóze (Sigma-Aldrich Corporation, USA) v destilované vodě o známé koncentraci. Každému zvířeti byl intragastricky podán předem vypočítaný objem podle hmotnosti jedince tak, aby vypočítaný objem obsahoval požadované množství navrhované dávky. Podrobnosti o těchto skupinách jsou následující:

Skupina a) Normální strava plus destilovaná voda

Skupina b) Strava s vysokým obsahem tuku plus destilovaná voda

Skupina c) Dieta s vysokým obsahem tuku plus simvastatin (50 mg/kg)

Skupina d) Dieta s vysokým obsahem tuku plus HCE (4,4 g/kg)

Skupina e) Dieta s vysokým obsahem tuků plus simvastatin (25 mg/kg) plus HCE (4,4 g/kg)

Denně byl zaznamenáván příjem potravy a dvakrát týdně byla měřena tělesná hmotnost. Na konci 16-týdenní studie byly všechny myši usmrceny po 16-hodině nočního půstu. Zvířata byla anestetizována směsí ketaminu (100 mg/kg) a xylazinu (10 mg/kg) intraperitoneálně. Krev byla odebrána srdeční punkcí a nechala se srazit. Plazma byla oddělena centrifugací (3, 000 rpm po dobu 10 minut). Játra byla vyříznuta a skladována při -80 stupních až do analýzy.

Měření plazmatických a jaterních lipidů.

Plazmatické koncentrace triglyceridů, cholesterolu (11488872216 a 11489232216, Roche Diagnostics, Švýcarsko), lipoproteinového cholesterolu s vysokou a nízkou hustotou (HDL-C typu L a LDL-C typu L, Wako Pure Chemicals Industries, Japonsko) byly měřeny enzymatické metody za použití komerčně dostupné soupravy podle pokynů výrobce. Plazmatická kreatinkinázová (CK) aktivita byla stanovena pomocí soupravy Stanbio CK Liqui-UV® (2910-430, Stanbio Laboratory, USA). Celkové jaterní lipidy byly stanoveny gravimetricky po extrakci metodou Bligh a Dyer24. Jednotlivé jaterní lipidy byly kvantifikovány enzymaticky (jak je popsáno výše) po solubilizaci v isopropanolu (Sigma-Aldrich, USA)25.

Histopatologie jater a hodnocení zánětu. Barvení hematoxylinem a eosinem (barvení H&E). Řezy klíšťat (5 μm) tkáně zalité v parafínu byly nařezány mikrotomem a umístěny na mikroskopická sklíčka SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, USA). Řezy byly podrobeny barvení H&E podle metody Harris et al. 26 a připevněné dibutylftalátem v histonu (DPX) (Sigma-Aldrich, USA)25.

Mac{0}} barvení a kvantifikace. Silné řezy (5 μm) tkáně zalité v parafínu byly nařezány pomocí mikrotomu a umístěny na mikroskopická sklíčka SuperFrost Plus® (Thermo Scientific, USA). Bylo provedeno vyhledání antigenu, následované blokováním pomocí Peroxidase Block (Dako Cytomation, Dánsko). Primárně purifikovaná anti-myší Mac-3 protilátka (BD Pharmingen, USA) byla aplikována na řezy v ředění 1:50. Specifické barvení bylo detekováno pomocí EnVision™ Systems (Dako, Dánsko). Sklíčka byla inkubována se sekundární protilátkou, EnVision-HRP polymer-konjugovaný anti-králičí IgG v ředění 1:200. Mac-3 byl detekován pomocí roztoku DAB (Dako, Dánsko) a kontrastně obarven hematoxylinem. Sekce byly poté namontovány v DPX. Přítomnost makrofágů v játrech byla detekována pomocí kvantitativní imunohistochemie pomocí softwaru ImageJ.

Statistická analýza. Rozdíly mezi léčebnými a kontrolními skupinami byly testovány jednocestnou analýzou rozptylu (ANOVA), následovanou posthoc Bonferroniho vícenásobným srovnávacím testem. Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí GraphPad Prism verze 6.0 (GraphPad, USA). Pravděpodobnost p<0.05 would="" be="" considered="" statistically="">

Výsledek

ÚčinekHerbaCistancheE na simvastatinem indukovanou svalovou toxicitu u potkanů. Měření svalové hmotnosti a plazmatické kreatinkinázy. Ze všech léčených potkanů ​​bylo izolováno pět různých typů svalů (quadriceps, gastrocnemius, soleus, tibialis anterior a extensor digitorum longus). Účinky různých léčebných postupů na svalovou hmotnost jsou znázorněny na obr. 1a. Simvastatin (640 mg/kg) vyvolal významnou redukci hmotnosti čtyřhlavého svalu, m. gastrocnemius a předního tibialisového svalu u potkanů, zatímco tato snížení byla významně obnovena pomocí HCE na m. quadriceps a m. gastrocnemius v závislosti na dávce. AčkoliHerbaCistancheE projevil trend k obnovení hmotnosti tibialis anterior svalu u potkanů ​​léčených simvastatinem, žádná z těchto léčených skupin nedosáhla statistické významnosti. Nebyl pozorován žádný významný účinek léčby samotným HCE na svalovou hmotnost ve srovnání s kontrolními potkany (obr. la).

