Část Ⅱ: Nadměrná exprese PKD1 způsobuje polycystické onemocnění ledvin

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté a Marie Trudel

Základní patogenetické mechanismyautosomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin(ADPKD) zbývá objasnit. I když existují důkazy, že PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) genová haploinsuficience a ztráta heterozygotnosti může způsobit tvorbu cyst u myší, paradoxně vysoké hladiny PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) exprese byla zjištěna v ledvinách pacientů s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin). Chcete-li zjistit, zda PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) zisk funkce může být patogenetický proces, PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) bakteriální umělý chromozom PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1(polycystické onemocnění ledvin 1) expresi přednostně do dospělé ledviny. Bylo vytvořeno několik transgenních linií, které specificky nadměrně exprimovaly PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) transgen v ledvinách 2- na 15-násobek PKD1 (polycystické onemocnění ledvin1) endogenní hladiny. U všech transgenních myší se reprodukovatelně vyvinuly tubulární a glomerulární cysty a renální insuficience a zemřely na selhání ledvin. Tento model ukazuje, že nadměrná exprese divokého typu PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) samotný stačí ke spuštění cystogeneze připomínající lidskou ADPKD (autosomálně dominantnípolycystické onemocnění ledvin). Naše výsledky také odhalily nápadně zvýšenou renální expresi c-Myc u myší ze všech transgenních linií, což naznačuje, že c-Myc je kritickým in vivo downstream efektorem PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) molekulární dráha. Tato studie nejenže přinesla neocenitelné a první PKD（polycystické onemocnění ledvin）model pro hodnocení molekulární patogeneze a terapií, ale také poskytuje důkaz, že zisk funkce by mohl být patogenetickým mechanismem u ADPKD (autozomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin).

Cistanche k léčbě onemocnění ledvin

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅰ

VÝSLEDEK

Výroba PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)-Ac-BAC homologní rekombinací. Chcete-li zjistit, zda PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) samotný zisk funkce je dostatečný k produkci fenotypu ADPKD (autosomální dominantní polycystická choroba ledvin), nejprve jsme izolovali genomový klon obsahující celý PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) genu v knihovně BAC vektoru 129/Sv. Tato knihovna byla testována pomocí PCR se dvěma sadami primerů pro PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) gen, který překlenul exon 1 na 5' konci a exony 39 až 40 směrem k 3' konci (obr. 1). Pozitivní klon BAC pro PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) byl identifikován gen, který zahrnoval celé sousední tělo genu Tsc2. Inzert PKD1 (polycystické ledviny 1) byl podrobně charakterizován, aby se zajistilo, že genomová struktura odpovídá struktuře endogenního PKD1 (polycystické onemocnění ledvin1) gen myšího kmene 129/Sv, ze kterého byl inzert odvozen, a z inbredního kmene C57BL/6J. Genomické mapy PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) lokus v BAC a v těchto inbredních kmenech analýzou Southern blot, se čtyřmi štěpeními restrikčními enzymy a sedmi sondami pokrývajícími celou PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) gen, se jevil identický bez známek přeuspořádání (obr. 1). Tento BAC obsahoval -121-kb insert včetně ~37 kb upstream a -39 kb downstream sekvence PKD1 (polycystické onemocnění ledvin1) gen určený elektroforézou a sekvenováním.

