ČÁST Ⅱ: SARS-CoV-2 Infekce u modelu syrského křečka způsobuje zánět, stejně jako dysregulaci interferonu I. typu v dýchacích i nerespiračních tkáních včetně srdce a ledvin

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Magen Ellen Francis, Una Goncin a kol.

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅰ

Abstraktní

COVID-19(koronavirové onemocnění 2019) způsobenéSARS-CoV-2(těžký akutní respirační syndrom koronavirus 2) infekce je onemocnění postihující několik orgánových systémů. Model, který zachycuje všechny klinické příznakyCOVID-19, stejně jako nemoc na dlouhé tratě, je potřeba. Zkoumali jsme reakce hostitele spojené s infekcí v několika hlavních orgánových systémech včetně dýchacího traktu, srdce aledvinypoSARS-CoV-2infekce u křečků syrských. Zjistili jsme významné zvýšení zánětlivých cytokinů (IL-6, IL-1beta a TNF) a interferonů typu II, zatímco interferony typu I byly inhibovány. Vyšetření mimoplicní tkáně ukázalo zánět vledvinajátra a srdce, které také postrádaly upregulaci interferonu typu I. Histologicky mělo srdce známky myokarditidy a mikrotrombůledvinaměl tubulární zánět. Tyto výsledky umožňují nahlédnout do multiorgánového onemocnění, které zažívají lidé sCOVID-19a možná prodloužené onemocnění u lidí s postakutními následkySARS-CoV-2(PASC). koronavirová 2)infekce může postihnout několik orgánových systémů včetně dýchacích cest, močových cest, neurologického systému a kardiovaskulárního systému. Chcete-li vhodně studovat toto onemocnění a vyhodnotit terapeutika, model, který zachycuje všechny klinické příznakyCOVID-19je požadováno. Je známo, že poškození, ke kterému dochází po virové infekci, je často způsobeno vlastní imunitní reakcí hostitele. Proto jsme zde zkoumali, jak jsou imunitní reakce hostitele regulovány v několika hlavních orgánových systémech, včetně dýchacího traktu, srdce aledvinypoSARS-CoV-2infekce u křečků syrských. Zjistili jsme významný nárůst zánětlivých cytokinů (IL-6, IL-1beta a TNF) a také antivirových cytokinů, nazývaných interferony typu I. Je zajímavé, že interferony typu I antivirové odpovědi byly inhibovány v dýchacím traktu. Vyšetření mimoplicní tkáně ukázalo zánět vledvinajátra a srdce, které také postrádaly upregulaci interferonu typu I. Histologicky mělo srdce známky myokarditidy a mikrotrombůledvinaměl tubulární zánět. Tyto výsledky umožňují nahlédnout do multiorgánového onemocnění, které zažívají lidé sCOVID-19a možná prodloužené onemocnění u lidí s postakutními následkySARS-CoV-2(PASC).

Click to Cistanche používá pro funkci ledvin

Infekce SARS-CoV-2 vede k významnému zánětu nebo imunitní regulaci v srdci, lymfatických uzlinách a slezině a také k eozinofilním signaturám v tlustém střevě

