další informace:ali.ma@wecistanche.com

Diskuse

Molekulární základy tvorby engramů byly oblastí velkého zájmu. Zde využíváme myší model TRAP k objasnění dynamiky dostupnosti chromatinu, 3-D genomové architektury a genové exprese po celou dobu života engramové buňky. Nejprve to přímo ukážemePaměťkódování má rozsáhlý a dlouhodobý účinek na dostupnost chromatinu. Jakmile je tento chromatinový stav ustaven, následují následující události jako napřPaměťZdá se, že konsolidace a vyvolání mají na chromatinovou krajinu menší vliv. Je možné, že zvolený časový bod pro vyvolání nemusí plně zachytit chromatinové události reaktivovaných buněk a následné změny chromatinu mohou být spojeny sPaměťznovukonsolidace nebo zánik8. Důležité je, že v souladu s předchozími publikacemi12, 13,23 to naše data naznačujíPaměťtvorba je z velké části jev řízený zesilovačem.

Pro paměť klikněte na Cistanche UK

Za druhé, naše studie poskytuje první komplexní krajinu architektury 3D genomu v různých fázíchPaměťformace, protože jsme ukázali re-lokalizaci velkých chromatinových segmentů a dynamické interakce promotor-enhancer v těchto kompartmentech, které umožňují jemné doladění různých transkripčních programů. Navíc jsme ukázali, že promotory down-regulovaných genů interagují častěji se zesilovači, které obsahují transkripční represory a naopak.

Nakonec naše práce poskytuje první důkaz o funkčním primingu, který je charakterizován počátečním zvýšením dostupnosti zesilovače během kódování, bez očekávaných transkripčních změn. Naše analýza odhalila, že při reaktivaci engramové neurony využívají podmnožinu interakcí denovopromotor-enhancer, kde jsou primárně aktivované zesilovače uvedeny do kontaktu s jejich příslušnými promotory, aby up-regulovaly geny zapojené do transportu mRNA a lokální translace proteinů v synaptických kompartmentech. Tyto změny odpovídaly očekávaným morfologickým a funkčním změnám. Souhrnně se zdá, že engramové buňky jsou označeny na epigenetické úrovni a souhra mezi dostupností chromatinu, 3D-genomovou architekturou a interakcemi promotor-enhancer popisuje dobře koordinovaný systém, který vede ke zpožděnému transkripčnímu nárůstu během reaktivace engramu.

Jako u každé jiné práce, i zde byla řada omezení. Použití myší TRAP závislých na tamoxifenu umožňuje dočasné rozlišení, ale otevírá okno pro označování asi 12 hodin, což by mohlo vést k nespecifickému značení neuronů, které nejsou součástí zkušenosti s CFC. Kromě toho, jak bylo dříve navrženo37, neurony označené Arc mohou být heterogenní a mohou zahrnovat různé soubory, které regulují obaPaměťdiskriminace a generalizace. Navíc jakýkoli časový bod před 1,5–2 hodinami (brzy) nebude dostatečný k zachycení transkripčních a translačních událostí způsobených rekombinací DNA, tj. exprese Cre rekombinázy a konečné exprese genu eYFP5. Domníváme se tedy, že mnoho časně přechodných shluků DEG bylo vynecháno, jak bylo dříve ukázáno, že mnoho IEG se po 2 hodinách vrací na základní úroveň (kromě Arc46). A konečně, ačkoli se naše studie zaměřila na hippocampus, strukturální a synaptická plasticita byla spojena s dlouhodobým ukládáním informací v jiných oblastech mozku, jako je prefrontální kůra, amygdala2. Budoucí studie by měly určit, zda tyto epigenetické změny mohou představovat globální kritický proces zapojený do dlouhodobého vytváření a uchovávání vzpomínek nebo zda jsou jedinečné pro hipokampální okruhy.