OBR. 2.Produkce konstruktů SBPkdlrAc a transgenních myší. (a) Na myším Pkdl-BAC byly provedeny postupné homologní rekombinace, aby se zavedly dvě modifikace: regulační prvky SB vložené bezprostředně proti směru iniciačního kodonu Pkdl a tichá bodová mutace EcoRI (RI*) zavedená do exonu (ex) 10. Rekombinační vektor BAC obsahuje počátek replikace R6Ky, gen rezistentní na ampicilin, gen SacB, gen RecA a jedinečné klonovací místo Smal, ve kterém byly klonovány regulační elementy „SB“ (nebo mutace tichého bodu exonu 10). s přilehlými rameny genu Pkd1. Rekombinační vektor BAC byl elektroporován do buněk E, coli (DH10B) obsahujících Pkdl-BAC divokého typu a po selekci došlo k první homologní rekombinaci prostřednictvím jednoho ze dvou ramen Pkdl za vzniku kointegrátů BAC. Rekombinační vektor a duplikované oblasti Pkdl kointegrátů BAC byly eliminovány ve druhém selekčním kroku. Vyřešené Pkdl-BAC se mohou buď vrátit k divokému typu nebo obsahovat zamýšlenou modifikaci. Poté může být zavedena následná homologní rekombinace do nově modifikovaného BAC.(b)(ienomc DNA ot SBPkd l-etransgenní mxce byla anakZed pomocí Southern blot. AVicToiD1ecLon linearizovaných fragmentů způsobilo inzerci transgenu do hlavy-to-head. orientace -to-to-tail a/nebo tail-to-tail. 5'konec byl analyzován štěpením genomové DNA pomocí HindIII a hybridizován se specifickou transgenní sondou SB (levý panel). .9-kb pás pro inzerci hlava-ocas; další pás pozorovaný v linii 39 s největší pravděpodobností představuje spojovací fragment mezi SB a myším genomem. Vnitřní integrita transgenu byla monitorována několika štěpeními restrikčními enzymy a je ukázán jeden reprezentativní blot genomové DNA štěpené EcoRI a hybridizované sondou Pkdl (exon 7-15) (střední panel).

Tento SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)-BAC klon byl modifikován dvěma po sobě jdoucími homologními rekombinačními událostmi v E. coli. Gen PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) byl označen v exonu 10 substitucí nukleotidu (G na A), aby se vytvořilo nové místo EcoRI v poloze 2355 na mapě cDNA. Tato tichá bodová mutace byla vytvořena pro rozlišení PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) gen a transkript BAC z genu endogenního původu. Kromě toho jsme nahradili 5'regulační prvky PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)-BAC genu využitím dříve identifikovaných „SB“ renálních epiteliálních specifických prvků z konstruktu-trans-genu SBM (spojeného s c-Myc) nebo SBF spojeného s c-fos k omezení exprese na ledviny (36, 38) (obr. 2a).

Tento nový SBPkdlrAG-BAC byl štěpen NotL, jedinečným místem umístěným bezprostředně před SB elementy a Clal v těle genu Tsc2, čímž se zkrátily regulační elementy Tsc2 a 5' polovina těla genu, aby se zajistil nedostatek T'sc2. exogenní expresi ve všech tkáních a k odstranění prokaryotických BAC vektorových sekvencí (obr. 1 a 2). Tento 70-kb linearizovaný fragment NotI-ClaI byl izolován, purifikován. a kvantifikováno pro mikroinjekci oocytů (36).

CISTANCHE BENEFIT: LÉČBA NEMOC LEDVIN

Produkce a analýza SBPkdl-ac transgenních myší. Čtyři transgenní zakladatelé nesoucí několik kopií transgenu SBPkdlrAc konzistentně vyvinuli PKD. Ze čtyř SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)RAC základní myši určené Southern analýzou, tři SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) TAG transgenní linie byly založeny se dvěma až devíti kopiemi transgenu (obr. 2b). Charakterizace integrity transgenu v těchto liniích byla monitorována pomocí 5', vnitřní a 3' sondy, jak je ukázáno v reprezentativních příkladech na obr. 2b. Transgenní linie odhalily s 5'"SB" sondou pás o 10,9 kb konzistentní s SBPkdlrAc trans-gen byl integrován v orientaci hlava-ocas a odhalil se 3' sondou pás o velikosti 7 1- kb (obr. 2b). Kromě toho interní sonda detekovala 9,{15}}kb endogenní pás PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) a také pásy 6,{19}}kb a 2,0{21}}kb transgenu. díky místu inzerce EcoRI v exonu 10 (obr. 2b). Tyto myši obsahovaly kompletní kopie transgenu na základě analýzy genomové překrývající se struktury.

PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)získání funkce u dospělých SBPkdl-Ac transgenních myší. Exprese SBPkdl-AG. transgen a PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) gen byl zkoumán v různých orgánech. Kvantifikace hladin transkriptu z transgenu a/nebo endogenního genu byla provedena analýzou Northern blot (obr. 3a). Jak se očekávalo, transgenní a endogenní genové transkripty měly podobnou délku (14,2 kb). Na základě kontrolní exprese GAPDH měly ledviny všech myších linií SBPkd 1A konzistentně zvýšenou expresi transkriptu ve srovnání s normální PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) hladiny v ledvinách dospělých (n=3) podobného věku. Renální transgen a endogenní exprese pro různé transgenní linie vykazovaly rozsah 2- až 15-násobek nad kontrolní renální endogenní PKD1(polycystické onemocnění ledvin 1)úrovně (obr. 3a). Zejména transgenní linie39(n=4) vykazovala vyšší PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) úrovně než řádky 3 (n=3) a 41 (n=4). Dále PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1Hladiny exprese měřené analýzou Northern blot korelovaly s hladinami získanými pomocí PCR v reálném čase s použitím primerů v exonech 1 a 2 (obr. 3b).

OBR.3.Analýza renální exprese myší SBPkdlrA. (a) Analýza exprese Pkdl endogenního (endo) a transkriptu SBPkdlrA (Tg) v ledvinách ze tří transgenních linií metodou Northern blotting. Dva vzorky z každé transgenní linie, 3, 39 a 41, byly porovnány s endogenním renálním Pkdl transkriptem normálních kontrolních myší stejného věku ze stejného genetického pozadí (C5BI 6I × CBA/DE, vzorky ledvinové RNA byly získány z transgenních myší před konečné stadium onemocnění ledvin. Transkripty z endo a Tg jsou oba -14,2 kb dlouhé. Systematická nadměrná exprese transkriptů byla pozorována v ledvinách všech transgenních myší ve srovnání s netransgenními kontrolami. GAPDH byl použit jako vnitřní kontrola Kvantifikace renální exprese u těchto transgenních myší se pohybovala od 2- do 15-násobku vzhledem k endogenním hladinám Pkd1 z kontrolních myší libovolně nastavených na 1. (b) Schematické znázornění SBPkdl-transgenu a primerů bylo použitý k amplifikaci celkového Pkdl včetně endogenního a transgenu (exon 1 a exon 2) a pouze Pkd1 transgen (B. exon 2) pomocí PCR v reálném čase a semikvantitativní RT-PCR, analýza RT-PCR exprese transgenu SBPkdlAc byla kvantifikována v ledvinách a navíc ledvinové tkáně. Je ukázáno reprezentativní semikvantitativní hodnocení SBPkdl.Ac transgenu (Tg), které zahrnuje vzorek renální tkáně (K) od jedné myši ze všech tří transgenních linií (3. 39 a 41) a extrarenálních tkání. H, srdce; Lu, plíce; B. mozek; Li, játra; a S. slezina z myši linie 39. Exprese transgenu je snadno detekovatelná v ledvinách všech transgenních myší, zatímco v extrarenálních tkáních je nízká až nedetekovatelná. Exprese z transgenu SBPkd1rAc vytvořila specifický 307-bp amplikon, zatímco interní kontrola S16 vytvořila 102-bp amplikon. M,100-značka bp; H, O, negativní kontrola pro PCR amplifikaci. (c) Analýza exprese SBPkdlr PCR v reálném čase. Transgen byl určen z několika nezávislých myší. Transgen SBPkdl.Ac ze tří transgenních myších linií 3 (n=5), 39(n =7) a 41 (n=5) ukázal, že linie 39 a 41 měly nejvyšší úrovně renální exprese. Exprese transgenu SBPkdlrAc v extrarenálních tkáních od myší (n=3) ze tří transgenních linií byla hodnocena pomocí PCR v reálném čase. Ve srovnání s ledvinami každé transgenní linie (100 procent) analýza extrarenálních tkání ukázala, že hladiny exprese transgenu byly konzistentně nižší o 10- až 1,000-násobek v mozku, srdci, játrech, slinivce břišní , slezina a plíce. (d) Exprese endogenního genu c-mc v ledvinách SBPkdl.Ac semikvantitativní RT-PCR. Schematické znázornění ukazuje primery použité k amplifikaci c-Myc. Jak se očekávalo, exprese c-Myc je minimální v dospělých netransgenních ledvinách (kontroly). Naproti tomu zvýšená exprese c-Mye je detekována ve všech dospělých ledvinách SBPkdlrAc tří linií, jak bylo pozorováno u dospělých transgenních ledvin SBM používaných jako pozitivní kontrola. Amplikon c-Myc byl 250 bp; amplikon S16, interní kontrola, byl 102 bp.M,100-bp marker.