Imunitní markery zánětu, adaptivní imunity a antivirové odpovědi byly také hodnoceny v nerespiračních tkáních spolu s histopatologií tkání. Vyšetřili jsme mediastinální lymfatické uzliny, srdce,ledvinaslezina, játra a tlusté střevo pro regulaci imunitních cílů kategorizovaných jak výše podle IFN typu I, typu II/obecná odezva IFN a vrozených/adaptivních mediátorů (obr. 6), jakož i pro imunopatologii (obr. 7 a S4). Pokud počáteční hodnocení histopatologie naznačovalo zapojení specifických imunitních mechanismů (obr. S4), bylo provedeno skenování s vysokým rozlišením, aby se získala větší hloubka informací (obr. 7). Mediastinální lymfatické uzliny nebylo možné získat 15. den. Odpovídající významy pro genovou expresi lze nalézt v tabulce S2. Reakce IFN typu I a typu II ve všech mimoplicních orgánech kromě jater měly podobné regulační profily jako u plic a nosních skořepin (obr. 6). Genová regulace byla charakterizována sníženými odpověďmi typu I a zvýšením odpovědí typu II. STAT2 byl významně snížen v mediastinální lymfatické uzlině,ledvina, slezina a tlusté střevo. Srdce mělo významný a trvalý pokles IRF1, zatímco tlusté střevo mělo pokles IFN-beta (obr. 6). Naopak výrazné zvýšení IFN-gama bylo pozorováno v mediastinální lymfatické uzlině aledvinaa v menší míře v srdci a slezině. CXCL10, chemoatraktant T buněk, byl zvýšen na vysoké hladiny ve slezině, játrech a mediastinální lymfatické uzlině, kde byla regulace v lymfatické uzlině dvoufázová (obr. 6). Regulace vrozených/adaptivních mediátorových genů ve slezině a lymfatických uzlinách byla pozorována u všech zkoumaných imunitních cílů s výjimkou TGF-beta, IL-5R a CCR3, které nebyly účinně regulovány. Konkrétně významná regulace CD3, CD4, CD8A, IL-2, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL{{13 }} a IL-12 byla zaznamenána v těchto sekundárních imunitních orgánech. Regulace vrozených/adaptivních imunitních mediátorů byla zvláště zajímavá v srdci, kde IL-2, IL-10, IL-4 a IL-5 byly zvýšeny 100krát nad výchozí hodnotu . Nejvyšší upregulace zánětlivých cytokinů byla detekována v srdci následovaném ledvinami, játry a mediastinální lymfatickou uzlinou. V srdci byl IL-12 významně zvýšen brzy a spolu s TNF zůstal zvýšený 15. den pi. IL-6 a IL-1beta byly také přechodně indukovány v srdeční tkáni ve dnech 5 a 8 (obr. 6). Histologickou analýzou byly pozorovány signifikantní změny na srdci (obr. S4). Zobrazování s vysokým rozlišením nalezlo známky mikrotrombů (obr. 7A, bílé šipky) a také myokarditidy (obr. 7B, bílé šipky) v srdci. CD14, IL-1beta a TNF byly upregulovány časně v ledvinách, ale snížily se 8. až 12. den pi (obr. 6), což se shodovalo s infiltrací zánětlivých buněk do ledvin a možná akutním poškozením ledvin nebo tubulárním poškozením (indikováno bílými šipkami, obr. 7C). Exprese IL-6 se udržela v játrech, kde byla v pozdějších časových bodech zvýšena také IL-1beta. V mediastinální lymfatické uzlině došlo k bifázickému zvýšení IL-12 s přechodným zvýšením IL-6 a TNF na násobek hladin 12, 8 a 11, v tomto pořadí. Tlusté střevo mělo významnou regulaci IL-5, IL{45}}R a CCR3 s infiltrací eozinofilů (obr. 7D), ale minimální regulaci jakýchkoli jiných vrozených/adaptivních mediátorů. Abychom doprovázeli analýzu mimoplicních orgánů, analyzovali jsme biochemii krve zvířat v průběhu času, abychom vyhodnotili dysfunkci orgánů (obr. S5). Analyzovali jsme glukózu, albumin, alkalickou fosfatázu, alanin transferázu, dusík močoviny v krvi, celkový bilirubin a celkový protein jako známku funkce jater [27]. Vápník, draslík, albumin, amyláza, dusík močoviny v krvi a celkový protein byly analyzovány za účelem posouzení ledvin [27]. Gastrointestinální zdraví bylo hodnoceno pomocí sodíku, draslíku a alkalické fosfatázy[27]. Srdeční funkce byla měřena pomocí sodíku, draslíku a alanin transferázy[27]. Zvýšená regulace globulinu byla hodnocena jako známka antigenní stimulace[27]. Ze 14 zkoumaných molekul byly pouze amyláza a glukóza významně zvýšeny u infikovaných zvířat ve srovnání s kontrolami, přičemž vrcholy dosáhly 1700 U/l a 280 mg/dl, v daném pořadí, v den 8 pi. Kromě toho byly nejpozoruhodnější změny koncentrace draslíku ([K plus ]) a zdálo se, že většinou souvisejí s časem během období studie, protože většina jedinců měla zvýšení [K plus] s největší změnou pozorovanou 15. den. v albuminu byl také pozoruhodný, ale u mnoha zvířat mírný. Celková koncentrace proteinu se u většiny subjektů mírně zvýšila, ale změna je relativně mírná a pravděpodobně klinicky nevýznamná. Další jaterní markery dosáhly vrcholu později v průběhu, včetně glukózy (280 mg/dl) 8. den, alkalické fosfatázy (ALP) 12. dne (3 U/L) a dusíku močoviny v krvi (BUN) (22 mg/dl) v den 15. Alanin transferáza (ALT), ačkoli vrcholila 2. den, byla vysoká 12. den těsně pod 100 U/l, což naznačuje možné poškození jater. Ledvinové markery také dosáhly vrcholu později, 8. den pro amylázu (1700 U/l) a 15. den pro draslík a BUN (12 a 22 mg/dl, v daném pořadí). BUN měl až na několik výjimek možné časově závislé zvýšení koncentrace. Naproti tomu vápník dosáhl vrcholu 2. den při 2,6 mg/dl, ale spadal do referenčních rozmezí. Markery gastrointestinálního a srdečního zdraví, jako je sodík, vykazovaly minimální regulaci, zatímco [K plus ] se zvyšovalo relativně lineárně v průběhu infekčního časového průběhu s vrcholem v den 15 (12 mg/dl). ALP (gastrointestinální marker) byl vysoký 5. a 8. den při 3 u/l a ALT (kardiální marker) byl zvýšen u infikovaných křečků ve srovnání s neinfikovanými křečky 2., 8. a 12. den při 75–100 U/l, ale rozdíly nebyly významné. Konečně globulin dosáhl vrcholu 2. den na 0,6 g/dl a v průběhu času klesal relativně lineárně. Celkově vzato analýza krve ukazuje na určitou dysregulaci v mimoplicních orgánech, stejně jako na antigenní stimulaci v reakci naSARS-CoV-2.

