Jak opravit a léčit akutní poškození ledvin?

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Multi-omické přístupy k akutnímu poškození a opravě ledvin

Louisa MS Gerhardt a Andrew P. McMahon

Abstraktní

Ledviny mají pozoruhodnou regenerační schopnost. V reakci na ischemické nebo toxické poškození mohou buňky proximálního tubulu proliferovat, aby znovu vybudovaly poškozené tubuly a obnovily funkci ledvin. Nicméně, těžkáakutní poškození ledvin(AKI) nebo opakující se AKI (akutní poškození ledvin) události mohou vést k maladaptivní opravě a progresi onemocnění z AKI (akutní poškození ledvin) dochronické onemocnění ledvin(CKD). Aplikace jednobuněčných technologií identifikovala poraněné buněčné stavy proximálního tubulu týdny po AKl (akutní poškození ledvin), vyznačující se prozánětlivým senescentním molekulárním podpisem. Epigenetické studie zdůraznily dynamické změny v chromatinové krajině ledvin po AKI (akutní poškození ledvin)a popsali klíčové transkripční faktory spojené s AKI (akutní poškození ledvin) Odezva. Integrace multi-omických technologií otevírá nové možnosti, jak zlepšit naše chápání AKI (akutní poškození ledvin) a hnací síly stojící za AKl (akutní poškození ledvin) přechod na CKD, s konečným cílem navrhnout na míru šité diagnostické a terapeutické strategie ke zlepšení AKI (akutní poškození ledvin) výsledky a předcházetnemoc ledvinpostup.

klíčová slova: Akutní poškození ledvin, Multi-omics, Epigenomics, jednobuněčné RNA-sekvenování, ATAC sekvenování.

Úvod

Akutní poškození ledvin(AKI), diagnostikovaný náhlým zvýšením sérového kreatininu a/nebo snížením objemu moči, je vysoce převládající stav spojený se zvýšenou morbiditou a mortalitou a také významnými náklady na zdravotní péči [1e4]. Současné důkazy například naznačují, že nejméně u 25 procent všech hospitalizovaných pacientů s COVID-19 se rozvine AKI (akutní poškození ledvin) a že tito pacienti mají výrazně vyšší riziko úmrtnosti než pacienti s COVID-19 bez AKI (akutní poškození ledvin) [5]. Pacienti přežívající AKI (akutní poškození ledvin) mají zvýšené riziko přechodu do chronického a konečného onemocnění ledvin [3,4,6]. Podle výroční zprávy US Renal Data System za rok 2018 pouze 52,6 procenta hospitalizovaných pacientů s Veteran Affairs, kteří se setkali s AKI (akutní poškození ledvin)diagnostická kritéria, byla stanovena diagnóza AKI (akutní poškození ledvin), vyzývající k většímu povědomí o AKI (akutní poškození ledvin) v nemocničních rutinách [7]. Dále časná diagnostika AKI (akutní poškození ledvin)je omezena nedostatkem citlivých biomarkerů a dostupnými možnostmi léčby AKI (akutní poškození ledvin) nadále spoléhají na hemodynamickou optimalizaci, vyhýbání se nefrotoxicitě a renální substituční terapii.

Buňky proximálních tubulů, nejhojnější typ buněk v ledvinách, jsou zodpovědné za velkou část renální reabsorpce tekutin a rozpuštěných látek a ukázaly se jako hlavní hráči v adaptivních a maladaptivních reakcích na AKI (akutní poškození ledvin) [8]. Kvůli jejich vysoké metabolické aktivitě a závislosti na oxidativním metabolismu vede ischemie rychle k depleci ATP, akumulaci reaktivních forem kyslíku a nakonec k apoptóze nebo nekróze buněk proximálního tubulu (obrázek 1). Buňky proximálních tubulů, které přežijí ischemickou příhodu, mají schopnost dediferencovat, proliferovat a znovu vybudovat poškozené tubuly, a tak hrají zásadní roli v procesu adaptivní opravy k obnovení funkce ledvin [9-11]. Avšak maladaptivní buňky proximálního tubulu, charakterizované prozánětlivým a profibrotickým fenotypem, se také podílejí na progresi onemocnění z AKI (akutní poškození ledvin) na chronické onemocnění ledvin (CKD), komplexní proces zahrnující zánět, vaskulární vzácnost a produkci extracelulární matrix aktivovanými pericyty a myofibroblasty (obrázek 1)[8,12]. Technologie Omics zkoumající organizaci genomu, genovou expresi a proteinové produkty, jako je test na chromatin přístupný transpozáze pomocí sekvenování (ATAC-seq), sekvenování mRNA a hmotnostní spektrometrie, výrazně zlepšily molekulární vhled do buněčných odpovědí iniciovaných AKI (akutní poškození ledvin). V poslední době jednobuněčné aplikace těchto přístupů umožnily studium buněčných událostí s nebývale vysokým rozlišením. Tyto a další multi-omické přístupy jsou příslibem komplexního pochopení regulačních mechanismů řídících onemocnění ledvin, což otevírá nové cesty pro objevování biomarkerů a léků. Tento rukopis shrnuje nedávné poznatky o použití technologie omicsporanění ledvina opravuje a zvažuje budoucí aplikace multi-omických přístupů k lepšímu porozumění a léčběporanění ledvinanemoc ledvin.

Obrázek 1:Přehled AKI a procesů.