Kvantifikace hladin exprese transgenu byla specificky provedena pomocí PCR v reálném čase a semikvantitativní RT-PCR ve třech transgenních liniích v dospělosti s použitím primerů v 5'nepřekládané oblasti (B, -globinový promotor) a v exonu 2 PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)(obr.3b). SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) Exprese RAC u transgenních myší byla porovnána s produktem genu pro ribozomální protein S16 jako vnitřním standardem. Podmínky použité pro semikvantitativní RT-PCR amplifikaci byly v lineárním rozsahu. Exprese transgenu pomocí PCR v reálném čase a semikvantitativní RT-PCR konzistentně a specificky vykazovala nejvyšší expresi v ledvinách ze všech transgenních linií ve srovnání s ostatními orgány (obr. 3b a c). Hladiny renální exprese pro jednotlivý vzorek byly reprodukovatelné jakoukoliv z použitých detekčních technik. Nejvyšší úrovně PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) byla měřena renální exprese transgenu pro linie 39 a 41. Aby bylo možné sledovat, zda zvýšená exprese PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) je výsledkem transgenu nebo endogenního genu, byla stejná skupina myší ze tří transgenních linií porovnána s renálním PKD1 ( polycystické onemocnění ledvin 1) exprese transgenu a pro renální PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) celkovou (transgenní a endogenní) expresi pomocí PCR v reálném čase. Zajímavě. řádky 39 a 41 vzhledem k řádku 3 ukázaly, že zvýšená PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) renální exprese transgenu byla podobná nebo vyšší než u PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) celková renální exprese, což ukazuje, že transgen je specificky zodpovědný za tuto indukovanou expresi. V různých orgánech (včetně srdce, plic, mozku, jater, slinivky břišní a sleziny) se SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) RAC; transgen vykazoval velmi slabou expresi, občas detekovanou ve slezině a plicích, s malou až nedetekovatelnou expresí v jiných orgánech (obr. 3b). Kvantifikace pomocí PCR v reálném čase prokázala 10-až 1,{5}}krát nižší úroveň exprese transgenu v extrarenálních tkáních ve srovnání s expresí ledvin (obr. 3c). "SB" regulační elementy transgenu SBPkdlrAc poskytují preferenční renální expresi; tato konkrétní orgánová distribuce byla také určena při použití v transgenech spojených s c-Myc (SBM) a c-fos (SBF) (36, 38). c-Mye, downstream efektor PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) signální dráhy u SBPkdlrAc: myši. Abychom získali vhled do intracelulárního patogenetického mechanismu SBPkdlrAc transgenních myší, dále jsme se snažili monitorovat hladinu renální exprese c-MyC na základě našeho předchozího pozorování deregulace c-Myc v ledvinách lidských ADPKD (autosomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin) (22). Analýza ledvin byla provedena u všech tří transgenních linií 3(n=4).39(n=7) a 41 (n =4), stejně jako kontrol (n {{9 }}). Jak je ukázáno na obr. 3d, existuje podstatná exprese endogenního c-Mye indukovaného u myší SBPkdlrAa ve srovnání s kontrolními myšmi podobného věku. Je zajímavé, že úroveň exprese c-Myc v některých ledvinách SBPkdlrAG, zejména v linii 39, dosáhla úrovně srovnatelné s úrovní pozorovanou v modelu transgenní myši PKD SBM produkovaném renální expresí c-Myc.