Obrázek 1b ukazuje účinky různých způsobů léčby na hladiny plazmatické kreatinkinázy (CK) u potkanů. Simvastatin indukoval významné zvýšení aktivity kreatinkinázy u potkanů, které bylo významně sníženo souběžnou léčbou HCE v obou dávkách. Rovněž nebyl zjištěn žádný významný účinek léčby samotným HCE na hladiny CK ve srovnání s kontrolní skupinou. Vzhledem k tomu, že se gastrocnemius jevil jako citlivý na léčbu simvastatinem a jedná se o největší sval izolovaný podle hmotnosti, vybrali jsme tento sval pro další analýzu včetně měření svalové glutathionperoxidázy (GPx), měření mitochondriálních MMP a ROS a svalové histologie a hodnocení zánětu .

Měření svalové glutathionperoxidázy (GPx). Hladiny svalové glutathionperoxidázy byly měřeny a ukázány na obr. 2a. Podávání simvastatinu vyvolalo trend snížení měření svalové glutathionperoxidázy (GPx) u potkanů. HCE však vykazovala trend ke zmírnění simvastatinem indukovaného snížení svalového GPx v obou dávkách 1,1 g/kg a 2,2 g/kg. Ve srovnání s normálními kontrolními krysami také nebyl žádný významný účinek léčby samotným HCE na hladiny svalového GPx.

Mitochondriální membránový potenciál (MMP) a měření ROS. Léčba simvastatinem (640 mg/kg) vyvolala významné snížení svalové MMP (obr. 2b). Toto snížení se zlepšilo v závislosti na dávce u potkanů, kteří dostávali souběžnou léčbu HCE a simvastatin (obr. 2b). Na druhé straně je zajímavé, že skupina léčená samotným simvastatinem měla významně snížené hladiny svalového mitochondriálního ROS ve srovnání s normální kontrolní skupinou (obr. 2c). Nicméně léčba HCE podávaná potkanům léčeným simvastatinem vykazovala trend závislý na dávce k obnovení hladin svalových mitochondriálních ROS na normální úroveň. Nebyl také žádný významný účinek léčby samotným HCE u potkanů ​​ve srovnání s normální kontrolní skupinou pro měření mitochondriální MMP i ROS.

Svalová histologie a hodnocení zánětu. Gastrocnemius svaly od krys, kterým byla podávána různá léčba, byly dále analyzovány histologicky a reprezentativní obarvené řezy jsou ukázány na obr. 3a. Zvířata kontrolní skupiny prokázala histologické řezy normálních svalů. Naproti tomu řezy H&E ze zvířat léčených simvastatinem odhalily infiltraci zánětlivých markerů (žluté šipky), která byla významně snížena u těch svalových řezů potkanů, kterým byla podávána kombinace simvastatinu a HCE. Imunohistochemické analýzy byly také provedeny na přítomnost makrofágů CD68 a CD163 na obr. 4a a 5a, v daném pořadí, s kvantifikací příslušných makrofágů ukázanými na obr. 4b a 5b. Imunohistochemická analýza svalových řezů odhalila přítomnost makrofágů (CD68) u potkanů ​​léčených simvastatinem (hnědé zbarvení), které bylo významně sníženo u potkanů, kterým byla podávána souběžná léčba HCE v obou dávkách (obr. 4b). U zvířat léčených samotným HCE také nebyl pozorován žádný významný zánět. Podobně imunohistochemická analýza svalových řezů odhalila přítomnost CD163-pozitivních makrofágů u potkanů ​​léčených simvastatinem (hnědé zbarvení), které bylo významně sníženo u potkanů, kterým byla podávána souběžná léčba HCE v dávce 2,2 g/kg (obr. 5b ). U zvířat léčených samotným HCE také nebyl pozorován žádný významný zánět.