Buňky proximálního tubulu jsou vysoce náchylné k ischemii, která může vést k buněčné smrti prostřednictvím apoptózy a regulované (pyroptóza, ferroptóza, nekroptóza), stejně jako k neregulované nekróze a odlupování mrtvých i životaschopných buněk do tubulárního lumenu. Přežívající buňky proximálního tubulu (PTC) se mohou dediferencovat a proliferovat, aby se obnovila architektura a funkce ledvin; maladaptivní oprava však může také vést k progresi onemocnění do chronického onemocnění ledvin (CKD). Tento proces je charakterizován vaskulární vzácností, diferenciací pericytů na myofibroblasty, zvýšeným ukládáním vláknité extracelulární matrix (ECM), tubulární ztrátou a chronickým zánětem. Nfkb1 plus PTC se selháním opravy, charakterizované sekrečním fenotypem spojeným se stárnutím (SASP), pravděpodobně hrají důležitou roli v AKI (akutní poškození ledvin)-přechod na CKD.

Genomika

Genomické studie mají za cíl identifikovat genetický základ onemocnění cíleným sekvenováním kandidátských genů na základě hypotéz nebo sekvenováním celého genomu bez hypotéz. Zde se zaměříme na celogenomové asociační studie (GWAS), které využívají nezaujatý přístup k mapování sekvenčních variant napříč celým genomem k fenotypovým rysům, jako jsou znaky onemocnění, a umožňují identifikaci kandidátních genů pro mechanistické studie (obrázek 2). Ve srovnání s jinými znaky onemocnění je dostupný počet GWAS dotazujících se na genetické pozadí AKI (akutní poškození ledvin) je málo. To je částečně způsobeno komplexní a heterogenní povahou AKI (akutní poškození ledvin) jako chorobný znak. AKI (akutní poškození ledvin) může být způsobena řadou různých faktorů, jako je ischemie, sepse, nefrotoxické léky a obstrukční nefropatie. Současné důkazy naznačují, že základní molekulární a buněčné mechanismy AKI (akutní poškození ledvin) mají příčinně specifické komponenty [13,14], ale konsensuální definice AKI (akutní poškození ledvin) — změna sérového kreatininu a produkce moči — nezohledňuje různé AKI (akutní poškození ledvin) příčiny.

Je znázorněn zjednodušený pracovní postup pro celogenomovou asociační studii (GWAS) (vlevo nahoře). Ke studiu asociace mezi genetickými variantami a specifickým znakem se na populaci provádí sekvenování celého genomu nebo genotypizace pomocí polí jednonukleotidového polymorfismu (SNP) a k identifikaci SNP asociovaných s požadovaným znakem se používají statistické asociační testy. Pro jednobuněčné sekvenování RNA (vpravo nahoře) se připraví jednobuněčná suspenze, jednotlivé buňky se izolují a molekuly mRNA z buňky (nebo jádra) se zachytí na kuličky pro následné konverze na cDNA. cDNA je amplifikována a sekvence určeny sekvenováním nové generace (NGS) a mapováním sekvencí do genomu. Pro epigenomickou analýzu (vpravo dole) po testu na chromatin přístupný transposáze (ATAC) následuje NGS a sekvenční mapování pro vizualizaci dostupnosti chromatinu v celém genomu. Hyperaktivní Tn5 transposáza (Tn5) se používá ke specifickému štěpení míst otevřeného chromatinu a současnému vkládání sekvenačních adaptérů pro NGS. Oblasti zvýšené dostupnosti chromatinu jsou znázorněny jako píky ATAC. Pro proteomickou analýzu hmotnostní spektrometrií (vlevo dole) jsou proteiny extrahovány, štěpeny na peptidy a ionizovány. V hmotnostním spektrometru jsou ionty urychlovány, vystaveny magnetickému poli a je měřen poměr jejich hmotnosti k náboji, což umožňuje identifikaci a kvantifikaci proteinu.

K dnešnímu dni dva větší GWAS zkoumaly genetické pozadí AKI (akutní poškození ledvin). První studie prokázala asociaci jednotlivých jaderných polymorfismů (SNP) v lokusu GRM7 LMCD1-AS1 a BBS9 s AKI související s operací koronárního bypassu (akutní poškození ledvin) v objevové kohortě 873 pacientů a replikační kohortě [15]. Druhá kombinovala pacienty ze dvou odlišných kohort a vytvořila objevnou populaci 1429 kriticky nemocných pacientů a identifikovala čtyři AKI (akutní poškození ledvin)-asociované SNP v těsné blízkosti buď interferonového regulačního faktoru 2 (IRF2) nebo transkripčního faktoru T-boxu 1 (TBX1)[16]. Zajímavé je, že IRF2 je spojován s pyroptózou a má regulační roli v imunitním systému[17,18] a TBX1 je součástí genové rodiny T boxu, skupiny transkripčních faktorů s důležitou rolí v buněčném osudu a regulaci buněčného stavu [19 ]. Nicméně spojení mezi AKI (akutní poškození ledvin) a tyto lokusy nemohly být reprodukovány v prospektivní kohortě kriticky nemocných pacientů, kteří byli specificky genotypizováni pro identifikované SNP[20]. To podtrhuje nutnost ještě větších velikostí vzorků pro budoucí AKI (akutní poškození ledvin) GWAS a ilustruje obtížnost při identifikaci robustních genetických rizikových faktorů pro heterogenní onemocnění, jako je AKI (akutní poškození ledvin).