Renální anomálie u SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 pro každou linii) vyvinuté mnohočetné tubulární (T) a glomerulární cysty (G) (obr. 4d, f a g). Cysty byly pozorovány v tubulech z kortikálních a medulárních oblastí a také ve sběrných tubulech z papily (obr. 4d a e). Transgenní myši vykazovaly tubulární epiteliální hyperplazii (šipka) zahrnující jak cystické, tak necystické tubuly a častou hypertrofii (obr. 4g a h). ale závažnost se u jednotlivých myší lišila. Intersticiální fibróza (F). Často byly pozorovány perivaskulární lymfoidní infiltráty a proteinové odlitky (P) (obr. 4d a e).

Obr

Chcete-li přesněji definovat místo lokalizace zvýšené PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) expresi v ledvinách jsme provedli in situ hybridizaci pomocí dříve použité sondy exonu 36-45(16). Hybridizační signál byl lokalizován specificky do epiteliálních buněk vystýlajících cysty a hyperplastické tubuly a také glomerulární cysty. Kromě toho byl nad epitelem necystických nebo mírně dilatovaných tubulů vidět určitý signál, pravděpodobně identifikující tubuly předurčené k budoucím cystickým změnám (obr. 4i a j). Renální histologická analýza byla také provedena u transgenních myší při narození (n=8), 10. den po narození (P10)(n=3), P20(n=5), P35(n{ {10}}) a P45(n{12}}) ve srovnání s negativními sourozenci stejné věkové skupiny (n =2 až 4). Zajímavé je, že všechny novorozené transgenní myši vykazovaly tubulární a glomerulární dilataci vzhledem k kontrolní negativní sourozenci (obr. 4k a 1), což ukazuje, že renální anomálie začaly in utero, jak bylo pozorováno u myší SBM a ADPKD (autozomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin) pacientů. Velikost a počet tubulární a glomerulární dilatace se zvětšoval s progresivním věkem. Podle P35 vykazovaly transgenní myši závažnější hyperplazii a známky glomerulosklerózy. Změněné fyziologické funkce ledvin u myší SBPkdlrsc. Renální fyziologické funkce všech transgenních myší vykazovaly rysy podobné PKD, zatímco u netransgenních sourozenců se toto onemocnění nikdy nerozvinulo. Během několika měsíců po narození se u postižených zvířat rozvinula chronická renální insuficience. U těchto zvířat byly monitorovány renální funkční parametry měřením hladin v séru a moči. dusík močoviny v krvi (BUN) a kreatinin, osmolalita moči, bílkovina v moči a vylučování iontů (tabulka 1). Všechny myši ze tří linií ve srovnání s kontrolami vykazovaly koncentrační defekty, což je běžný nález u ADPKD (autozomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin). a následně vykazoval snížený BUN v moči. koncentrace kreatininu, bílkovin a železa. Transgenní SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)rAc.zakladatelé a potomci (n=6) z každé linie byli kvalitativně monitorováni na proteinurii ve vzorcích moči pomocí SDS-PAGE (obr. 5). Myši starší než 2 měsíce vykazovaly neselektivní proteinurii, která progredovala s věkem. Kromě toho byly zvýšeny hladiny sérového BUN a sérového kreatininu, což odhalilo renální insuficienci (tabulka 2). Protože chronická renální insuficience běžně vede ke změnám v hematologických parametrech, byly tyto zkoumány na SBPkdlAc transgenních myších ve věku 3 až 14 měsíců (tabulka 2). Tyto transgenní myši byly anemické, o čemž svědčí významně snížený počet červených krvinek, přičemž hemoglobin a hematokrit dosahovaly poloviny normálních hladin. Ostatní parametry červených krvinek, jako je procento retikulocytů, nebyly ovlivněny, jak se očekávalo, když byly vyvolány poruchou ledvin. Tato zvířata trvale umírala na selhání ledvin ve věku -5,9 ± 2,8 měsíce (n {{12} }) pro transgenickou linii 39 a v pozdějším věku, -14,6± 3,1 měsíce (n= 20) a-11,7 ±6,5 měsíce (n=7) pro linky 3 a 41, resp.

