ČástⅠMetabolické chápání genetické dysregulace v mikroprostředí nádoru ledvin ledvinového karcinomu z jasných buněk

Abstraktní

Metabolická dysregulace je charakteristickým znakem rakovin včetně KIRC, specificky způsobených změnami v metabolických genech. V současnosti neexistuje konsenzus mezi metabolickými signaturami v mikroprostředí nádoru. V této studii jsme pozorovali významné korelace odlišně exprimovaných metabolických genů (DEmG) mezi KIRC a souvisejícími normálními vzorky. Stručně řečeno, shromáždili jsme sady metabolických genů prostřednictvím RNA-seq dat KIRC a normálních tkání z TCGA, poté jsme identifikovali DEmG související s KIRC. Dále byli pacienti klasifikováni do tří shluků a pomocí WGCNA jsme identifikovali metabolické geny zapojené do přežití mezi různými shluky.

Dále jsme zkoumali přežití a klinické parametry spolu s imunitní infiltrací v klastrech. Zároveň jsme zkonstruovali a ověřili predikční model založený na těchto DEmG. Tyto analýzy odhalily, že pacienti s vysokou expresí DEmG vykazovali špatné přežití, zatímco infiltrace méně imunitních buněk byla spojena s metastázou KIRC. Nakonec jsme identifikovali NUDT1 jako hub gen, protože vykazoval významně vysokou expresi ve vzorcích KIRC a také spojenou s přežitím a prognózou pacientů. Další analýza odhalila onkogenní roli NUDT1 v buňkách 786-O a ACHN. Dospěli jsme tedy k závěru, že NUDT1 by mohl být potenciálním diagnostickým a prognostickým markerem pro KIRC.

Klíčová slova

metabolická dysregulace; Diferenciálně exprimované metabolické geny (DEmG); Míra přežití; NUDT1;Výhody Cistanche.

Chcete-li to vědět, klikněte semÚčinky Cistanche

Úvod

Ledvinný karcinom z jasných buněk ledvin (KIRC) je typ renálního karcinomu (RCC), který je považován za jeden z běžných typů rakoviny, který představuje 70–80 procent případů [1] a řadí se na 16. místo nejčastější příčiny úmrtnosti související s rakovinou. po celém světě [2]. Renální buněčný karcinom (RCC) je nejčastějším typem rakoviny ledvin a tvoří 90 procent případů rakoviny ledvin [3]. V poslední době se široce využívá bioinformatická identifikace potenciálních markerů u rakoviny, ale bylo identifikováno pouze několik spolehlivých biomarkerů KIRC nebo většina markerů dosud není plně validována. K objasnění potenciálního mechanismu biogeneze a progrese KIRC jsou tedy nezbytné bioinformatické analýzy spojené s experimentálními validacemi [4]. Hluboké zkoumání nádorového mikroprostředí a rozvoj imunoterapie umožnily studovat interakci mezi nádory a imunitním systémem [5]. Přesto u mnoha identifikovaných biomarkerů nebyl studován jejich účinek na buněčný fenotyp a příslušné základní molekulární mechanismy v KIRC [6]. Prognóza pacientů s KIRC je však špatně pochopena a celkové 5-roční přežití je méně než 10 procent po první diagnóze [7, 8]. Obecně platí, že normální tkáně převážně obsahují vysoké hladiny antiangiogenních faktorů. Porucha hladiny těchto faktorů může aktivovat proangiogenní faktory, které dále zvyšují abnormální rychlost dělení buněk vedoucí ke vzniku nádoru [9]. V tomto procesu nádorové buňky exprimují vysokou hladinu proangiogenního růstového faktoru a tento efekt podporuje vývoj nových krevních cév v nádorech [10]; tím začíná vývoj nádoru. Na tumorigenezi se tedy podílí mnoho dalších faktorů, včetně infiltrace imunitních buněk a exprese různých metabolických genů. Je dobře známo, že přítomnost různých typů imunitních buněk v mikroprostředí nádoru do značné míry ovlivňuje progresi nádoru a imunoterapii; alterace genů souvisejících s imunitou tedy ovlivňují i ​​podíl a funkci imunitních buněk v nádorovém mikroprostředí [11]. Například infiltrace imunitních buněk do mikroprostředí nádoru významně ovlivňuje vznik gliomu [12]. Navzdory nedostatečnému zájmu o metabolické geny, které ovlivňují rakovinu, současné studie obnovily povědomí o rakovině jako metabolické poruše [13, 14]. Tyto studie poskytují základ pro zařazení metabolického přeprogramování jako nového znaku maligní transformace [15]. Exprese všech metabolických genů nebo drah mezi různými tkáněmi včetně nádorů a normálních tkání se však navzájem liší a je do značné míry neprozkoumaná, zejména v KIRC.