Kromě toho analýzy kvantitativních lokusů exprese (eQTL) pravděpodobně pomohou při převodu poznatků získaných pomocí GWAS do mechanismů onemocnění. OTL analýzy mají za cíl identifikovat lokusy, které vysvětlují zlomek variance genové exprese ve tkáni a mohou být použity ke spojení SNP v nekódujícím genomu s expresí cílového genu. Například integrační přístup kombinující GWAS, eOTL a funkční experimenty vedl k identifikaci genů zapojených do patogeneze CKD [21-23].

Obrázek 2:Schéma vybraných omických technologií.

Transkriptomika

Nástup nových škálovatelných technologií pro studium transkriptomu buněk v poraněné ledvině způsobil revoluci v našem chápání buněčných odpovědí na AKI (akutní poškození ledvin), odhalující nové buněčné stavy a zvýraznění dynamicky se měnící transkripční krajiny opravující se ledviny. Sekvenování mRNA v ledvinách v průběhu jednoho roku po AKI (akutní poškození ledvin) prokázal časově specifické změny genové exprese související s tubulárním poškozením, proliferací, reparací, fibrózou a imunitou [24]. Tato myš AKI (akutní poškození ledvin) Údaje z biobanky ukázaly, že geny spojené se zánětem byly stále upregulovány jeden rok po AKI (akutní poškození ledvin), což naznačuje přetrvávající zánět jako hnací faktor progrese onemocnění do CKD. Hromadné sekvenování mRNA rutinních biopsií transplantovaných ledvin umožnilo profilování krátkodobých a dlouhodobých transkripčních změn u lidských ledvinových transplantátů vyvolaných ischemickým/reperfuzním poškozením (IRI) během transplantace [25]. Všechny biopsie ledvin byly odebrány v prvních hodinách po reperfuzi a vykazovaly podobný transkripční profil charakterizovaný aktivací genů s okamžitou až časnou odezvou, z nichž mnohé kódují transkripční regulační faktory.

Po 3 a 12 měsících po transplantaci však bylo možné vymezit dvě odlišné trajektorie spojené buď s zotavením, nebo progresí do CKD. Trajektorie podobná CKD vykazovala downregulaci v expresi genů souvisejících s mitochondriální biogenezí a upregulaci genů spojených se zánětem a fibrózou, jak bylo pozorováno na myším modelu AKI (akutní poškození ledvin) [24,25]. Studie na myších i lidech naznačují významnou roli aktivity T- a B-buněk a výskytu center terciární lymfoidní tkáně v dlouhodobých výsledcích AKI (akutní poškození ledvin) [25,26]. Analýza myšího AKI (akutní poškození ledvin) datové soubory biobank a transplantací lidské ledviny argumentují pro aktivitu B-buněk řízenou autoantigeny, která podporuje progresi onemocnění prostřednictvím trvalé imunitní reakce, jeden rok po AKI (akutní poškození ledvin) [27].

Přestože se hromadné sekvenování mRNA ukázalo jako vysoce informativní v AKI (akutní poškození ledvin) studiích nejsou touto technikou diferencovány reakce specifické pro buněčný typ. Genetické přístupy k označování různých typů buněk dodávají větší přesnost a další náhled. Například translační ribozomální afinitní purifikace (TRAP) využívá eGFP značení ribozomální podjednotky L10a k identifikaci specifické podskupiny mRNA v jednotlivých typech buněk procházejících aktivní translací [28]. První studie TRAP v AKI (akutní poškození ledvin) výzkum použil genetický model aktivace kazety eGFP-L10a zprostředkované CRE rekombinázou specificky v typech nefronových, stromálních, vaskulárních nebo imunitních buněk a ukázal zřetelné transkripční změny spojené s každým buněčným kompartmentem po AKI (akutní poškození ledvin) [29]. Mnoho genů souvisejících s renální tubulární funkcí bylo downregulováno 24 hodin po AKI (akutní poškození ledvin). Naproti tomu geny zapojené do aktivity antiapoptotické dráhy, buněčné proliferace a buněčného pohybu byly výrazně upregulovány. TRAP analýza buněk proximálního tubulu zvýrazněná markerem poškození Kim-1(kódovaným Hazel) ukázala, že většina Kim-1-pozitivních buněk se úspěšně opravila dva týdny po AKI (akutní poškození ledvin), i když 15 procent si zachovalo expresi Kim-1 a marker zranění Sox9 [10], což zvýraznilo trvale poškozený buněčný stav [30]. Klonální analýza odhalila, že expanze Kim-1 pozitivních klonů znovu osídlila poškozené proximální tubuly, což podporuje model opravy prostřednictvím dediferenciace buněk proximálních tubulů spíše než prostřednictvím specifické populace kmenových/progenitorových buněk [30]. Transkripce FoxMI byla vysoce upregulována v Kim-1-pozitivních buňkách proximálního tubulu a ukázalo se, že řídí proliferaci proximálního tubulu in zitro způsobem závislým na receptoru epidermálního růstového faktoru [30]. Vysoce výkonné přístupy sekvenování jednobuněčné mRNA, zkoumající profily sekvenování mRNA celé buňky (scRNA-seq) nebo transkripty mRNA lokalizované v jádře (snRNA-seq), dramaticky zvýšily AKI (akutní poškození ledvin) studia. Tyto přístupy poskytují hluboký molekulární vhled do genové exprese na buněčné úrovni v kombinaci s výkonnými výpočetními přístupy, které identifikují různé typy buněk a buněčné stavy v celém orgánu [31,32]. scRNA-seq začíná ze suspenze jednotlivých buněk nebo jednotlivých jader, které jsou označeny jedinečnými molekulárními značkami a lyžovány (obrázek 2). mRNA je následně reverzně transkribována, amplifikována a sekvenována. Studie snRNA-seq na ledvinách vystavených unilaterální ureterální obstrukci (UUO) identifikovala dva nové shluky buněk proximálního tubulu 14 dní po UUO, z nichž jeden měl silný proliferativní podpis, zatímco druhý exprimoval geny zapojené do zánětu a buněčných pohybů, jako je např. Ccl2, II34, Cxcll a Dock10 [33].