Metody

Myši a chování

Jak bylo popsáno dříve6, myši ArcCreERT2(plus) byly vyšlechtěny s homozygotní linií R26R-STOP-floxed-žlutý fluorescenční protein (eYFP). ~140 následných samčích potomků bylo genotypováno pomocí genotypizačního protokolu Jackson Laboratory. Myši byly umístěny po čtyřech až pěti v kleci ve 12hodinové (06:00–18:00) místnosti s kolonií světlo-tma při 22 stupních s 40–60procentní vlhkostí. Jídlo a voda byly poskytovány ad libitum. Behaviorální testování bylo prováděno během fáze světla. 1 hodinu před behaviorálním testem myši dostaly jednu dávku 4-Hydroxytamoxifenu (4- OHT, H6278, Sigma-Aldrich), čímž se otevřelo okno pro označování ~12 hodin5. Aby se minimalizovalo nespecifické označení eYFP, jeden den před behaviorálním úkolem (např. CFC) byly myši umístěny samostatně v 24h tmavé/temné komoře. Kromě toho, aby se snížila úroveň úzkosti, byla do klece přidána trubice pro úkryt a hnízdění. Následující den byl myším injikován TAM 1 hodinu před CFC. Po behaviorálním úkolu byly myši buď usmrceny po 1,5–2 hodinách a byly odebrány mozky. nebo umístit zpět do temné komory na následujících 48 hodin. Poté, co byly myši vyjmuty ze tmy, byly vráceny do normálního 12hodinového (06:00–18:00) cyklu světlo-tma ve stejné místnosti. O 3 dny později (celkem 5 dní po CFC) byla polovina kohorty myší usmrcena a byl odebrán mozek, zatímco druhá polovina se vrátila do testovací místnosti, kde byla vystavena narážce vyvolávající strach (tón a kontext) . Všechny práce na myších byly schváleny Výborem pro péči o zvířata Divize srovnávací medicíny na Massachusetts Institute of Technology. Cistanche se může zlepšitPaměť.

Cistanche může zlepšit paměť

Kontextové podmiňování strachu

Kontextový aparát pro kondicionování strachu (CFC) a akviziční program byly od TSE-Systems. Myši byly vloženy do CFC komůrky po 3 minutách počátečního přivykání 3 kilo Hz tón s intenzitou 80 DB byl prezentován po dobu 30 sekund a byl současně ukončen 0,7 mA šokem do nohy po dobu 1 sekundy. Mezi experimenty bylo k čištění klecí použito 70 procent isopropanolu. O 5 dní později byly myši uvedeny do původního kondicionovaného kontextu spárovaného s tónem a úrovně zmrazování byly měřeny po dobu 3 minut (výchozí parametry softwaru TSE používané k monitorování mrazivého chování), aby se vyhodnotil kontextPaměť. Kontext B byl modifikovaný kontext A. Nerezové tyče byly pokryty bílou plastovou vložkou, vnější stěny komor byly pokryty tvarovou lepicí páskou pro změnu vzhledu komory. Komora byla provoněná vanilkou, osvětlení místnosti bylo mnohem jasnější a myši byly přepravovány do přístroje v jiném vozíku než v kontextu A.

Drogy

Rekombinace u ArcCreERT2 × R26R-STOP-floxed-EYFP transgenních myší byla indukována pomocí 4-Hydroxytamoxifenu (4-OHT, H6278, Sigma-Aldrich). 4-OHT byl rozpuštěn ve 2,5 ml EtOH /100 procent a třepán na třepačce po dobu 30 minut. Dále bylo přidáno 5 ml kukuřičného oleje a třepáno na třepačce po dobu 1 hodiny. Nakonec byly zkumavky umístěny na 30 minut při 60 stupních, aby se umožnilo úplné odpaření EtOH. Jedna injekce 50 mg/kg byla injikována intraperitoneálně (ip).

Imunohistochemie (IHC)