Obr. 6. Infekce SARS-Cov{2}} u křečků vede ke zvýšení počtu zánětlivých genů a genů souvisejících s imunitními mediátory ve vybraných extrapulmonálních orgánech, což může naznačovat myokarditidu, adaptivní imunitní evoluci a infiltraci eozinofilů do tlustého střeva.qRT-PCR byla provedena na RNA extrahované z mediastinálních (M) lymfatických uzlin, srdce, ledvin, sleziny, jater a tlustého střeva zSARS-CoV-2naočkovaných křečků. Vzorky byly hodnoceny na reakci související s interferonem typu I (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), související s reakcí na interferon typu II (IFN-gama, IRF2, STAT1, CXCL10) a vrozenou/ adaptivní mediátor (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-10, IL-4, IL-5, IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beta, IL-6, TNF) geny využití PCR primerů specifických pro křeččí sekvence (tabulka 1). Změna násobku byla vypočtena prostřednictvím ACt proti výchozí hodnotě (den 0) s BACT jako provozním genem. N je 3 pro všechny časové body.

Diskuse

PůvodněSARS-CoV-2Předpokládá se, že infekce způsobuje hlavně respirační onemocnění, ale nyní je jasné, žeCOVID-19je onemocnění mnoha tváří postihující několik orgánových systémů[25,26]. Abychom lépe porozuměli původu onemocnění a nesčetným klinickým symptomům, které se vyskytují u lidí, zkoumali jsme imunopatologii napříč dýchacím traktem a nerespiračními orgány běhemSARS-CoV-2infekce u křečků syrských. Infekce 105 TCID50SARS-CoV-2vedlo k mírnému až středně těžkému klinickému onemocnění. Infekční virus byl obsažen hlavně v dýchacím traktu, ačkoli virová RNA byla přítomna ve všech hodnocených tkáních. Profilování odpovědi hostitele v dýchacím traktu identifikovalo inhibici odpovědi IFN typu I se současným zvýšením IFN typu II, zánětlivých cytokinů, vrozených a adaptivních cytokinů. Vyšetření mimoplicních orgánů také zjistilo podobný profil pro IFN signalizaci typu I a II; byla však také identifikována tkáňově specifická imunitní regulace. Konkrétně byla identifikována významná exprese vrozených a adaptivních mediátorů v srdci a slezině. Od antivirové léčby běhemSARS-CoV-2infekce je účinná pouze během krátkého období[28], závažnáCOVID-19Předpokládá se, že je důsledkem dysregulované imunitní odpovědi[29]. Pochopení imunitní patogeneze je nezbytné pro identifikaci terapeutických cílů a léčbu akutních nerespiračních symptomů spojených sCOVID-19včetně bušení srdce nebo migrén a déletrvajících stavů ve fázi zotavení, jako jsou postakutní následkySARS-CoV-2infekce (PASC), označované také jako long-COVID[30].

Obr. 7. Vybrané mimoplicní orgány mají odlišnou patologii po infekci SARS-CoV-2 s projevy mikrotrombů a myokarditidy v srdci, tubulárním poškozením v ledvině a infiltrací eozinofily v tlustém střevě.Srdce, ledviny a tlusté střevo byly odebrány z každého zvířete při nekropsii a fixovány v 10% formalínu před zalitím parafinovým blokem. Tkáně byly obarveny H&E. Srdeční tkáň vykazovala mikrotromby (bílé šipky) po několik dní (A), stejně jako myokarditidu v den 8 (bílá šipka) (B). Ledvina měla akutní poranění/tubulární poranění (bílé šipky) (C). Tlusté střevo mělo infiltraci eozinofily (bílé šipky) (D). Obarvené tkáně byly vizualizovány a zobrazeny pomocí skeneru sklíček Aperio ScanScope XT. Zobrazené obrázky reprezentují 3 zvířata na skupinu a časový bod.