Podobná buněčná populace je patrná ve studii snRNA-seq profilující poškozenou ledvinu po IRI [34]. V prvních hodinách po IRI dochází k downregulaci normální exprese genu pro proximální tubuly a výrazné transkripční odpovědi včetně okamžitých časných genů a známých markerů poškození HuverI a Krt20 [24,25,34]. Druhý den po IRI velká frakce buněk proximálního tubulu buď vykazovala proliferační profil, nebo znovu získala t transkripční signaturu charakteristickou pro diferencované buňky proximálního tubulu. Nicméně malá populace prozánětlivých, profibrotických buněk, charakterizovaných expresí Vcaml ve většině buněk a koexpresí Cal2 v podskupině, předpovídala aktivitu transkripčních faktorů rodiny NF-KB. Zatímco proliferující buňky proximálního tubulu poklesly dva týdny po AKI (akutní poškození ledvin), prozánětlivé, profibrotické buňky proximálního tubulu se zvýšily, což naznačuje vazbu mezi neúspěšnou tubulární reparací a pozorovanou populací prozánětlivých profibrotických buněk (obrázek 1). Je zajímavé, že dekonvoluční analýza studií hromadného sekvenování RNA naznačovala podobný nárůst populace, když ledviny stárly normálně a po transplantaci.

V souladu s výše uvedenou studií [34], geneticky selektivní zaměření na poškozené buňky proximálního tubulu čtyři týdny po mírnějším AKI (akutní poškození ledvin), pomocí myší Krt20-T2A-CRE-ERT2 ke značení a čištění poraněných buněk proximálního tubulu, vykázal podobný poraněný buněčný fenotyp: populaci buněk VcamI/Cal2 plus zraněného proximálního tubulu, která se dále vyznačovala silnou prozánětlivou ( např. Cal2, Vcam1, Cxcll, /34) a profibrotický (např. Pdgfb, ColAal) transkripční podpis s výraznou aktivací signalizace NF-KB, TNF a AP-1 [35]. Tyto poškozené buňky proximálního tubulu sdílely rysy sekrečního fenotypu spojeného se stárnutím (SASP) identifikovaného v jiných poraněných orgánech (obrázek 1)[35,36]. Na rozdíl od předchozího AKI (akutní poškození ledvin) studiích [12] nebyla v této populaci pozorována žádná významná zástava buněčného cyklu G2/M. Další experimenty s mapováním osudu cyklujících buněk ukázaly, že většina buněk VcamI plus /Cal2 plus proximálních tubulů, lokalizovaných na kortikomedulární hranici, byla vysledována zpět k buňkám proximálního tubulu proliferujícím v prvních dnech po AKI (akutní poškození ledvin). Kortikální buňky proximálního tubulu Vuamt plus /Cu2 však pravděpodobně představovaly sekundární místa poranění, která nesouvisela s opravou proximálního tubulu spojenou s časnou replikací.

komplexní atlas reakce na poranění na A unilaterální ischemickou reperfuzi (UIR) provádějící scRNA-seq ve více časových bodech od prvního dne do dne 14 poté, co UIR odhalil zvýšenou expresi Sox4 a Cd24a, genů identifikovaných pro roli ve vývoji ledvin v poraněných buňkách [37]. Byla také popsána nová buněčná populace, „buňky se smíšenou identitou“, vykazující koexpresi markerů proximálního tubulu (Sl34a7), tlusté ascendentní končetiny (Umod) nebo sběrného kanálku (Agp2). Údaje scRNA-seq z myší nefropatie kyseliny listové a modelů UUO ukázaly, že snížená exprese diferenciačních markerů, jako jsou nosiče rozpuštěných látek v poraněných buňkách proximálního tubulu, je spojena s downregulací genů zapojených do metabolických procesů, jako je oxidace mastných kyselin [38]. Jaderný receptor Esrra byl identifikován jako důležité spojení mezi diferenciací proximálního tubulu a metabolismem, protože přímo reguloval expresi metabolických a proximálních tubulů specifických genů. Tato a další studie scRNA-seq také upozornily na dříve nedoceněnou diverzitu imunitních buněk v nemocné ledvině [38,39].