ÚČINKY CISTANCHE: LÉČBA NEMOC LEDVIN

DISKUSE

Zde uvádíme izolaci a charakterizaci myší PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)-BAC. Tento PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) gen byl označen a regulační elementy byly nahrazeny tak, aby zacílily expresi specificky do ledvin dvěma po sobě jdoucími událostmi homologní rekombinace. Transgenní myši produkované tímto novým genem SBPkdlrAG vykazovaly 2-až 15-násobné zvýšení exprese PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) a reprodukovatelně se u nich vyvinuly časné renální morfologické změny typické pro PKD. Renální insuficience je zjevná ve středním věku a myši umírají předčasně na selhání ledvin. Naše výsledky také naznačují, že mechanismus nadměrné exprese PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) zodpovědný za tento fenotyp je zprostředkován signalizační aktivací c-Myc in vivo. Tato studie ukazuje, že zvýšení funkce myší PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) v ledvinách je dostatečné k vytvoření renálního fenotypu PKD.

Vzhledem k tomu, že myší PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) gen není duplikován jako u lidí (27), přímo jsme identifikovali a izolovali klon BAC, který obsahoval celý PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) gen. Kompletní charakterizace 129/Sv myší PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)-BAC. nepřímé srovnání se dvěma dalšími inbredními myšími kmeny potvrdilo integritu lokusu PKD1 (polycystická choroba ledvin 1). PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)-BACinsert obsahoval-37 až 39 kb upstream a downstream sekvencí z genu PKD1 (polycystická choroba ledvin 1). Naše analýza ukázala, že PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) gen v tomto BAC byl bona fide myší lokus divokého typu, který by mohl sloužit pro další studie.

Ačkoli existují silné důkazy, že tvorba cyst u ADPKD (autozomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin) může být důsledkem ztráty heterozygotnosti po somatické inaktivaci normální PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) alely (3.21.32), existují také sugestivní důkazy pro trvalou nebo dokonce zvýšenou expresi polycystinu-1 v cystickém tubulárním epitelu (22.29). Posledně uvedené pozorování vyvolává otázku, zda je nadměrná exprese PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) sama o sobě dostatečnou bezprostřední příčinou cystogeneze. U transgenních myší nesoucích lidskou PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1), TSC2. RAB26. NTHL1 a SLC9A3R2, pouze u menšiny myší se vyvinuly cysty a žádná neměla detekovatelnou expresi transgenu v dospělosti navzdory 30 kopiím transgenu (31). U těch transgenních myší. bylo obtížné stanovit jasnou roli nadměrné exprese PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) v cystogenezi. Náš model se liší, protože dvě až devět kopií divokého typu samotné PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) bez přilehlých genů bylo integrováno do transgenních myší. Protože gen PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) má zásadní funkce v různých orgánech nebo tkáních, jak je popsáno u mnoha myší s ablací genu PKD1 (polycystické ledviny 1), systémová nadměrná exprese PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) by mohlo vést k dalším matoucím efektům. Následně jsme se zabývali úlohou PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)získání funkce pomocí přístupu, který se zaměřuje na PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) konkrétně na ledviny. Homologní rekombinací jsme nejprve nahradili PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) upstream regulační oblast "SB" renálně omezenými regulačními prvky, čímž jsme zabránili snížené genové expresi normálně pozorované pro PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)v dospělosti stejně jako potenciální sekundární regulace zpětnovazební smyčky(36,38). Za druhé, označili jsme myší PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) transgen (Pkdlr) s tichou bodovou mutací v exonu 10, ale nevložil epitopovou značku, aby se zajistilo, že bude produkován plně funkční protein "divokého typu" s konzervovanou strukturou a integritou. Z tohoto modifikovaného BAC byl fragment SBPkdlrAG purifikován z genu Tsc2 a vektoru BAC, aby se zabránilo interferenci genem Tsc2, který může také indukovat cystický fenotyp (8.20.28). stejně jako vyhnout se inhibičnímu účinku prokaryotických sekvencí(5).