Primární místo infekce ovlivňující přenos proSARS-CoV-2u lidí jsou dýchací cesty. Prvotním zaměřením našeho výzkumu byl proto dýchací trakt, včetně souvisejících imunitních odpovědí a imunopatologie. Zde jsme prokázali infekci horních i dolních cest dýchacích a související onemocnění po infekci SARS-CoV-2 u křečků syrských. Virová infekce v plicích vedla k závažné patologii charakterizované infiltrací zánětlivých buněk vedoucí k bronchopneumonii 5. den pi a krvácení do 8. dne. Tyto nálezy byly v souladu s infekcí SARS-CoV-2 v předchozích studiích u syrských křečků[19, 20, 31, 32] a větší zvířecí modely, včetně makaků rhesus[33], jakož i těžký zápal plic identifikovaný u některých lidíCOVID-19pacientů[34-36]. Konzistence dat podporuje použití křečka k modelováníSARS-CoV-2infekce lidského respiračního onemocnění a související imunopatologie. Také jsme zaznamenali, že někteří křečci zaznamenali větší úbytek hmotnosti, který koreloval s vyšší virovou zátěží. Rozdílná hmotnost mohla být způsobena přirozeným instinktem křečků skrývat potravu ve tvářích, neefektivní inokulací nebo tím, že existují přirozené vlastnosti hostitele, které mohou vést k rozdílnému úbytku hmotnosti a virové replikaci v tomto zvířecím kmeni. Protože všechna zvířata byla zkontrolována na skladování potravy v jejich tlamě a všechna zvířata byla pozitivníSARS-CoV-2virus, nemáme pocit, že tento výsledek je odrazem chyb vážení nebo špatného očkování. Je zapotřebí více práce, aby se zjistilo, zda existují genetické rozdíly mezi syrskými křečci z Charles River. Pochopení čistoty zvířecího kmene poskytne důležité informace pro použití těchto zvířat v terapeutických studiích SARS-CoV-2 a pokud je možné tyto znalosti využít pro vývoj závažnějšího křečkaSARS-CoV-2Modelka. V naší studii jsme také identifikovali upregulaci klíčových zánětlivých genů, jako je IL{0}} a TNF v plicích a nosních skořepinách, což potvrzuje předchozí imunitní modelování u křečků [32,37]. Tyto nálezy jsou důležité, protože se ukázalo, že tyto zánětlivé markery jsou prediktory závažných onemocnění prostřednictvím hodnocení krve u lidí[38-42]. Hlubší analýza reakce hostitele na SARS-CoV-2 v respiračních tkáních křečků byla provedena pomocí transkriptomové sekvenační analýzy[43,44]. Hoagland a kolegové hodnotili plíceSARS-CoV-2infikovali křečky pro regulaci imunitního genu hostitele a zjistili výraznou upregulaci IL-6, TNF a IL-1beta[43] v souladu s našimi výsledky PCR. V jiné studii analýza sekvenování jednotlivých buněk odhalila výraznou odpověď T buněk včetně upregulace IFN-gama a IL-2[44], dvou markerů, o kterých jsme také zaznamenali, že jsou vysoce exprimovány v plicích. Navíc naše analýzy plic odhalily upregulaci T buněčných markerů CD3, CD4 a CD8A. Důležité je, že analýza qRT-PCR, kterou jsme uvedli v naší současné studii, je v souladu s těmito dalšími studiemi, čímž potvrzuje použití qRT-PCR jako metody k rychlému posouzení účinnosti vakcín a léčiv hodnocených u křečků SARS-CoV{{{101} 13}} model. Naše profily qRT-PCR poskytují cílené biomarkery, které lze snadno použít. Naše studie a interpretace byly omezeny pouze přítomností analýzy patogeneze. Budoucí studie by měly využít náš panel imunitních cílů pro použití ve vakcínách a terapeutických studiích.

Antivirová odpověď je nezbytná pro počáteční kontrolu viru aktivní destrukcí virové replikace a imunitní stimulací, aby se omezilo šíření do dalších buněk. Po identifikaci přítomnosti viru nebo virových antigenů je indukce interferonů zásadní pro nastolení antimikrobiálního stavu v buňkách, kde je rovnováha mezi interferony a jinými vrozenými cytokiny zásadní pro účinné působení[45]. V poslední době je inhibice interferonů typu I (IFN-alfa a IFN-beta) spojována se závažným onemocněnímCOVID-19což naznačuje, že virus je schopen blokovat antivirovou imunitu, což vede ke zvýšené patogenezi [14,46,47]. V naší studii jsme zjistili, že křečci infikovaníSARS-CoV-2mají prototypickou odpověď IFN typu II. Naproti tomu odpověď typu IIFN je downregulována, jak dokazuje pokles exprese genu IFN-beta a zvýšení exprese genu IRF2, antagonisty typu I. Četné studie prokázaly zhoršenou odpověď IFN typu I po infekci SARS-CoV-2 in vitro[14,{5}}]. Dysregulace IFN, kterou zde uvádíme, nebyla dosud analyzována v respirační tkáni lidí s těžkou formouCOVID-19, ale systémové imunitní analýzy krve ukázaly podobné výsledky [14,46,47,52]. Ačkoli mechanismy inhibující odpovědi interferonu typu I nebyly plně objasněny, na této dysregulaci se podílejí virové a hostitelské faktory [53,54].