Jedním z důležitých omezení všech diskutovaných transkriptomických technik je absence prostorových informací. Nové transkriptomické platformy nyní umožňují prostorově vizualizovat expresi mRNA nasedáním a fixací tkáňových řezů přímo na sondy s jedinečným čárovým kódem, zobrazením řezu tkáně a provedením reverzní transkripce in situ s následným uvolněním sondy a sekvenováním [40]. Sekvenované transkriptomy mohou být následně mapovány zpět na zobrazený tkáňový řez. Tato technologie prostorové transkriptomiky umožnila specifickou lokalizaci dvou transkripčně odlišných typů buněk segmentu proximálního tubulu S3 [41] do kortexu a vnějšího pruhu vnější dřeně [42]. U různých myších AKI (akutní poškození ledvin) modely, dekonvoluce jednotlivých prostorových transkriptomických skvrn pomocí scRNA-seq dat odhalila AKI (akutní poškození ledvin) modelově specifické vzory infiltrace imunitních buněk a umožnily identifikaci odlišné populace buněk proximálních tubulů exprimujících Af3-, kolokalizujících se s neutrofily po IRI [43]. Tyto studie ilustrují potenciál prostorově-časových omik předpovídat mikroprostředí kontroly buněčných reakcí po AKI (akutní poškození ledvin).

Epigenomika

Typy buněk specifické programy diferenciální genové exprese závisí na epigenetické modifikaci chromatinu (například methylace a acetylace histonů) a DNA (například methylací cytosinu na zbytcích CpG) v reakci na regulátory transkripce vázající DNA a související faktory. Hromadné množství důkazů naznačuje důležitou regulační roli pro epigenetické mechanismy v AKI (akutní poškození ledvin) a oprava ledvin [44-46]. Vzhledem k vynikajícím hloubkovým recenzím[44-47] pouze stručně zdůrazňujeme vybrané nedávné epigenomické studie v AKI (akutní poškození ledvin) výzkum.

Positively charged histone proteins provide the core for packing negatively charged DNA, through electrostatic interactions, into nucleosomes — the structural unit of chromosomes[44]. Modifications to the amino-terminal tails of histones alter the chromatin structure or recruit chromatin modifiers, thus altering gene expression. An unbiased mass spectrometry screen of 63 different histone marks in the healthy kidney revealed widespread histone modifications with a compartment-specific pattern [48]. In this bulk tissue analysis, few histone marks showed a quantitatively significant change >5 procent po UUO. Je zajímavé, že byly hlášeny komplementární změny v různých značkách na stejné aminokyselině, což naznačuje koordinovanou odpověď na AKI (akutní poškození ledvin) [48].

Zvýrazněné promotory H3K4me3-byly porovnány se zesilovači označenými H3K27ac po AKI (akutní poškození ledvin) pomocí imunoprecipitace chromatinu a sekvenování nové generace (ChIP-seq)[49]. Stránky aktivních zesilovačů vykazovaly dynamičtější změnu v reakci na AKI (akutní poškození ledvin). Modifikace chromatinu v místech aktivních zesilovačů byly spojeny se změněnou vazbou transkripčních faktorů, jako jsou Hnf4a, Gr a Stat3. Hnf4a je klíčovým transkripčním faktorem při specifikaci a diferenciaci buněk proximálního tubulu [50]. buňky proximálního tubulu se snížily v reakci na AKI (akutní poškození ledvin) [49]. To pravděpodobně přispívá k AKI (akutní poškození ledvin)-indukovaná dediferenciace poraněných buněk proximálního tubulu. Stat3 je klíčový transkripční regulátor v zánětlivé síti s NF-KB a regulačními faktory aktivátorového proteinu -1(AP-1) [51]. Aktivace dráhy AP-1 je vysoce konzervovaná jako počáteční reakce na myš AKI (akutní poškození ledvin) a IRI související s transplantací lidské ledviny [24,25]. Zapojení Stat3 v lokusu Junb jako odpověď na AKI (akutní poškození ledvin) naznačuje roli Stat3 inaktivace transkripčních komponent AP-1[49]. Kromě toho inhibice bromodomény a aktivace extraterminálního zesilovače (BET) narušila zotavení po AKI (akutní poškození ledvin), zdůrazňující důležitou roli dynamiky zesilovačů v AKI (akutní poškození ledvin)oprava[49].

ATAC-seq se stala nejpoužívanější metodikou pro hodnocení otevřenosti chromatinu a vyvozování aktivity regulačních a transkribovaných genomových oblastí. Technologie ATAC-seq se rychle posunula od citlivých hromadných tkáňových testů s pouze 500 buňkami k jednojaderné analýze a nejnověji paralelní analýze stavu chromatinu a genové exprese ve stejné buňce [41, 52-54]. ATAC-seq používá hyperaktivní transpozázu Tn5 k štěpení v otevřeném chromatinu a štěpení DNA pomocí DNA adaptérů pro usnadnění konstrukce knihovny a sekvenování DNA (obrázek 2). Vzhledem k tomu, že v každém genomu jsou pouze dvě cílová místa, data ATAC jsou řídká a studie snATAC využívají výpočetní přístupy ke seskupování buněk s podobnými profily snATAC a k integraci s nezávisle generovanými datovými soubory sc nebo snRNA-seq. Nedávná studie profilovala buněčnou heterogenitu ve vzorcích zdravých dospělých lidských ledvin pomocí počítačově integrovaných datových souborů snATAC-seq a snRNA-seq [55]. Je zajímavé, že studie identifikovala subpopulaci buněk proximálního tubulu exprimující VCAM{12}}, která vykazovala sníženou aktivitu HNF4A a zvýšenou aktivitu členů rodiny NF-KB, částečně připomínající prozánětlivé, profibrotické poškozené buňky proximálního tubulu identifikované v myších ledvinách týdny po AKI (akutní poškození ledvin) [34,35,55]. Hojnost této buněčné populace se časem zvyšovala u stárnoucích myší a byla vyšší u lidských diabetických ledvin než u zdravých kontrol. Zdá se tedy, že některé buněčné odpovědi jsou zachovány mezi různými onemocněními ledvin a napříč druhy. Do jaké míry však tato buněčná populace přispívá ke ztrátě funkce ledvin související s věkem anemoc ledvinprogrese vyžaduje další zkoumání.