Byly vytvořeny čtyři různé SBPkdlrActransgenic zakladatelské myši a tři nezávislé linie se specifickou renální PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)-vylepšený výraz. Zvláště pozoruhodná je úplná penetrace fenotypu u těchto transgenních myší. SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) Zakladatel a myší linie rAc sdílely několik společných fyziopatologických rysů s ADPKD (autosomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin). Patří mezi ně vývoj cyst v kortexu, dřeni a glomerulech spolu s epiteliální hyperplazií, intersticiální fibrózou a fokálním intersticiálním zánětem.

Protože fenotyp PKD byl konzistentně pozorován u všech různých zakládajících transgenních myší a integrace transgenu do myšího genomu je náhodný jev, fenotyp nemůže být výsledkem účinku chromozomální polohy, ale pouze zvýšené PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)výraz. Exprese transgenu PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) ve všech liniích byla skutečně omezena na ledviny. jak bylo dříve pozorováno pro jiné transgeny regulované "SB" elementy (36, 38). Navíc tato zvýšená exprese PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) byla způsobena transgenem a nikoli nepřímým endogenním PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) aktivace. Naše výsledky tedy poskytují jasný důkaz, že zesílení funkce funkční PKD1 divokého typu (polycystické onemocnění ledvin 1) může produkovat mnohočetné renální cysty. Důležité je, že tyto praktiky SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) představují první myší model vytvořený jedinou nadměrnou expresí myšího ortologu lidského PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) gen.

Myši SBPkdl-Ac demonstrují, že PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1Nadměrná exprese je primárním patogenetickým mechanismem cystogeneze ledvin. Důležité je, že nejvyšší hladiny exprese transgenu v ledvinách korelují s progresí a závažností fenotypu. Také jsme zjistili, že nadměrná exprese PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) ve vývoji SBPKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)-Ac fenotyp pravděpodobně signalizuje aktivaci c-Myc in vivo. Je možné, že tato aktivace by mohla být dokonce přímá přes polycystin-1 C-terminální ocas, který prochází proteolytickým štěpením a jadernou translokací (7), protože se ukázalo, že zvýšená renální exprese c-Myc u dospělých myší indukuje PKD, by bylo vysoce konzistentní pro podporu c-Myc jako hlavního downstream efektoru PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) signální dráhy Tento výsledek také koreloval s našimi předchozími zjištěními zvýšené exprese c-Myc v ledvinách všech analyzovaných lidských ADPKD (autozomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin) (22), Celkově tyto výsledky naznačují, že c-Mye je hlavním mediátorem PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) cystogeneze.

Naše výsledky z PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) model zesílení funkce spolu s haploinsuficiencí a ztrátou funkce myší PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) naznačují, že jakýkoli PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) dysregulace by mohla vést k cystogenezi (2.19.23-26.31.40). Závažná nerovnováha PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) u myší vyvolaná PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1ablace nebo transgenní nadměrná exprese způsobily časný nástup a rychlou progresi ledvinových cyst a ovlivnily vysoký podíl tubulů. Naproti tomu mírnější PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) nerovnováha, jako je haploinsuficience, vedla k pomalejší progresi PKD s více fokálními cystami. Zjevný paradoxní vývoj podobného fenotypu prostřednictvím opačné polycystin{0}} dysregulace lze vysvětlit společným výsledkem, konkrétně nerovnováhou relativní proteinové koncentrace, která by mohla změnit tvorbu nebo funkci aktivního polycystinového multiproteinového komplexu. Celkově vzato naše výsledky a výsledky dalších výzkumníků tvrdí, že mechanismus tvorby cyst u ADPKD (autozomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin) pravděpodobně vzniká ze tří patogenetických mechanismů: zisk funkce, ztráta funkce a účinky dávkování genů.