Myši byly transkardiálně perfundovány ledově studeným 25 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a následně 4 0 ml 4% paraformaldehydu v PBS. Mozky byly odstraněny a následně fixovány ve 4% PFA přes noc při 4 stupních a přeneseny do PBS až do nařezání. Mozky byly namontovány na vibratomový stolek (Leica VT1000S) pomocí superglue a nařezány na řezy o tloušťce 40 μm. Řezy byly promyty PBS a blokovány pomocí 1 procenta bovinního sérového albuminu (BSA) připraveného v PBS obsahujícím 0,1 procenta Triton-X100 (PBST) po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Blokovací pufr byl odsát a řezy byly inkubovány s vhodnou primární protilátkou (doplňková tabulka 11) přes noc při 4 stupních na třepačce. Řezy pak byly promyty třikrát 15 minut, každý s blokovacím pufrem, a poté byly inkubovány s Alexa Fluor 488, 594 nebo 647 konjugovanými sekundárními protilátkami po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Po třech 15 minutových promytích, každé s blokovacím pufrem a jednom závěrečném promytí PBS po dobu 10 minut, byly řezy upevněny pomocí fluromount-G (Electron microscopic Sciences). Cistanche se může zlepšitPaměť.

In situ hybridizace (RNAscope®)

Vzorky byly připraveny na základě instrukcí výrobce pro multiplexní fluorescenční test RNAscope® v2 (Advanced cell diagnostics, USA), s několika modifikacemi a kombinovány s protokolem Immunohistochemistry (IHC). Nejprve byly vzorky obarveny na primární (Arc a GFP) a sekundární (Alexa Fluor 488, respektive 594) protilátky (jak je popsáno v protokolu IHC výše). Řezy mozku byly vloženy na podložní sklíčko a

dehydratována po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Dále byla kolem každé sekce nakreslena bariéra pomocí hydrofobního pera Immedge™ a vzorky byly ošetřeny peroxidem vodíku RNAscope® po dobu 10 minut při teplotě místnosti (neaplikováno žádné vyhledávání cíle a ošetření proteázou). Na základě pokynů výrobce byly řezy podrobeny hybridizaci sondy (RNAscope® Probe-Mm-Gria1, 26241, Advanced cell diagnostics), amplifikaci a vývoji signálu HRP-C1 pomocí kanálu TSA® Plus Cyanine 5. Cistanche může zlepšit paměť.

Zobrazovací analýza

Snímky byly pořízeny pomocí konfokálních mikroskopů LSM 710 nebo LSM 880 (Zeiss) s objektivy 10×, 20×, 40× nebo 63× při stejném nastavení pro všechny podmínky. Obrázky byly kvantifikovány pomocí ImageJ 1.42q nebo Imarisx64 8.1.2 (Bitplane, Zurich, Švýcarsko). Pro každou experimentální podmínku bylo pro kvantifikaci použito pět koronálních řezů z alespoň pěti zvířat. Cistanche může zlepšit paměť.

Quantification of tagged cells—The surfaces module was utilized to detect Arc+ and eYFP+ cells. Double positive cells (co-localization of Arc+/eYFP+) were then counted using the Surface-To-Surface Xtension module. After applying the 'area' filter (>6μM), aby se odstranilo nespecifické značení, byla kvantifikace dvojitě pozitivních buněk provedena v CA1, CA3 a DG. Cistanche může zlepšit paměť.

Kvantifikace proteinů Eif a Gria1/mRNA – Modul povrchů byl použit k detekci a 3D vykreslování axonů neuronů na základě signálu GFP. EiF2a, Eif4E, Eif3E a Gria1 -pozitivní punkta byly poté spočítány pomocí modulu spotů. Nakonec byl spuštěn modul Spots Close - To -Surface Xtension, aby našel podmnožinu bodů, které jsou blíže k povrchovým objektům, než je definovaný práh 1uM, a vyloučení bodů, které spadají mimo tento rozsah.

Morfologie trnů – trny byly klasifikovány do tří typů podle délky páteře (L), průměru hlavy (Dh) a průměru krku (Dn). Zavalité trny – Dn=L, Tenké trny – L > Dn a Dh Větší než nebo rovno Dn, Houby trny – Dh Větší než nebo rovno 2Dn, Zvětšené hřibové trny – Dh Větší než nebo rovno 2Dn.Cistanche může zlepšit paměť.