Detekce buněčného typu a regulační predikce jsou zlepšeny společnou analýzou snRNA-seq a snATAC-seq ve stejném jádře[41]. Tato technika byla nedávno použita k charakterizaci zdravé lidské ledvinové tkáně a AKI (akutní poškození ledvin) a biopsie CKD odhalující novou buněčnou diverzitu v normální ledvině a zdůrazňující srovnatelné stavy poškození u myší a lidských AKI (akutní poškození ledvin), stejně jako změněné stavy tlustých ascendentních končetinových buněk charakterizovaných expresí Proml a Dcd2[56]. Prostorová transkriptomika navíc lokalizovala myofibroblasty a imunitní buňky ve vzorcích CKD do míst poškození proximálního tubulu [56].

Cistanche obnovit narušenou funkci ledvin

Proteomika a metabolomika

Studium proteinů a metabolitů v plazmě, moči a tkáni ledvin pomocí gelové elektroforézy a hmotnostní spektrometrie doplňuje transkriptomické a epigenomické nástroje. Hmotnostní spektrometrie může identifikovat a kvantifikovat makromolekuly (např. proteiny) a buněčné metabolity v komplexní tkáni a měřit molekulárně odlišné vlastnosti hmotnostního náboje molekul, když jsou ionizovány a vystaveny magnetickému nebo elektrickému poli (obrázek 2)[57]. Mnoho proteomických studií bylo zaměřeno na identifikaci biomarkerů pro AKI (akutní poškození ledvin)(komplexně zkontrolováno jinde[57-59]). Ukázalo se například, že hladiny inhibitoru metaloproteinázy-2(TIMP2) a IGF-binding protein-7(IGFBP7) urinární tkáně jsou prediktivní pro úmrtí a selhání ledvin u kriticky nemocných pacientů s AKI (akutní poškození ledvin) [60]. Léčba kopozitivních pacientů s TIMP2 a IGFBP7 opatřeními podpůrné péče podle pokynů pro zlepšení globálních výsledků onemocnění ledvin (KDIGO) pro pacienty s vysokým rizikem AKI(akutní poškození ledvin) snížené AKI (akutní poškození ledvin) vývoj během prvních 72 hodin po kardiochirurgickém výkonu, ale neovlivnil mortalitu a potřebu renální substituční terapie [61]. Tyto výsledky a zjištění z jiných studií biomarkerů jsou povzbudivé; nicméně ideální biomarker nebo pravděpodobněji panel biomarkerů pro AKI (akutní poškození ledvin)hodnocení rizik, cílené AKI (akutní poškození ledvin)prevence, prediktivní diagnostika a možná i terapeutické vedení v běžné klinické praxi dosud nebyly identifikovány.

Kromě snahy o efektivní AKI (akutní poškození ledvin) biomarkery, proteomiku lze také použít k dotazování AKI (akutní poškození ledvin) patofyziologie [62]. Preklinická studie AKI indukované cisplatinou (akutní poškození ledvin)odhalili slabou korelaci mezi transkriptomem a proteomem v poraněné ledvině [63]. Studie naznačila, že rozpor mezi těmito dvěma přístupy byl způsoben změnami proteinů v extracelulárním kompartmentu, například v komplementovém systému [63]. Je zajímavé, že rozsah disociace mezi RNA a expresí proteinu silně koreloval se závažností poranění, jak naznačují hladiny kreatininu v séru a dusíku močoviny v krvi [63]. To zdůrazňuje význam post-transkripčních změn v AKI (akutní poškození ledvin)Odezva.

V poslední době se k identifikaci proteinů specifických pro glomerulární a proximální tubulární kompartment ve zdravé ledvině používá téměř jednobuněčné proteomické profilování, které umožňuje kvantitativní proteomická měření od pouhých 10 do 100 laserovým záchytem mikrodisekovaných ledvinových buněk [64]. . Některé z nejvíce obohacených kompartmentově specifických proteinů dobře korelovaly s expresí odpovídajícího genu v podocytu a shluku proximálních tubulů souboru dat scRNA-seq. Kromě toho lze více než 40 proteinových markerů současně detekovat na jednom tkáňovém řezu pomocí zobrazovací hmotnostní cytometrie (IMC), což umožňuje studium proteomu v prostorovém kontextu [65]. IMC zdravé lidské ledviny odhalila neočekávanou buněčnou heterogenitu a identifikovala vzácný typ buněk pozitivní na megalin/aquaporin-1/vimentin (Lrp2/Aqp1/Vim), který potenciálně odráží poškozený (Vim plus) proximální tubul (Lrp2 plus /Aqp1 plus )stav buňky [65]. Aplikace těchto technologií na AKI (akutní poškození ledvin) výzkum poskytne kritické vhledy do proteomické krajiny zranění a oprav.