Dysregulace interferonové odpovědi je strategie používaná viry k vyhnutí se hostitelské imunitě. Předchozí výzkumy reakce hostitele na SARS-CoV (koronavirus 1 těžkého akutního respiračního syndromu) a infekci MERS-CoV (koronavirus respiračního syndromu na Středním východě) naznačují, že tuto strategii využívá více koronavirů[55-59]. Studie z roku 2020 od Xia et al. zjistili, že tato dysregulace využívaná vysoce patogenními koronaviry sahá až doSARS-CoV-2prokázáním, že všechny tři tyto beta-koronaviry downregulují dráhu interferonu typu I. Konkrétně NSP1, NSP6 a NSP13[50] interferují s translací IFN-beta, buď blokováním ribozomu hostitele v případě NSP1[60], nebo zacílením upstream proteinů nezbytných pro indukci IFN-beta v případě NSP13[61]. jinýSARS-CoV-2virové proteiny se také účastní downregulace interferonu[62]. ORF3b a ORF9b se specificky zaměřují na mitochondriální komplex antivirových signálních proteinů, aby inhibovaly signalizaci IFN typu I [63,64]. Hostitelské faktory ovlivňujícíSARS-CoV-2výsledky infekce zahrnují věk a pohlaví; kromě toho se na dysregulaci interferonu podílejí také komorbidity [65]. Studie z roku 2020 od Trouillet-Assenta a kolCOVID-19výsledky pacientů v kohortě zahrnující jedince systémově exprimující IFN typu I a jedince, kteří měli významně nižší hladiny IFN-alfa i beta. Zjistili, že pacienti bez exprese interferonu typu I byli starší a pravděpodobněji byli muži ve srovnání s těmi, kteří exprimovali IFNs typu I [66. V podobné studii byly identifikovány významně vyšší systémové hladiny IFN-alfa2 u žen ve srovnání s hladinami u mužů|67]. V naší nedávné studii jsme zjistili, že starší dospělí samci fretek měli opožděnou reakci na interferon typu I ve srovnání s dospělými samicemi, přičemž u samců chyběla indukce esenciálních antivirových genů včetně OASL, MIX1 a IDG15, což se shodovalo se zvýšenou virovou zátěží[68]. V naší současné studii na křeččím modelu byla všechna naše zvířata samci, což naznačuje, že k úplnému pochopení námi pozorované dysregulace interferonu I. typu je zapotřebí vyšetřování sexuálních předsudků. V současné době není známo, proč nebo jak hostitelské faktory ovlivňují reakce na interferonSARS-CoV-2. Studie Bastarda et al. identifikovala přítomnost autoprotilátek proti interferonům typu I u mužů s těžkýmCOVID-19[69]. To nabízí možné vysvětlení imunitních mechanismů zapojených do snížených odpovědí na interferon typu I u podskupiny lidských pacientů. Mechanismus snížené odezvy na interferon v naší současné studii, kde všichni křečci byli dospělí samci, čeká na další zkoumání. Imunitní profil, který jsme identifikovali společně s patologií dýchacích cest, navíc naznačuje, že křečci jsou ideálním modelem pro zkoumání těchto mechanismů a testování terapeutik, jako jsou interferony typu I[48,49,70] nebo interferon lambda [Z1, Z2]. oba prokázaly účinnost při léčběCOVID-19pacientů [Z3-75], ale je zapotřebí další výzkum.

COVID-19je onemocnění, které zahrnuje patogenezi respiračních i nerespiračních orgánů [25,26, avšak o reakci hostitele mimo dýchací trakt je známo jen málo. V naší studii jsme identifikovali vRNA v několika tkáních mimo dýchací trakt včetně mediastinální lymfatické uzliny, srdce, ledvin, jater, sleziny a tlustého střeva. Přítomnost virové RNA může být indikátorem replikace živého viru a infekce tkáně, ale může být také přítomna bez živého viru. Nenašli jsme významný živý virus mimo dýchací trakt, což by naznačovalo minimální výskyt infekce mimoplicních orgánů. Nicméně přítomnost virové RNA může být významná pro klinické onemocnění a související mechanismy. Přítomnost virové RNA může být výsledkem viru v krvi, který je transportován systémově, nebo virového antigenu, který byl transportován buňkami prezentujícími antigen do imunologicky důležitých tkání, jako je slezina a mediastinální lymfatická uzlina. Přítomnost virové RNA může hrát roli v imunitních odpovědích a související patogenezi v těchto tkáních. Proto jsme pokračovali ve zkoumání imunitních reakcí hostitele v tkáních, které byly pozitivní na virovou RNA. Přestože jsme nalezli upregulaci zánětlivých a interferonových genů typu II ve všech mimoplicních tkáních, nejvýraznější odpovědí bylo zvýšení imunomodulačních cytokinů v srdci. V srdci naše analýza identifikovala nárůst cytokinů včetně IL-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-5R, IL{ {12}}, CD14 a CCR3, kde některé cytokinové mRNA transkripty byly zvýšeny 100-krát. Ačkoli zde vybrané cytokiny mohou být produkovány různými podskupinami T buněk, nepřítomnost TGF-beta naznačuje, že přítomnost T-regulačních buněk je méně pravděpodobná. Kromě toho nepřítomnost IL-13 snižuje pravděpodobnost odpovědi TH2. Kromě T-lymfocytů lze zvýšení genové exprese IL-10, TNF a IL-6 přičíst monocytům nebo makrofágům[76]. To je dále podpořeno nárůstem CD14[76]. Exprese IL-5, IL-5R, IL-4 a CCR3 také naznačuje přítomnost eozinofilů[77]. Velké množství klinických studií nyní odhalilo srdeční postiženíCOVID-19[78-84]. Ve skutečnosti se odhaduje, že přibližně 30 procent lidí, kteří se uzdraviliCOVID-19mají nějaký typ srdečního poranění85]. Německá studie 100COVID-19pacienti zjistili, že zánět myokardu byl běžný i měsíce po zotaveníSARS-CoV-2infekce[84]. V testované kohortě mělo 78 procent pacientů příznaky související se srdcem bez ohledu na jejich stupeňCOVID-19závažnost[84]. Monocyty patří mezi typy buněk, o kterých je známo, že infiltrují srdce při zánětu myokardu a produkují IL-10, IL-1beta, IL-6 a TNF [86], stejně jako IL-12[87,88], z nichž všechny byly upregulovány v srdci poSARS-CoV-2očkování v naší současné studii. Kromě toho další podskupina srdečních problémů souvisejícíchCOVID-19byl připisován eozinofilům vedoucím k eozinofilní myokarditidě [89]. O jiných virech je známo, že způsobují eozinofilní myokarditidu po infekci[90-93]. Tato patologie je obvykle důsledkem infikování srdečních tkání virem, například infekcí virem Coxsackie B3[94]. Eozinofilní myokarditida byla diagnostikována vCOVID-19pacientů, po pitvě srdeční tkáň vykazovala infiltraci zánětlivých buněk včetně lymfocytů, makrofágů a především eozinofilů [89]. V tomto případě byl zjištěn nárůst eozinofilů a celkový zánět v srdci navzdory nedostatku živého viru v srdci v době smrti [95]. V naší studii jsme našli důkaz eozinofilní myokarditidy v histopatologii a také cytokinový podpis nalezený v srdci. V naší studii je možné, že eozinofily vedou ke kardiomyopatii zprostředkované zánětem prostřednictvím upregulace IL-4, která byla zvýšena z hlediska genové exprese v srdcích křečků 8. den po inokulaci SARS-CoV-2. Zvýšení draslíku a mírné zvýšení alanin transferázy v plazmě infikovaných křečků také mohlo podpořit srdeční dysregulaci. S ohledem na to stále nejsou známy mechanismy regulující poškození srdce související s COVID-19. Vzhledem k prevalenci srdečního postižení vCOVID-19pacientů, je zapotřebí více výzkumu k pochopení mechanismů onemocnění. Zde jsme poskytli důkaz, že křečci mohou být užiteční pro pochopení definujících mechanismů srdečního poškození běhemSARS-CoV-2infekce a vyhodnocení terapeutik pro tuto patologii.