Analýza svalové genové exprese. Pro stanovení účinků simvastatinu a HCE na geny související s oxidačním stresem ve svalu byl proveden PCR test, který profiluje geny související s oxidačním stresem, pomocí potkaního oxidačního stresu a antioxidační obrany PCR-polí. Geny, které byly významně ovlivněny léčbou simvastatinem, byly analyzovány a uvedeny na obr. 6. Pro profil exprese genů regulujících antioxidanty krysy léčené simvastatinem (640 mg/kg) zvýšily expresi genů regulujících antioxidanty. Tese zahrnuje glutathionperoxidázy (GPx) GPx1 a GPx7 a další peroxidázy včetně Serpinb1b a club (obr. 6a). HCE v obou dávkách (1,1 nebo 2,2 g/kg) snížila tato simvastatinem indukovaná zvýšení GPxs a dalších peroxidáz na normální hladiny. Na druhé straně samotná léčba HCE významně zvýšila hladiny exprese GPx1. Pokud jde o expresi genů regulujících metabolismus ROS, simvastatin významně indukoval expresi dalších genů metabolismu superoxidů, včetně Cyba, Ncf1, Ncf2, Scd1 a Ucp2. Podobně HCE v obou dávkách významně snížila tato zvýšení (obr. 6b). Dále simvastatin indukoval expresi genů reagujících na oxidační stres včetně Apoe, Ccl5 a Txn1, přičemž tyto exprese byly významně sníženy u zvířat současně léčených HCE v obou dávkách (obr. 6c). Na druhé straně simvastatin způsobil významné snížení genové exprese Txnip. Nebyl žádný významný účinek HCE na simvastatinem indukované snížení exprese genu Txnip (obr. 6c). Simvastatin také významně zvýšil expresi genů regulujících transportéry kyslíku včetně Slc38a1 a Vim. Současná léčba HCE snížila expresi těchto genů v obou dávkách (obr. 6d).

Účinky kombinovaného použití simvastatinu a HCE na příjem potravy a tělesnou hmotnost u myší. Obrázek 7a ukazuje denní příjem potravy myší pro všechny léčebné skupiny. Strava s vysokým obsahem tuků vyvolala u zvířat významné zvýšení denního příjmu potravy ve srovnání se zvířaty krmenými potravou (p<0.001). there="" was="" however="" no="" significant="" effect="" of="" the="" herb="" or="" drug="" treatments="" among="" all="" high-fat-fed="" groups="" (fig.="">

Týdenní měření tělesné hmotnosti. Po 16 týdnech krmení s vysokým obsahem tuků zvířata krmená HF významně přibrala více na váze než zvířata krmená potravou (obr. 7b). Mezi myšími krmenými HF a všemi léčebnými skupinami krmenými HF však nebyl žádný významný účinek. Nebyl také žádný významný rozdíl mezi HF-krmenými myšmi, které dostávaly souběžnou léčbu simvastatinem a HCE vs. HF-krmenými myšmi, které dostávaly HCE nebo léčbu samotným simvastatinem (obr. 7b).

Účinky kombinovaného použití simvastatinu a HCE na hyperlipidémii a steatózu jater u myší. Měření aktivity plazmatických lipidů a kreatinkinázy. Hladiny lipidů v plazmě u všech myší jsou uvedeny na obr. 8. Ve srovnání s normálními myšmi krmenými potravou měly myši krmené HF významně zvýšené hladiny celkového cholesterolu v plazmě (TC), které byly významně sníženy ve všech léčených skupinách (obr. 8a). . Myši krmené HF léčené simvastatinem a HCE měly významně nižší plazmatické TC ve srovnání se zvířaty se HF, kterým byl podáván simvastatin samotný, nebo HF zvířaty, kterým byl podáván HCE samotný (p<0.001 and=""><0.01, respectively)="" (fig.="" 8a).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" simvastatin="" alone="" treatment="" group,="" suggesting="" hce="" has="" comparable="" effects="" as="" simvastatin.="" besides,="" hf-fed="" mice="" also="" had="" significantly="" higher="" plasma="" triglyceride="" (tg)="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" a="" normal="" chow="" diet=""><0.05) (figure="" 8b).="" there="" was="" a="" trend="" for="" a="" reduction="" in="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" on="" plasma="" tg="" in="" hf-fed="" animals,="" though="" this="" did="" not="" reach="" statistical="" significance.="" however,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" significantly="" reduced="" plasma="" tg="" compared="" to="" control="" hf-fed="" animals=""><0.001 and=""><0.01, respectively).="" when="" comparing="" between="" simvastatin="" treatment="" alone="" group="" with="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" group,="" hce="" co-treatment="" with="" simvastatin="" had="">