Román SBPkdlrAc; myši představují silný model cystogeneze ledvin, který může poskytnout hlavní pohled na patofyziologii PKD, PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) dráhy přenosu signálu a interagující partneři. Studium tohoto modelu může také vést k vývoji nových terapeutických strategií k obnovení normální rovnováhy proteinů v PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) multimerní komplex.

Cistanche léčí onemocnění ledvin a zlepšuje funkci ledvin

REFERENCE

1. Blouin, MJ, H.Beachemin, A Wright, ME. De Paepe, M. Surrette, AM. Beau. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos a M. Trudel. 2000. Genetická korekce srpkovité anémie: pohledy pomocí modelů transgenních myší Nat. Med.17-182.

2 Boulter, C, S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle a R. Sandford. 2001.Kardiovaskulární, kosterní. a renální defekty u myší s cíleným narušením PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1)gen. Proč. Natl.Acad. Sci. USA 9812174-12179.

3. Brasier, JL a EPHenske. 1997. Ztrátapolycystické onemocnění ledvin(PKD1）oblast chromozomu 1φp13 v buňce renální cysty podporuje model ztráty funkce pro patogenezi cysty. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R. Dackowski, LR.Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R ML Hakim,G. ML Landes,KW Klinger,F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino a N. A Doggett. 1995.autozomálně dominantní polycystické onemocnění ledvingen předpovídá přítomnost repetice bohaté na leucin. Hum Mol, Genet.{1}}.

5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E. Lacy a F.Costantini. 1985. Specifická exprese cizího genu -globinu v erytroidní buňce transgenních myší Nature 337-380.

6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought, Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst, GG Germino a M.-C. Gubler.2002. Exprese PKDI a PKD2 transkriptů a proteinů v lidském embryu a během normálního vývoje ledvin. Dopoledne. J. Pathol. 160973-983.

7.Chaurvet,V, X Tian, ​​H.Husson, DH Grimm,T.Wang T.Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya,S.Somlo a MJ Caplan.2004 Mechanické podněty vyvolávají štěpení a nukleární translokace pobeystinu-1 C-konce.J. Cin.Investig 114:1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson a DJ Kwiatkowski 2000. Molekulární genetický pokrok u tuberózní sklerózy. Hučení. Genet10797-114.

9. Konsorcium, EPKD1993. Identifikace a charakterizace genu tuberózní sklerózy na chromozomu 16.Cell75:1305-1315.

10. Konsorcium, EPKD1994polycystické onemocnění ledvin 1gen kóduje vše transkribovatelné v duplikované oblasti na buňce chromozomu 16 7781-894.

11. Konsorcium, L PK D 1995.Polycystické onemocnění ledvin: kompletní struktura PKD1 (polycystické onemocnění ledvin1) gen a jeho protein. Ce 81:289-298

12. Couillard, M., R. Guilkume, N Tanj, V. DAgati a M. Trudel. 2002. c-Myc-indukovaná apoptóza vpolycystické onemocnění ledvinje nezávislý na interakci FasL/Fas. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Model lidské srpkovité glomerulopatie. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. GengL,Y, Segal B.PekseL N.Den Y. Pei, F.Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STREeders a J.Zhou. 1996. Identifikace a lokalizace polyesteru, PKD1 (polycystické onemocnění ledvin 1) genový produkt. J. Clin. Vyšetřování. 98-2674-2682