Imunologicky naše analýzy ve slezině a mediastinálních lymfatických uzlinách naznačují indukci adaptivní imunity. Mediastinální lymfatická uzlina identifikovala pozoruhodnou dvoufázovou regulaci v genech souvisejících s T buňkami, s upregulací v genové expresi CD3, CD4, IL-2, IL-21, I-10, IL{ {6}}, IL-5 a IL-13 ve dnech 2 a 15. Tento profil naznačuje časnou prezentaci antigenu v drenážní lymfatické uzlině krátce po infekci plic dendritickými buňkami, která by byla podporována dnem 2 upregulace produkce IL-12 v lymfatických uzlinách [96,97]. Migrace dendritických buněk vedoucí k aktivaci T buněk nakonec vyvrcholí IL-2 stimulací růstu a proliferace T buněk[98]. Hladiny globulinů v krvi 2. den po infekci u infikovaných křečků také podporují časnou antigenní stimulaci. Zvýšená regulace IL-4, IL-5 a IL-13 naznačuje zkreslenou odpověď TH2[99]. Časné studie prokázaly, že asymptomatické nebo mírnéCOVID-19případy s vychýlením imunity směrem k systémové TH2 charakterizované zvýšením IL-4 a IL-10[100].IL-10, regulační cytokin, byl také upregulován 2. den naší studie. Naše data naznačují, že aktivované T buňky jsou rekrutovány do tkání s živou virovou infekcí, jako jsou nosní mušle, kde jsme pozorovali zvýšení genů souvisejících s T buňkami 5. den po inokulaci. Sekundární upregulace genů v lymfatické uzlině v den 15 také naznačuje expanzi podskupin T buněk. V nepřítomnosti infekčních virů v tomto okamžiku by to mohlo být zvýšení podskupin T buněk, které přímo přispívají k rozvoji paměťové reakce. Protože centrální paměťové T buňky také produkují IL-2[101], naše data ukazující zvýšený IL{12}} 15. den po inokulaci mohou naznačovat paměť T buněk. IL-21 byl nejvíce upregulovaný gen související s T buňkami v den 15. IL-21 je primárně produkován T-folikulárními pomocnými buňkami, podskupinou, která napomáhá germinálním centrálním B buňkám[102], zejména zešikmení B buňky směrem k afinitnímu zrání a rozvoji paměti. B buněčný marker CD19 byl také zvýšen v lymfatické uzlině, přičemž vrchol genové exprese nastal 15. den. Studie z roku 2021, kterou provedli Lakshmanappa et al.SARS-CoV-2infekce u makaků rhesus, odhalující silnou T buněčnou odpověď v mediastinální lymfatické uzlině se specifickým zvýšením CD4, stejně jako markery T folikulárních pomocných buněk CD28 a CXCR5[103]. Je možné, že zvýšená exprese genu T buněk pozorovaná v naší studii také svědčí o reakci germinálního centra. Zvýšená systémová odpověď T buněk byla také pozorována u pacientů se SARS-CoV-2, kteří se zotavují a rozvíjejí dlouhodobou paměť [97,104]. Hlubší analýza se zvýšenými markery reakcí germinálních center pro hodnocení lymfatických uzlin by byla prospěšná pro studie vakcín.

Zvýšená aktivita lymfatických uzlin může také naznačovat patogenezi. Lymfatická uzlina byla jediným nerespiračním orgánem, kde byl zjištěn živý virus. Živá virová infekce lymfatických uzlin a také sleziny byla pozorována u lidí, kteří podlehliSARS-CoV-2[105]. Ve studii Kaneko et al. vzorky lidských lymfatických uzlin a sleziny od zemřelýchCOVID-19pacientům chyběly BCL6 plus B buňky a také celá germinální centra obecně. Autoři předpokládali, že to byla příčina špatné humorální odpovědiSARS-CoV-2[106]. Vzhledem k tomu, že jsme identifikovali silnou neutralizační protilátkovou odpověď, která byla detekována 8. den po infekci, která se shodovala se snížením vylučování viru, je pravděpodobnější, že živý virus nalezený v lymfatických uzlinách naší studie svědčil o funkčních reakcích B buněk a reakce zárodečného centra.