Celkově je v KIRC k dispozici menší počet spolehlivých biomarkerů pro predikci prognózy a imunoterapeutických odpovědí; proto je těžké dosáhnout úplného klinického úspěchu. Komplexní bioinformatické studie spojené s experimentálními validacemi by proto mohly objasnit potenciální mechanismy biogeneze a progrese KIRC. Současná studie je tedy zaměřena na komplexní posouzení účinků metabolických drah na metabolické transkripční profily v KIRC ve srovnání s jejich odpovídajícími normálními tkáněmi. Zde jsme úspěšně nejen segregovali různá místa onemocnění nebo různé molekulární podtypy stejného onemocnění, ale také předpověděli odpověď na terapii cílenou na metabolismus. To představuje nový způsob identifikace mechanismu, kterým jsou metabolické dráhy u malignity narušeny, a nabízí nové cíle pro klinické intervence.

Standardizované Cistanche

Materiály a metody

1. Akvizice dat.

Data sekvenování RNA (FPKM) relevantní pro KIRC byla přímo stažena z The Cancer Genome Atlas (TCGA). Následně byla data zpracována podle požadovaných navazujících aplikací. Kromě toho byla z UCSC Cancer Browser získána klinicko-patologická data pro odpovídající pacienty s KIRC, včetně pohlaví, rasy, věku, umístění nádoru, histologické klasifikace, stupně diferenciace, stadia nádoru a informací o přežití. Abychom získali přehled o metabolické heterogenitě pacientů s KIRC, byly soubory metabolických genů převzaty z předchozích publikací [16, 17]. Grafický abstrakt této studie je zobrazen na doplňkovém obrázku 1 a podrobný pracovní postup získávání dat a následné procesní studie je zobrazen na doplňkovém obrázku 2.

2. Identifikace diferenciálně exprimovaných metabolických genů (DEmG).

Soubory metabolických genů byly identifikovány průnikem dvou datových souborů a použity pro DEG analýzu mezi nádorovými a normálními vzorky. Později jsme také identifikovali DEmG pomocí WGCNA a na základě režimů přežití je pacienti klasifikovali do tří shluků. Stručně řečeno, pacienti byli rozděleni do tří shluků, jmenovitě na shluk C1, shluk C2 a shluk C3. K identifikaci stupňů byly použity lineární modely s využitím R balíku limma. Jako prahová hodnota pro identifikaci DEG byla nastavena hodnota p upravená mírou falešného objevu (FDR) < 0,05 v kombinaci se současnou absolutní hodnotou log2 násobné změny, logFC > 1 a logFC < -1. Grafy sopek byly vytvořeny pomocí ggplot2. Geny s logFC > 1 byly považovány za upregulované a geny s logFC < −1 byly přiřazeny jako downregulované geny.

3. Funkční analýzy obohacení a interakce protein-protein.

Analýzy obohacení pomocí podmínek GO a KEGG byly provedeny prostřednictvím profilu R package Cluster. Termíny GO byly rozděleny do tří kategorií včetně molekulárních funkcí (MF), buněčných složek (CC) a biologických procesů (BP). K určení významných rozdílů a korelací DEmG mezi nádorovými a normálními tkáněmi jsme použili výpočetní software GSEA (analýza obohacení genové sady). Byly provedeny KEGG a GO (Gene Ontology) analýzy obohacení DEG, aby se identifikovaly potenciální cesty a funkce. Kromě toho byla aplikace cystoskopu použita ke konstrukci sítě protein-protein interakce (PPI) DEmG. Počáteční PPI byl získán z databáze STRING. Nejvyšší limit spolehlivosti byl nastaven na 0.9.

4. Analýza přežití.

Diferenciálně exprimované geny u pacientů s rakovinou ledvin byly identifikovány prostřednictvím balíčku limma a odlišně exprimované geny byly analyzovány pomocí balíčku WGCNA k provedení koexprese, aby se vytvořila koexpresní síť, která identifikovala celkem 6 modulů.=5 a síť je bezškálová síť. Prognostický význam DEmG identifikovaných WGCNA v režimu přežití byl stanoven pomocí Kaplan-Meierových (KM) grafů s log-rank testem.

Cistanche pilulky

5. Analýza imunitní infiltrace.

Imunitní a stromální buňky byly vypočteny pomocí R balíčku, "xCELL;" vzorky s p < 0:05 byly vybrány pro další analýzu. Kromě toho byly imunitní buňky obsahující biologické markery analyzovány pomocí R balíčku GSVA. Navíc, abychom analyzovali čistotu nádoru, použili jsme algoritmus ESTIMATE k odhadu stromálního a imunitního skóre řady tkání KIRC.

