Část 1: Echinakosid chrání před MPP + indukovanou neuronální apoptózou prostřednictvím regulace dráhy ROS / ATF3 / CHOP

Čching Čao1 • Siao-jen Jang2 • Dingfang Čai-3,4 • Ling Jie5,6 • Jü-čching Hou1 •

Lijun Zhang1 • Jiwei Cheng1 • Yuan Shen1 • Kaizhe Wang5 • Yu Bai1

Pls klikněte zde na část 2

druhy (ROS) rovněž přispívají k jeho rozvoji [3]. Charakteristiky podobné PD mohou být vyvolány několika toxiny v životním prostředí, včetně 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinu (MPTP), kyanidu, sirouhlíku a toluenu. MPTP je široce používán k indukci zvířecích modelů PD a jeho aktivní metabolit, 1-methyl-4- fenylpyridiniový iont (MPP?), se používá v buněčných modelech PD [4, 5]. MPP? selektivně inhibuje elektronový transportní řetězec a vede k nadměrné produkci ROS, čímž vyvolává neuronální smrt a syndrom připomínající PD [6]. Nedávné studie ukázaly, že MPP? indukuje více cest v modelu PD in vitro, včetně zvýšené fosforylace GSK3B (pY206) a akumulace a-synucleinu [5], upregulace heme oxygenázy-1/ni-nikotinamidadenindinukleotidfosfátoxidázy/osy ROS [7, 8], zvýšené exprese aktivního transkripčního faktoru 3 (ATF3) a zástavy růstu pomocí DNA indukovatelného proteinu 153 (GADD153)/C/EBP-homologního proteinu (CHOP) [9]. V klinické léčbě je potlačení produktů ROS jednou z nejdůležitějších strategií pro přežití neuronů a léčbu PD [1].

Echinakosid(ECH, obr. 1A), přírodnífenylethanoidnalezený v mnoha léčivých rostlinách, je hlavní složkoufenylethanoidGlykosidyizolované z tradiční čínské byliny,Cistanchesalsa [10]. Zajímavé je, že nedávné studie ukázaly, žeECHmá ochranné účinky v myším modelu PD indukovaného MPTP [10, 11].ECHtaké zmírňuje apoptózu buněk neuroblastomu vyvolanou faktorem nádorové nekrózy-a nebo 6-hydroxydopaminem in vitro [12, 13]. Mechanismy, kterýmiECHpodporuje přežití neuronů v MPP?-indukovaný PD buněčný model zůstává nejasný.

Ukázali jsme, žeECHvýrazně snížily produkty ROS vyvolané MPP? v buňkách SH-SY5Y.ECHtaké inhiboval MPP?-indukovanou expresi ATF3, CHOP a a-synucleinu, stejně jako potlačoval aktivaci pro-apoptózních proteinů kaspázy-3 a poly (ADP-ribózy) polymerázy (PARP).

Cistancheechinakosidmáneuroprotektivníúčinky

Materiály a metody

Činidla

Minimální esenciální médium (DMEM), fetální bovinní sérum, 0,25% trypsin, 1% penicilin/streptomycin a činidlo TRIzol byly od Life Technologies (Grand Island, NY). Chromatinové barvivo bisbenzimid (Hoechst 33342), poly-L-lysin, MPP? jodid a MPTP pocházely ze Sigmy (St. Louis, MO). Souprava pro stanovení peroxidace lipidů malondialdehydem (MDA) a dichlorfluorescein diacetát (DCFH-DA) pocházely z Beyotime Biotech (Haimen, Čína). ECH čistoty C98% pochází z Push Biotechnology (Chengdu, Čína).

Zvířata a ošetření

Údržba a léčba zvířat byla popsána výše [14]. Použili jsme samce myší C57BL/6 (Shanghai Laboratory Animal Co., Shanghai, Čína) o hmotnosti 24–26 g ve věku 10 týdnů. Zvířata byla udržována za standardních podmínek (12:12 h světlo: tmavý cyklus, 21 ± 2 ° C a relativní vlhkost 40%) a umožňovala přístup k jídlu a vodě ad libitum. Všechny postupy byly schváleny Etickou komisí pro zvířata nemocnice Zhongshan, Fudan University a provedeny v souladu s Národním institutem zdraví pro péči a použití

Laboratorní zvířata.