Studium metabolomu ledvin (molekuly menší než 1500 Da [62]) dále pokročilo v chápání AKI (akutní poškození ledvin) patofyziologie.

Metabolomický

profilování poraněné ledvinové tkáně pomocí kapalinové chromatografie-hmotnostní spektrometrie vedlo ke zjištění, že de neo nikotinamid adenindinukleotid(NAD plus) syntéza je narušena u AKI (akutní poškození ledvin) [66]. Downregulace mitochondriálního regulátoru biogeneze PGCla u AKI (akutní poškození ledvin) vedla k lokální depleci NAD, zatímco nadměrná exprese PGC1 zvýšila renální hladiny NAD plus a snížila AKI (akutní poškození ledvin) [66]. Nestranné screeningy moči také prokázaly zvýšené hladiny NAD plus prekurzor chinolinu v moči myší po IRI [67] v důsledku snížení renální chinolin fosforibosyltransferázy (QPRT), klíčového enzymu v de novo NAD plus syntéze [67]. Snížené renální hladiny QPRT byly spojeny s vyšší AKI(akutní poškození ledvin) náchylnost [67]. Perorální léčba nikotinamidem zachráněná AKI (akutní poškození ledvin) indukovaný renální NAD plus biosyntetický deficit u myší a malá klinická studie fáze 1 naznačila potenciální renální přínos léčby nikotinamidem u pacientů podstupujících kardiochirurgický výkon [67]. Metabolomická studie biopsií transplantátu lidské ledviny před a po reperfuzi prokázala zřetelně odlišný metabolický profil transplantátů s budoucí opožděnou funkcí štěpu ve srovnání s transplantáty bez opožděné funkce štěpu [68]. Transplantace s budoucí opožděnou funkcí štěpu byly charakterizovány přetrvávajícím katabolismem ATP/GTP, což naznačuje brzké obnovení energetické homeostázy jako terapeutický cíl u AKI (akutní poškození ledvin) prevence [68]. Hmotnostní spektrometrie (MSI) je výkonná technika používaná k vizualizaci prostorové distribuce metabolitů, proteinů nebo lipidů s buněčným a subcelulárním rozlišením [69]. MSI analýza poraněných ledvin prokázala lipidomické použití ch coll .x7rr k rozlišení mezi mírnou a těžkou ischemií již 2 hodiny po poranění [70,71].

Závěry a perspektiva

Dostupné omické technologie podpořily naše chápání AKI (akutní poškození ledvin) a oprava. Integrace nebo současné získávání různých omických datových souborů dále zlepší náhled na AKI (akutní poškození ledvin) a potvrzující zjištění z ortogonálních přístupů dodají identifikovaným mechanismům další důvěru. Díky investicím NIDDK do několika velkých konsorcií, včetně projektu Kidney Precision Medicine Project a Rebuilding a Kidney Program, přibývají nové poznatky, nástroje a informační zdroje. Velkou výzvou této éry „velkých dat“ je odvodit biologicky relevantní mechanismy z vysoce složitých souborů dat, abychom demokratizovali přístup k těmto datům prostřednictvím uživatelsky přívětivých platforem pro prohlížení a analýzu dat a nakonec převedli naše rostoucí patofyziologické poznatky do diagnostických a terapeutické strategie, které zlepšují péči o pacienty a AKI (akutní poškození ledvin) výsledky.

Prohlášení o konkurenčním zájmu

Autoři deklarují následující finanční zájmy/osobní vztahy, které lze považovat za potenciální konkurenční zájmy: APM je vědeckým poradcem pro přístupy k onemocněním lidí souvisejících s ledvinami pro bioterapeutika Novartis, eGenesis, Aviva a Trestle.

Poděkování

Omlouváme se všem badatelům, o jejichž práci nebylo možné diskutovat z důvodu prostorových omezení. Děkujeme Dr. Pietro E. Cippà za kritické přečtení rukopisu. LMS Gerhardt byl podpořen německou výzkumnou nadací (DFG), Německo postdoktorským stipendiem (GE 3179/1-1). Práce v laboratoři AP McMahona je podporována granty NIDDK, Spojené státy americké (DK126024,54364,126925) a ChanZuckerberg Initiative, Spojené státy americké (CZIF2019-002430).

Reference

Dokumenty zvláštního zájmu, publikované v období přezkumu, byly označeny jako:

1. Chertow GM, Burdick E, Honor M, Bonventre JV, Bates DW:Akutní poškození ledvin, úmrtnost, délka pobytu a náklady u hospitalizovaných pacientů. JASN (J Am Soc Nephrol) 2005, 16:3365-3370.

2. Mehta RL, Cerda J, Burdmann EA, Tonelli M, Garcia-Garcia G, Jha V, Susantitaphong P, Rocco M, Vanholder R, Sever MS a kol: Iniciativa International Society of Nephrology 0by25 proakutní poškození ledvin(nula úmrtí, kterým lze předejít do roku 2025): případ lidských práv pro nefrologii. Lancet 2015, 385:2616-2643.

3. Hsu RK, Hsu CY: Roleakutní poškození ledvinpři chronickém 3. H onemocnění ledvin. Semin Nephrol 2016, 36:283-292.

4. Chawla LS, Eggers PW, Star RA, Kimmel PL:Akutní poškození ledvina chronické onemocnění ledvin jako vzájemně propojené syndromy. N Engl J Med 2014, 371:58-66.