Slezina také vykazovala výrazné imunitní reakce charakterizované zvýšením genové exprese lineárně od 8. do 15. dne. Tato pozdní upregulace koreluje s typickým postižením sleziny s imunitní odpovědí na patogeny, která by nastala po aktivaci v lokálních drenážních uzlinách [107]. Slezina, lymfoidní orgán, také aktivuje T a B buňky v reakci na virový antigen. Vysoká genová exprese CD3, CD4, IL-2 a I-21 svědčí pro T-folikulární buňky jako stejně jako aktivitu B buněk závislou na zárodečných centrech, jak jsme viděli v lymfatických uzlinách [108]. Kromě toho může být odpověď ve slezině důsledkem virémie, kde se plazmocytoidní dendritické buňky (pDC) účastní rozpoznávání virového antigenu prostřednictvím TLR7 a TLR9 pro CD8 plus T lymfocyty a aktivaci T (NKT) lymfocytů přirozených zabíječů. Oba tyto typy buněk fungují při odstraňování virově infikovaných buněk po aktivaci ve slezině pomocí IFN-beta a IL-12 [109], které byly v našem modelu zvýšeny spolu s CD8.IL-12 , IL-10 a CD14 byly upregulovány ve slezině infikovaných křečků, což potenciálně ukazuje na fagocytární aktivitu makrofágů [110,111]. Vrozené lymfoidní buňky (ILC) ve slezině také podporují opravu tkáně v reakci na zranění a produkují IL-5 a IL-13[112]. Dohromady tato pozdější reakce ve slezině ukazuje na recyklační funkci sleziny a také na potenciální aktivaci lymfocytů pro reakce dlouhodobé paměti.

Tlusté střevo vykazovalo minimální regulaci hodnocených cytokinů, s významnou výjimkou I-5, IL-5R a CCR3. Exprese všech tří těchto genů se významně zvýšila ve dnech 2 až 15 s maximálním násobkem změny 74 pro IL-5 ve srovnání s výchozí hodnotou v den 8. IL-5 je převážně secernován T typu 2 -pomocné buňky a eozinofily[113]. Vzhledem k nižší úrovni genové exprese jiných genů souvisejících s Th2, jako je IL-4 a IL-13, a nárůstu známých eozinofilních markerů IL-5R a CCR3, jde pravděpodobně o IL{ {18}} je produkován primárně eozinofily, což lze vidět v naší histologické analýze tlustého střeva. Eozinofily hrají přímou roli v antivirové obraně, jak dokazují RNázy v jejich granulích a jsou spojovány s clearance jiných respiračních virů (114,115). Velké množství eozinofilů se také nachází v gastrointestinálním traktu [116]. V naší studii tlusté střevo infikovaných křečků nevykazovalo živé viry. Tlusté střevo však bylo pozitivní proSARS-CoV-2virovou RNA ve dnech 2 a 5 po inokulaci, což je nález konzistentní se Sia et al., kteří také pozorovali vRNA v tlustém střevě bez přítomnosti zánětlivé reakce[20]. Až 20 procentCOVID-19pacienti uvádějí gastrointestinální symptomy, jako je průjem[39,117]s viry vylučovanými stolicí[118]. To by mohlo být vysvětleno poklesem eozinofilů, který byl hlášen u závažných případůCOVID-19[119-121]. Zvýšení exprese genu IL-5 eozinofily by mohlo přispět k antivirovému stavu tlustého střeva, a tím zabránit infekci. K potvrzení přesného typu buňky, který vede k této zvýšené IL-5 odpovědi, je zapotřebí další výzkum.