Myši byly náhodně rozděleny do čtyř skupin (10 myší/skupina): skupina A, kontrolní skupina vozidla, se stejným objemem (500 lL) normálního fyziologického roztoku (NS); skupina B, kontrolní skupina ECH, podávána 20 mg/kg ECH; skupina C, modelová skupina MPTP, předem ošetřená stejným objemem NS; a skupina D, skupina ošetřená ECH, předem ošetřená dávkou 20 mg/kgECH.ECHbyl rozpuštěn v NS a podáván intrastra gastrickým podáním každých 24 hodin po dobu 15 po sobě jdoucích dnů. Myší PD model pro skupiny C a D byl generován pěti po sobě jdoucími intraperitoneálními injekcemi 30 mg/kg MPTP každých 24 hodin od 11. do 15. dne. Myši byly usmrceny cervikální dislokací nebo perfuzí, která byla narkotizována 10% chloralhydrátem (3,6 mg/kg) intraperitoneálně 24 hodin po závěrečné léčbě.

Perfuze a zpracování tkání byly popsány dříve [14]. Po intrakardiální perfuzi byly vzorky mozku odebrány a fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 24 hodin při 4C, vloženy do parafínu a koronální řezy zahrnující celý SNc (stereotaktické souřadnice anteroposterior -3,64 až -2,92 mm vzhledem k bregmě) byly řezány na 5 lm.

Dalších 5 zvířat z každé skupiny bylo usmrceno cervikální dislokací a ventrální střední mozek byl rychle lyzován v 1% pufru lýzy SDS na ledu. Hladiny proteinů CHOP a ATF3 v lyzátu byly analyzovány pomocí western blottingu.

kidney injury and disease

Cistancheechinakosidmá za následek posíleníledvina

Kultura krysího ventrálního středního mozku (VM)

Dopaminergní neurony

Březí potkani Wistar byli zakoupeni od Shanghai Laboratory Animal Co. (Šanghaj, Čína). DA neurony ve VM byly izolovány v embryonálním dni 14. Virtuální počítač byl rozřezán a zpracován pro vytvoření primárních kultur neuronů DA virtuálního počítače, jak bylo popsáno dříve [15, 16]. Stručně řečeno, kousky tkáně byly shromážděny v ledově studeném Hanksově vyváženém solném roztoku (HBSS) a odstřeďovány při 1000 ot / min při 4 ° C po dobu 5 minut. Tkáňová peleta byla inkubována v 750 lL 0,1% trypsinu–HBSS po dobu 15 minut při teplotě 37 ° C s 5% CO2. Fetální telecí sérum (FCS; 750 lL) bylo použito k inaktivaci trypsinu a tkáně byly disociovány jemnou triturací

pomocí sterilizované Pasteurovy pipety. Buněčné suspenze byly odstřeďovány při 1000 ot /min po dobu 4 minut při 4 °C a znovu suspendovány v diferenciačním médiu (Dulbecco modifikované Eagle's medium/F12, 33 mmol/L D-glukóza, 1% L-glutamin a 1% FCS, doplněné 2% B27). Buňky byly naočkovány na poly-D-lysin (Sigma)-potažené 24-jamkové destičky tkáňových kultur při 5 9 104 buňkách/jamce v 500 lL diferenciačním médiu při 37C s 5% CO2 po dobu 10 dnů, aby se vyvinuly do

zralé DA neurony. Neurony VM DA byly charakterizovány imunofluorescencí s protilátkou anti-b-tubulin isotypu III a protilátkou tyrosin hydroxylázy (TH) (obr. S1). Buňky byly léčeny 1 mmol/l MPP?, 40 LG/ml ECH, kombinací MPP? a ECH nebo samotný PBS jako ovládací prvek. Životaschopnost buněk byla analyzována činidlem CCK-8 po 96 hodinách léčby.

a jsou prezentovány jako střední ± SD (n = 6; **P \0.01 vs kontrola, #P \ 0.05, ##P \0.01 vs MPP? léčba). C Světelné mikroskopické snímky morfologických změn vyvolaných MPP? nebo MPP? a ECH. a, kontrola PBS; b, 40 lg/ml ECH; c, 1 mmol/l MPP?; d, 1 mmol/l MPP? a 10 lg/ml ECH; e, 1 mmol/l MPP? a 20 lg/ml ECH; f, 1 mmol/l MPP? a 40 lg/ml ECH (měřítko, 200 lm).