Cistanche může zlepšit paměť

Příprava tkáně

Hippokampální tkáň byla extrahována a bleskově zmražena. Po extrakci byly vzorky okamžitě homogenizovány v {{0}},5 ml ledově vychlazeného PBS s inhibitory proteázy (Pi) (11836170001, Roche ). Aby se co nejvíce zmírnil dopad třídění, pouze v experimentech NC-RNAseq a capture-HiC byla suspenze fixována 1 procentem (pro NC-RNAseq/HiC) nebo 2 procenty (pc-HiC) paraformaldehydem po dobu 10 minut, zchlazena s glycinem 2,5M po dobu 5 minut a dvakrát promyta 5 ml PBS. Tento proces zachovává transkripční a chromatinovou krajinu a minimalizuje zkreslení třídění. Pro ATACseq, RNAseq a capture-HiC byla suspenze centrifugována při 1200 g, 4 stupně po dobu 5 minut a peleta byla resuspendována v 5 ml hypotonického pufru NF-1 (0,5 procenta Triton X-100/ 0,1 M sacharóza/5 mM MgCl2/1 mM EDTA/ 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, Pi). Dále byla suspenze homogenizována (palička A) 30 zdvihy a palička byla promyta dalšími 5 ml NF-1 pufru na celkový celkový objem 10 ml. Suspenze byly shromážděny v 15ml kónické zkumavce, přefiltrovány pomocí 70 μm mesh filtru (08–771-2, Falcon) a inkubovány na ledu po dobu 30 minut. Peletovaná jádra (všechny centrifugy byly 4 stupně, 1600 x g po dobu 15 minut) byla resuspendována v 10 ml PBS plus 1 procento BSA plus Pi a inkubována na ledu po dobu 1 hodiny. Jádra byla odstředěna a peleta byla resuspendována v 1 ml PBST plus 1 procento BSA plus Pi a inkubována s primárními protilátkami NeuN, Arc a GFP přes noc ve 4 stupních. Nenavázané protilátky byly dvakrát promyty 5 ml PBS a nakonec resuspendovány v 1 ml PBS plus 1 procento BSA plus Pi a sekundární protilátky po dobu 2–4 hodin při 4 stupních. Po dvou promytích byla jádra resuspendována v 0,5 ml (PBS plus 1 procento BSA plus Pi) a filtrována přes 40 um mesh filtr pro třídění FACS. 4',6-Diamidin-2′-fenylindoldihydrochlorid (DAPI) byl přidán přímo do zkumavek FACS (1:5000, 10236276001, Sigma-Aldrich). Cistanche se může zlepšitPaměť.

Průtoková cytometrie

Pro průtokovou cytometrii byla jádra nejprve gatována pomocí parametrů oblasti pulzu s dopředným a bočním rozptylem (FSC-A a SSC-A) s vyloučením debris, následované vyloučením agregátů pomocí šířky pulzu (FSC-W a SSC-W). Poté bylo použito izotypové kontrolní barvení k nastavení bran NEUN plus, ARC plus a GFP plus. Pro zajištění homogenní neuronální populace byla populace NeuN plus hradlována před hradlováním populací na základě fluorescence ARC plus a GFP plus. Seřadili jsme čtyři různé populace ze tří různých časových bodů; Přibližně 1,5–2 hodiny po expozici FS i) NeuN plus /GFP plus ii) NeuN plus /GFP-. Po pěti dnech, v nepřítomnosti vyhledávání, jsme shromáždili iii) NeuN plus /GFP plus. V jiné kohortě byly myši znovu vystaveny podmíněnému stimulu. 1,5–2 hodiny po opětovné expozici jsme shromáždili iv) NeuN plus /ARC plus /GFP plus. Všechna jádra byla roztříděna do 1,5ml Eppendorfových zkumavek obsahujících; 500 ul PBS plus 1 procento BSA plus Pi pro ATCAseq, 200 ul štěpícího pufru (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit pro FFPE, kat. AM1975, Invitrogen) pro RNAseq, 500 ul čerstvé lýzy ledem pufr (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2 procenta Igepal CA-630, Pi a voda v kvalitě PCR) pro Hi-C/capture-HiC. Analýza dat byla provedena pomocí Flowjo (v10).