6. Konstrukce predikčního modelu.

Diferenciálně exprimované metabolické geny byly získány z dat sekvenování RNA nádorů KIRC s informacemi o přežití a pacienti byli náhodně rozděleni do tréninkových a testovacích kohort pomocí balíčku R "caret;" poté byla na DEmG provedena jednorozměrná analýza přežití. Dále byla provedena LASSO analýza pomocí R balíčku "glmnet;" a pro optimalizaci predikčního modelu byl použit model postupně proporcionálních rizik.

7. Buněčná kultura.

Buněčné linie lidského karcinomu ledvin 786-O a ACHN byly zakoupeny od American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA, USA). Buněčné linie 786-O byly kultivovány v médiu RPMI 1640 (kat. č. 11875093, Invitrogen, Carlsbad, CA, Spojené státy americké) doplněném 10% fetálním bovinním sérem (kat. č. 04-001- 1ACS, Biological Industries, Izrael). Buněčné linie ACHN byly kultivovány v médiu MEM (kat. č. 41500034, Invitrogen, Carlsbad, CA, Spojené státy americké) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra. Všechny kultury byly inkubovány při 37 °C a 5 procentech CO₂ve zvlhčeném inkubátoru.

8. Kvantitativní PCR v reálném čase.

Celková RNA z buněčných linií a tkání KIRC byla izolována pomocí TRIzol (kat. č. 9109; TaKaRa, Tokio, Japonsko) podle protokolů výrobce. RT-qPCR byla provedena pomocí QuantiNova SYBR Green PCR Kit (kat. č. 208054, QIAGEN, Düsseldorf, Německo). Relativní genová exprese byla vypočtena pomocí 2^−ΔΔCtmetoda. Sekvence primerů jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1.

9. Test buněčné životaschopnosti.

Cytotoxicita po transfekci NUDT1 siRNA v 786-O a ACHN byla stanovena pomocí testu Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (kat. č. C0038, Beyotime Biotechnology Co. Ltd., Čína). Sekvence NUDT1 siRNA jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1. Byly syntetizovány z GenePharma (Shanghai, Čína). Stručně, obě buněčné linie 786-O a ACHN v logaritmické růstové fázi (24 hodin po transfekci siRNA) byly shromážděny a rozděleny do 96-jamkových destiček pro kultivaci buněk (1000 buněk/jamku). Následující den bylo do každé jamky přidáno 10 ul CCK-8. Po inkubaci při 37 °C po dobu dalších 2 hodin byla detekována optická hustota (OD) buněk při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA).

10. Test buněčné migrace, invaze a apoptózy.

Buňky KIRC {{0}}}O a ACHN byly transfekovány pro knockdown NUDT1 zprostředkovaný siRNA. Po 24 hodinách transfekce byly buňky nasazeny do 6-jamkových destiček pro test hojení ran. Poté, co buňky dosáhly 100% konfluence, byly rány vytvořeny v buňkách jako monovrstva pomocí plastové špičky pipety. Buňky byly poté promyty PBS a kultivovány dalších 48 hodin. Vzdálenost uzavření rány byla vizualizována mikroskopem a vyfotografována pro měření účinku knockdownu NUDT1 na buňky KIRC 786-O a ACHN. Buněčná migrace a invaze byly provedeny pomocí transwell 24-jamkových destiček (Corning, New York, NY). Stručně řečeno, stejný počet buněk byl kultivován v médiu bez FBS v horní komoře a migrace buněk byla pozorována ve spodní komoře transwell, kde bylo médium doplněno 10 procenty FBS. Komůrky Transwell byly pečlivě promyty a obarveny 0,2% krystalovou violetí, vizualizovány a fotografovány; později byly rozdíly mezi migrovanými buňkami mezi negativní kontrolou a knockdownem NUDT1 stanoveny jednoduchým počítáním buněk. Test apoptózy byl proveden po 72 hodinách transfekce, buňky byly sklizeny, promyty a resuspendovány v ledově chladném PBS. Buňky byly poté detekovány soupravou Apoptosis Detection Kit (kat. č. KGA1013, KeyGen BioTech, Nanjing, Čína) podle pokynů výrobce a vyšetřeny průtokovou cytometrií (FACScan; BD Biosciences). Všechny experimenty byly provedeny trojmo.

11. Statistická analýza.

Všechny statistické analýzy byly provedeny na GraphPad prism (V7.0) a R (3.6.4), Wilcoxův test byl použit k porovnání infiltrace imunitních buněk v normální a nádorové tkáni a chí-kvadrát test byla provedena pro studium korelace mezi infiltrací imunitních buněk a patologickými parametry. Analýza rozptylu byla použita k porovnání imunitního skóre, stromálního skóre a čistoty nádoru mezi třemi shluky. Pro analýzu přežití byla p-hodnota vypočtena pomocí log-rank testu. P-hodnota<0.05 was considered statistically significant.