nižší plazmatické TG ve srovnání s myšmi krmenými HF, kterým byl podáván samotný simvastatin (str<0.01) (fig.="" 8b).="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" between="" hf-fed="" mice="" receiving="" hce="" alone="" vs="" the="" simvastatin="" treatment="" group,="" though="" hce="" had="" a="" slightly="" better="" reduction="" in="" tg="" levels.="" in="" addition,="" high-fat-diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" high-density="" lipoprotein="" (hdl)="" cholesterol="" and="" plasma="" low-density="" lipoprotein="" (ldl)="" cholesterol="" in="" mice="" compared="" to="" normal="" chow-fed="" animals="" (fig.="" 8c="" and="" d).="" simvastatin="" treatment="" alone="" significantly="" reduced="" both="" lipids="" in="" high-fat-fed="" mice.="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment="" also="" significantly="" reduced="" both="" types="" of="" plasma="" lipids="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone.="" there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" both="" lipids="" among="" all="" treatment="" groups.="" figure="" 8e="" showed="" the="" effect="" of="" different="" treatments="" on="" plasma="" creatine="" kinase="" (ck)="" levels.="" interestingly,="" hf="" diet-induced="" significant="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels="" in="" mice="" compared="" to="" normal-chow-fed="" mice="" (fig.="" 8e).="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" the="" co-treatment="" of="" simvastatin="" significantly="" reduced="" plasma="" ck="" levels="" compared="" to="" mice="" given="" hf="" diet="" alone=""><0.01 and=""><0.01, respectively).="" simvastatin="" treatment="" alone="" also="" significantly="" reduced="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" plasma="" ck="" levels.="" there="" was="" also="" no="" significant="" difference="" in="" plasma="" ck="" levels="" among="" all="" active="" treatment="" groups="">měření lipidů v jádře.

Účinky různých léčebných skupin na hepatomegalii indukovanou HF (zvětšená játra) byly spojeny s významným snížením celkového obsahu lipidů v játrech, vyjádřeno jako miligramy lipidů na játra (obr. 9a). Celkový obsah jaterních lipidů byl významně vyšší u myší krmených HF ve srovnání s normálními myšmi krmenými potravou (3,{5}}krát vyšší, p<0.001). simvastatin="" exerted="" no="" significant="" effect="" on="" the="" high-fat="" diet-induced="" increase="" in="" total="" liver="" lipid.="" interestingly,="" hce="" significantly="" reduced="" such="" a="" diet-induced="" increase="" in="" liver="" lipid=""><0.05). on="" the="" other="" hand,="" simvastatin="" co-treatment="" with="" hce="" exerted="" a="" trend="" to="" reduce="" the="" liver="" lipid="" content="" though="" did="" not="" reach="" statistical="" significance="" (p="0.15)." however,="" when="" comparing="" the="" liver="" lipid="" content="" among="" all="" treatment="" groups,="" no="" significant="" difference="" was="" observed="" among="" all="">

Jak je znázorněno na obr. 9b a c, měření celkového jaterního cholesterolu (TC) a jaterních triglyceridů (TG) odhalilo, že myši krmené HF měly zvýšené hladiny obou lipidů ve srovnání s normálními myšmi krmenými potravou (tj. 3).{{4} }násobné zvýšení TC, str<0.001; and="" 3.4-fold="" increase="" in="" tg,=""><0.001). simvastatin="" treatment="" significantly="" reduced="" liver="" total="" cholesterol="" levels=""><0.05) but="" not="" triglyceride="" levels.="" on="" the="" other="" hand,="" hce="" treatment,="" with="" or="" without="" simvastatin="" co-treatment,="" significantly="" reduced="" both="" liver="" total="" cholesterol="" and="" triglyceride="" levels="" in="" high-fat-fed="" mice.="" when="" comparing="" the="" effects="" among="" all="" groups,="" we="" observed="" no="" significant="" difference="" in="" liver="" total="" cholesterol,="" but="" there="" was="" a="" significant="" reduction="" in="" liver="" tg="" for="" the="" hce="" treatment="" group="" as="" compared="" to="" the="" simvastatin="" treatment="" group="" (fig.="" 9b="" and="">

Hodnocení zánětu jater. Imunohistochemické barvení bylo provedeno za účelem barvení na přítomnost makrofágů (Mac-3) (obr. 10a). Imunohistochemická analýza řezů jater odhalila přítomnost Mac-3 jak u myší krmených vysokým obsahem tuku, tak u myší krmených normální potravou (hnědé zbarvení). Tento zánět byl dále zvýšen u zvířat léčených simvastatinem, ačkoli takové zvýšení nedosáhlo statistické významnosti. Je zajímavé, že léčba HCE, s nebo bez současné léčby simvastatinem, významně snížila zánět u myší s vysokým obsahem tuku. Při srovnání mezi všemi léčebnými skupinami měla léčba HCE, s nebo bez současné léčby simvastatinem také významně nižší zánět ve srovnání se skupinou léčenou simvastatinem (p<0.001 and=""><0.001, respectively).="" these="" data="" are="" also="" presented="" as="" percentage="" areas="" in="" fig.="">

Pokračovat ve čtení ...