ChIP-qPCR

Ihned po následujícím třídění bylo 10, 000 buněk peletováno při 4 stupních, 1 600 x g po dobu 15 minut a resuspendováno v SDS lyzačním pufru. ChIP byl proveden na základě pokynů výrobce pro sadu ChIP-IT High Sensitivity® (HS) (katalogové č. 53040, Active Motif, USA) s použitím anti-H3K4me1 (Abcam, ab8895, 1:100) a anti-H3K27ac (Abcam, ab4729, 1:100) protilátky. ChIP testy byly provedeny v Bio-Rad CFX96 connect real-time PCR jednotce pomocí SsoFast™ EvaGreen® qPCR reagent mix (Bio-Rad, 172–5202). Vzorky byly testovány v triplikátech a výsledky byly normalizovány na vstup. Sekvence párů primerů pro testy ChIP–qPCR jsou uvedeny v doplňkové tabulce 12.

Cistanche může zlepšit paměť

ATAC-sekv

příprava knihoven— ATAC seq knihovny byly připraveny tak, jak bylo dříve popsáno v 49 s menší modifikací. 10,000 buněk z každé skupiny bylo odebráno z 8–10 různých myší a považováno za N=1. Pro přípravu knihovny byly použity 3–4 biologické replikáty (N=3–4). Ihned po následujícím třídění byly buňky odstředěny (4 stupně, 1 600 x g po dobu 15 minut) a resuspendovány v čerstvém 50 ul studeného lyzačního pufru (0,15 procenta NP-40 místo Igpal) a kývány na ledu po dobu 10 minut . Dále byla provedena segmentační reakce (Nextera DNA sample prep kit 24 responses, FC-121–1030, Illumina) v objemu 25 ul (12,5 ul TD, 1,25 ul TDE1, 11,25 ul vody bez nukleázy), po dobu 30 min při 37c s jemným kolébáním. Augmentované fragmenty DNA byly amplifikovány a kódovány pomocí PCR reakce (1 cyklus; 5 min – 72c, 30sec – 98c, 10 cyklů; 15sec – 98c, 30sec – 60c, 3min – 72c). Podle protokolu výrobce byla amplifikovaná DNA vyčištěna a purifikována pomocí kuliček 1,8x AMPure (AmpureXP beads, Beckman Coulter, A63880). Po bioanalyzátoru QC pro velikost a distribuci knihovny byly knihovny sekvenovány na platformě Illumina Nextseq 550 v MIT BioMicro Center. Cistanche může zlepšit paměť.

Analýza ATAC-seq – Nezpracovaná data fastq 40-odečtů párového sekvenování bp byla porovnána s referenčním genomem myši mm9 pomocí Bowtie 2.0 v režimu párového konce50. Kolekce Samtools51 byla použita k třídění, odstraňování duplikátů PCR (červené nahoru), indexování souborů BAM (index) a výpočtu statistik knihovny (flagstat, viz doplňková tabulka 13). Soubory BAM byly převzorkovány ze správně zarovnaných, spárovaných a jedinečných čtení na 50 milionů. Otevřené chromatinové píky byly analyzovány pomocí softwaru MACS252 Diferenciálně dostupné oblasti (DAR) byly identifikovány pomocí Diffbind v1.16.353 s výchozími parametry a nastaveními pro použití DESeq2 (mezní hodnota; FDR < 0,01;="" násobné="" změny=""> 1,5). Úplná matice normalizovaných počtů (RPKM54) byla získána pomocí balíčku DiffBind. Pro generaci bigwigových stop byly soubory se signálem pileup (pileup fragmentů na milion přečtení) v biografickém formátu konstruovány pomocí funkce špičky volání MACS2 s příznaky -B –SPMR. Poté bylo pomocí funkce bdgcmp MACS2 generováno normalizované násobné obohacení (FE) na vstupních lambda stopách s nastavením - m FE. Poté byly soubory bedGraph převedeny do formátu bigwig.Cistanche může zlepšit paměť

Pro vizualizaci velkých souborů byly použity nástroje IGV55. ChromHMM56 byl použit k vytvoření modelu stavu chromatinu ze dvou nezávislých studií, které využívaly objemovou tkáň hippocampu před a po šoku do nohy21,22 a ke stanovení nabídek násobného obohacení oproti modelu stavu. Analýza obohacení motivu57,58 a anotace píku byly provedeny nástroji HOMER59. Všechny kódy jsou k dispozici v doplňkovém softwarovém souboru