Doplňky Cistanche

Reference

[1] V. Nerich, M. Hugues, T. Nai a kol., "Klinický dopad cílených terapií u pacientů s metastatickým karcinomem ledvin z jasných buněk," Oncotargets and Therapy, sv. 7, s. 365–374, 2014.

[2] A. Znaor, J. Lortet-Tieulent, M. Laversanne, A. Jemal a F. Bray, "Mezinárodní variace a trendy v incidenci a mortalitě karcinomu ledviny," European Urology, sv. 67, č.p. 3, s. 519–530, 2015.

[3] B. Ljungberg, L. Albiges, Y. Abu-Ghanem a kol., "European Association of Urology Guidelines on Renal Cell Carcinoma: The 2019 Update," European Urology, sv. 75, č.p. 5, s. 799–810, 2019.

[4] W. Zheng, S. Zhang, H. Guo a kol., "Multi-omická analýza charakteristik nádorové angiogeneze a potenciálních mechanismů epigenetické regulace u renálního jasného buněčného karcinomu," Cell Communication and Signaling: CCS, sv. 19, č. 1, str. 39, 2021.

[5] J. Galon a D. Bruni, "Přístupy k léčbě imunitních horkých, změněných a studených nádorů pomocí kombinovaných imunoterapií," Nature Reviews Drug Discovery, sv. 18, č. 3, s. 197–218, 2019.

[6] W. du, L. Zhang, A. Brett-Morris a kol., "HIF řídí ukládání lipidů a rakovinu v ccRCC prostřednictvím represe metabolismu mastných kyselin," Nature Communications, sv. 8, č. 1, str. 1769, 2017.

[7] A. Jemal, R. Siegel, E. Ward a kol., "Cancer statistics, 2008," CA: A Cancer Journal for Clinicians, sv. 58, č.p. 2, s. 71–96, 2008.

[8] I. Lucca, T. Klatte, H. Fajkovic, M. de Martino a SF Shariat, "Erratum: Genderové rozdíly ve výskytu a výsledcích uroteliálního a ledvinového karcinomu," Nature Reviews Urology, sv. 12, č. 12, str. 653, 2015.

[9] IJ Fidler, "Angiogenesis and cancer metastasis," Cancer Journal, sv. 6, příloha 2, s. S134–S141, 2000.

[10] C. Kut, F. Mac Gabhann a AS Popel, "Kde je VEGF v těle? Metaanalýza distribuce VEGF u rakoviny," British Journal of Cancer, sv. 97, č.p. 7, s. 978–985, 2007.

[11] F. Ren, Q. Zhao, M. Zhao a kol., "Profilování imunitní infiltrace u rakoviny žaludku a jejich klinické důsledky," Cancer Science, sv. 112, č.p. 9, s. 3569–3584, 2021.

[12] X. Ge, Z. Wang, R. Jiang a kol., "SCAMP4 je nový prognostický marker a koreluje s progresí nádoru a imunitní infiltrací u gliomu," The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, sv. 139, 2021.

[13] MG Vander Heiden a RJ DeBerardinis, "Pochopení průniků mezi metabolismem a biologií rakoviny," Cell, sv. 168, č.p. 4, s. 657–669, 2017.

[14] DS Wishart, "Je rakovina genetické onemocnění nebo metabolické onemocnění?" biomedicína, sv. 2, č. 6, str. 478-479, 2015.

[15] D. Hanahan a RA Weinberg, "Hallmarks of cancer: the next generation," Cell, sv. 144, č.p. 5, s. 646–674, 2011.

[16] X. Peng, Z. Chen, F. Farshidfar a kol., "Molekulární charakterizace a klinická relevance podtypů metabolické exprese u lidských rakovin," Cell Reports, sv. 23, č. 1, s. 255–269.e4, 2018.

[17] S. Haider, A. McIntyre, RG van Stiphout, et al., "Genomic alterations underlie a pan-cancer metabolic shift asocied with tumor hypoxia," Genome Biology, sv. 17, č. 1, str. 140, 2016.

Junwei Xie,1,2,3,4,5 Lingang Cui,6 Shaokang Pan,1,2,3,4,5 Dongwei Liu,1,2,3,4,5 Fengxun Liu,1,2,3,4 ,5 a Zhangsuo Liu 1,2,3,4,5

1 Oddělení nefrologie, První přidružená nemocnice univerzity Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Čína

2 Výzkumný ústav nefrologie, Univerzita Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Čína

3 Research Center for Kidney Disease, Zhengzhou, 450052 Henan, Čína

4 klíčová laboratoř přesné diagnostiky a léčby chronického onemocnění ledvin v provincii Henan, Zhengzhou 450052, Čína

5 základní jednotka Národního centra klinického lékařského výzkumu onemocnění ledvin, Zhengzhou 450052, Čína

6 Urologická klinika, První přidružená nemocnice univerzity Zhengzhou, Zhengzhou 450052, Čína