11-

Cistanche echinakosid má účinek inhibice apoptózy

Sh-SY5Y buněčná kultura

Buňky SH-SY5Y pocházely z buněčné banky Šanghajského institutu buněčné biologie (Čínská akademie věd, Šanghaj, Čína) a kultivované v DMEM doplněné 10% fetálním bovinním sérem, 100 U / ml penicilinem a 100 U / ml streptomycinů. Buňky byly udržovány ve zvlhčeném 37C inkubátoru dodávaném 5% CO2. MPP? byl rozpuštěn ve sterilní vodě a okamžitě použit. ECH byl rozpuštěn v PBS. Pro zkoumání genové exprese související s ROS a hladin proteinů byly buňky nasazeny do 6jamkových destiček a kultivovány po dobu 24 hodin. Buňky pak byly krmeny čerstvým médiem obsahujícím MPP?, ECH, kombinací MPP? a ECH nebo samotný PBS jako ovládací prvek. Po 24 hodinách léčby byly buňky lyzovány 1% pufrem pro lýzu SDS (1% SDS,25 mmol/l EDTA, 45 mmol/l Tris–HCl, pH 6,5) pro analýzu western blot a celková RNA byla izolována přímo činidlem TRIzol.

K analýze distribuce ATF3 a CHOP po léčbě byly použity soupravy pro jaderná a cytoplazmatická extrakční činidla (Thermo Fisher, Waltham, MA) k extrakci cytoplazmatických a jaderných frakcí z léčivy ošetřených a kontrolních buněk.

Test životaschopnosti buněk

Buňky SH-SY5Y byly naočkovány do 96jamkových destiček a inkubovány přes noc. Buňky byly krmeny každých 24 hodin čerstvým kompletním médiem obsahujícím různé léky a udržovány po dobu 3 dnů. Poté byla životaschopnost hodnocena pomocí soupravy CCK8 cell counter kit (Dojindo, Japonsko). Data byla normalizována na výsledky kontroly PBS a jsou prezentována jako střední ± SD. Pro analýzu životaschopnosti v BUŇKÁCH ATF3-knockdown SH-SY5Y (ATF3 shRNA) a kontrolních (GFP shRNA) byly buňky přidány do 96jamkových destiček a kultivovány po dobu 14–16 h. Plazmidy SHRNA nebo GFP shRNA byly transfekovány do buněk SH-SY5Y pomocí Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Karlovy Vary, CA). Buňky byly ošetřeny MPP 1 mmol/l? nebo stejný objem PBS po 24 hodinách transfekce a poté byly inkubovány po dobu 3 dnů. Čísla buněk se počítala každý den. Údaje jsou prezentovány jako střední ± SD.

ShRNA konstrukce a Oligo Primers

pGV298-ATF3 shRNA (ATF3shRNA) a GFP kontrolní shRNA konstrukty byly od GeneChem Co. (Šanghaj, Čína). Cílová sekvence ATF3 byla 50-GCAAAGT G! CCGAAACAAGA-30 z dříve popsaných metod [17, 18]. Pro detekci genové exprese vyvolané MPP? byly pro qRT-PCR vybrány geny související se stresem ROS a PD a jako kontrola byla použita GAPDH. Všechny primery byly syntetizovány společností Sangon Biotech Co. (Šanghaj, Čína) a sekvence primerů jsou uvedeny v tabulce 1.

PCR v reálném čase

Celková RNA byla extrahována činidlem TRIzol podle pokynů výrobce. Reverzní transkripce a kvantitativní REAL-TIME PCR (qRT-PCR) byly provedeny tak, jak bylo popsáno výše. Reverzní transkripční reakce byla provedena pomocí sady RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo Scientific, Waltham, MA) podle pokynů výrobce. Pro qRT-PCR byla použita souprava SYB Premix Ex Taq II (TaKaRa, Dalian, Čína): 20-lL reakční systémy byly použity s ABI (Life Technologies, Carlsbad, CA). Parametry PCR zahrnovaly následující kroky: 95 ° C po dobu 3 minut, 1 cyklus; 95C pro 5 s a 60C pro 40 s, 40 cyklů. Konečné údaje byly nor-

moralizované na GAPDH a jsou prezentovány jako poměr k ovládání. Primery používané pro zesílení jsou uvedeny v tabulce 1.

Západní Blotting

Analýza Western blot byla provedena tak, jak bylo popsáno výše [19]. Primární protilátky byly protištěpená kaspáza 3 a p53 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-GAPDH (Proteintech Group, Chicago, IL), anti-GADD153/CHOP (Wanlei Bio, Shenyang, Čína) a anti-ATF3, anti-PARP, anti-PUMA a anti-histone 3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Sekundární protilátky značené křenovou peroxidázou pocházely z Jack-son Immune Research Laboratories (Western Grove, PA). PVDF membrány byly z EMD Millipore (Billerica, MA) a substrát ECL byl z CWBio (Suzhou, Čína). Relativní hladiny proteinů založené na úrovních šedi z obrázku byly analyzovány pomocí softwaru Tanon GIS (Tanon Biotech, Šanghaj, Čína) a data jsou prezentována jako poměr cílového proteinu k GAPDH.