V naší studii jsme také zkoumali chemii krveSARS-CoV-2infikovaných křečků syrských. Stanovili jsme referenční rozmezí pomocí neinfikovaných křečků z našeho živočišného zdroje a také jsme porovnali hodnoty s publikovanými referenčními rozmezími pro křečky, konkrétně syrské křečky[122]. Některé preanalytické faktory, které mohou ovlivnit biochemické vlastnosti krve našich zvířat před infekcí a které je třeba vzít v úvahu při analýze, zahrnují úroveň stresu, kterou zvířata mohou podstupovat, stejně jako isofluranové anestetikum používané při odběru krve, které může změnit biochemické složení krve. Bylo prokázáno, že hladiny glukózy, ALT, ALP a anorganického fosforu byly významně vyšší u potkanů ​​pod isofluranem a jinými anestetiky, která zde nejsou uvedena[123]. V naší studii křečků infikovaných SARS-CoV-2 jeden z nejpozoruhodnější změny po infekci zahrnovaly koncentrace draslíku, které se postupem času zvyšovaly. Draslík, který je zásadou, působí jako pufr k výměně za vodík (H') (kyselina), když je pacient v kyselém stavu. Vzhledem k tomu, že acidóza krve může být způsobena změnami v respirační funkci, není překvapivé, že křečci, kteří vykazovali známky zápalu plic/respirační tísně (což naznačuje zvýšení oxidu uhličitého (CO2), jsou zadržováni (nebo vylučováni méně) a méně kyslíku (např. O2) užívaný kvůli snížené alveolární funkci) by se dostal do kyselého stavu, což by vedlo ke zvýšení draslíku v krvi. S ohledem na nižší hladiny albuminu ve srovnání s naším referenčním rozmezím by se dalo očekávat, že albumin se zvýší v reakci na expresi zánětlivých cytokinů. Je možné, že nižší hladiny albuminu byly způsobeny použitím isofluranu, což bylo prokázáno dříve[122-124]. Pokud jde o glukózu v průběhu času, u většiny infikovaných zvířat došlo ke zvýšení koncentrace glukózy, což naznačuje stres vyvolaný kortizolem, vzrušení vyvolané epinefrinem nebo dysregulaci v produkci inzulínu nebo interakci sekrece/receptor. Stručně řečeno, nejzajímavějším zjištěním této analýzy byl návrh snížených hladin kyslíku spojených se zvýšenými hladinami draslíku. Tyto výsledky naznačují, že monitorování draslíku může být použito k identifikaci pneumonie během části životaCOVID-19studie na zvířatech. V budoucnu lze tuto práci také použít k vytvoření referenčních hodnot pro model infekce SARS-CoV-2 syrského křečka a použít ji pro screening terapeutik během života.

Naše studie nabízí důležité poznatkySARS-CoV-2infekce aCOVID-19regulace onemocnění. Preklinické modely jsou základním kamenem biomedicínského výzkumu, který nabízí schopnost experimentálně izolovat mechanismy onemocnění a také vyhodnotit potenciální lékařská protiopatření včetně imunomodulačních léků, antivirotik a vakcín. Tak jakoSARS-CoV-2se poprvé objevily, měli jsme omezené znalosti o mechanismech patogeneze, žádná identifikovaná terapeutika nebo profylaktika a žádný preklinický model, který by bylo možné využít k objevu lékařských protiopatření. Od doby vzniku viru byly učiněny obrovské skoky zejména ve vývoji preklinických modelů, ale naše chápáníCOVID-19a jeho četné projevy jsou stále omezené. Naše studie potvrdila virový tropismus a respirační patologii dříve identifikovanou v naší studiiSARS-COV-2křeččích studií, ale byl také schopen rozšířit naše chápání imunitní regulace a patogeneze v dýchacím traktu i mimo něj.

Reference

1. Zhuang Pinghui JW. Zápal plic Wuhan: jak se rozvinulo pátrání po zdroji záhadné nemoci South China Morning Post 2020. Dostupné z: https://www.scmp.com/news/china/society/article/ 3046233/Wuhan-pneumonia-how-search -zdroj-záhada-nemoc-odhalena.

2. Cucinotta D, Vanelli M. Prohlašuje WHOCOVID-19pandemie. Acta Biomed. 2020; 91(1):157–60. Epub 20. 3. 2020. https://doi.org/10.23750/abm.v91i1.9397 PMID: 32191675.

3. Petrosillo N, Viceconte G, Ergonul O, Ippolito G, Petersen E.COVID-19, SARS a MERS: spolu úzce souvisí? Clin Microbiol Infect. 2020; 26(6):729–34. Epub 2020/04/03. https://doi.org/10.1016/j. cmi.2020.03.026 PMID: 32234451; PubMed Central PMCID: PMC7176926.

4. Medicína JHU. Coronavirus Resource Center 2021. Dostupné z: https://coronavirus.jhu.edu/.

5. Marshall M. Trvalá bída koronavirových dálkových přepravců. Příroda. 2020; 585(7825):339–41. Epub 2020/09/16. https://doi.org/10.1038/d41586-020-02598-6 PMID: 32929257.

6. Gupta A, Madhavan MV, Sehgal K, Nair N, Mahajan S, Sehrawat TS a kol. Mimoplicní projevyCOVID-19. Nat Med. 2020; 26(7):1017–32. Epub 2020/07/12. https://doi.org/10.1038/s41591- 020-0968-3 PMID: 32651579.

7. Nikolich-Zugich J, Knox KS, Rios CT, Natt B, Bhattacharya D, Fain MJ.SARS-CoV-2aCOVID-19u starších dospělých: co můžeme očekávat ohledně patogeneze, imunitních reakcí a výsledků. Geroscience. 2020; 42(2):505–14. Epub 2020/04/11. https://doi.org/10.1007/s11357-020-00186-0 PMID: 32274617; PubMed Central PMCID: PMC7145538.

8. SZO. Informace pro poskytovatele dětské zdravotní péče 2021. Dostupné z: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/hcp/pediatric-hcp.html.

9. Fu Y, Cheng Y, Wu Y. PorozuměníSARS-CoV-2-Zprostředkované zánětlivé reakce: Od mechanismů k potenciálním terapeutickým nástrojům. Virol Sin. 2020; 35(3):266–71. Epub 2020/03/04. https://doi.org/ 10.1007/s12250-020-00207-4 PMID: 32125642; PubMed Central PMCID: PMC7090474.

Poznámka:výše uvedené není úplný seznam referencí