5. Legrand M, Bell S, Fomi L, Joannidis M, Koyner JL, Liu K, 5, 1; Cantaluppi V: Patofyziologie COVID-19-souvisejícíakutní poškození ledvin. Nat Rev Nephrol 2021.https://doi.org/10.1038/s41581-021-00452-0. Tato recenze poskytuje podrobný přehled aktuální literatury související s COVID-19-akutní poškození ledvin.

6. Zuk A, Bonventre JV: Nedávné pokrokyakutní poškození ledvin6. 2 a jeho důsledky a vliv na chronické onemocnění ledvin. F Curr Opin Nephrol Hypertens 2019,28:397-405. Tento vynikající přehled shrnuje patofyziologické mechanismy, které jsou základem přechodu z akutního na chronické poškození ledvin, a zdůrazňuje roli mitochondriální dysfunkce, zánětu, stárnutí a buněčné smrti v tomto procesu.

7. Saran R, Robinson B, Abbott KC, Agodoa LYC, Bragg Gresham J, Balkrishnan R, Bhave N, Dietrich X, Ding Z, Eggers PW, et al: US Renal data system 2018 Annual data report: epidemiology of renal disease in Spojené státy. AmJ Kidney Dis 2019,73:A7-Výroční zpráva A8.US Renal Data System 2018 k dispozici na: https://www.usrds.org/media/2282/2018_svazek{{9} }ckd{10}}v_souboru_us.pdf. (Přístup 11. dubna 2021).

8. Ferenbach DA, Bonventre JV: Mechanismy maladaptivní 8. opravy po AKI (akutní poškození ledvin), což vede k urychlenému stárnutí ledvin a CKD. Nat Rev Nephrol 2015, 11:264-276.

9. Kusaba T, Lalli M, Karmann R, Kobayashi A, Humphreys BD: 9. Diferencované epiteliální buňky ledvin opravují poškozené proximální tubuly. Proc Natl Acad Sci US A 2014,111:1527-1532. 10. Kumar S, Liu J, Pang P, Krautzberger AM, Reginensi A,

10. Akiyama H, Schedl A, Humphreys BD, McMahon AP: Aktivace Sox9 zvýrazňuje buněčnou dráhu renální opravy v akutně poraněné ledvině savců. Cell Rep 2015,12:1325-1338.

11. Kang HM, Huang S, Reidy K, Han SH, Ching F, SusztakK: Sox9 pozitivní progenitorové buňky hrají klíčovou roli v regeneraci epitelu renálních tubulů u myší. Cell Rep 2016,14:861-871.

12. Yang L, Besschetnova TY, Brooks ČR, Shah JV, Bonventre JV: Zastavení epiteliálního buněčného cyklu v G2/M zprostředkovává fibrózu ledvin po poranění. Nat Med 2010, 16:535-543.

13. Xu K, Rosenstiel P, Paragas N, Hinze C, Gao X, Shen TH, Werth M, Forster C, Deng R, Bruck a kol: Unikátní transkripční programy identifikují podtypy AKI (akutní poškození ledvin).JASN (J Am Soc Nephrol) 2017, 28:1729-1740.

14. Mar D, Gharib SA, Zager RA, Johnson A, Denisenko O, Bomsztyk K: Heterogenita epigenetických změn při ischemii/reperfuzi a endotoxinem indukovanýchakutní poškození ledvingeny. Kidney Int 2015, 88:734-744.

15. Stafford-Smith M, Li YJ, Mathew JP, Li YW, Ji Y, Phillips-Bute B, Milano CA, Newman MF, Kraus WE, Kertai MD, et al.: Genome-wide Association study ofakutní poškození ledvinpo operaci koronárního bypassu identifikuje ložiska citlivosti. Kidney Int 2015, 88:823-832.

16. Zhao B, Lu Q, Cheng Y, BelcherJM, Siew ED, Leaf DE, Body SC, Fox AA, Waikar SS, Collard CD a kol.: Genomová asociační studie k identifikaci jednonukleotidových polymorfismů proakutní poškození ledvin.Am J Respir Crit Care Med 2017, 195:482-490.

17. Kayagaki N, Lee BL, Stowe IB, Kornfeld OS, O'Rourke K, Mirrashidi KM, Haley B, Watanabe C, Roose-Girma M, Modrusan Z, et al: IRF2 transkripčně indukuje expresi GSDMD pro pyroptózu. Sci Signal 2019, 12.

18. Matsuyama T, Kimura T, Kitagawa M, Pfeffer K, Kawakami T, Watanabe N, Kündig TM, Amakawa R, Nishihara K, Wakeham A: Cílené narušení IRF-1 nebo IRF-2 vede k abnormální indukce genu typu IIFN a aberantní vývoj lymfocytů. Cell 1993, 75:83-97.

19. Papaioannou VE: Genová rodina T-boxu: objevující se role ve vývoji, kmenové buňky a rakovina. Vývoj 2014.141:3819-3833.

20. Renken IJE, Vilander LM, Kaunisto MA, Vaara ST, Snieder H, Keus F van der Horst ICC, Pettilä V∶Žádná souvislost mezi genetickými lokusy v blízkosti IRF2 a TBX1 aakutní poškození ledvinv kriticky nemocných.AmJ Respir Crit Care Med 2019,201:109-111.