Část 2: Echinakosid izolovaný z Cistanche Tubulosa domněle stimuluje sekreci růstového hormonu prostřednictvím aktivace receptoru ghrelinu

Echinakosid izolovaný z Cistanche tubulosa domněle stimuluje sekreci růstového hormonu prostřednictvím aktivace receptoru ghrelinu

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4,* a Jason TC Tzen 1,*

1 Absolvent Ústavu biotechnologie, Národní univerzita Chung-Hsing, Taichung 402, Tchaj-wan; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL); s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Tchaj-wan; rd1@koda.com.tw

3 Ústav veterinárního lékařství, Národní univerzita Chung-Hsing, Taichung 402, Tchaj-wan; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Graduate Institute of Pharmacognosy, Taipei Medical University, Taipei 110, Taiwan

* Korespondence: gm@koda.com.tw (C.-HC); TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT); Tel.: plus 886-4-22840328 (ext. 776) (JTCT); Fax: plus 886-4-22853527 (JTCT)

Akademický redaktor: Pinarosa Avato

Přijato: 22. ledna 2019; Přijato: 14. února 2019; Zveřejněno: 17. února 2019

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktní:Cistanchedruh, ženšen z pouště, má mnoho biologických aktivit v tradiční čínské lékopise a používá se jako lék proti stárnutí. Tři fenylethanoidní glykosidy – echinakosid, tubulosid A aakteosid—byly zjištěny ve vodním extraktu zCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight a hlavní složka, echinakosid, byly dále purifikovány. Echinakosid o koncentraci vyšší než 10_6 M vykazoval významnou aktivitu při stimulaci sekrece růstového hormonu v buňkách hypofýzy potkana. Podobně jako u hormonu uvolňujícího růstový hormon-6, syntetického analogu ghrelinu, byla stimulace sekrece růstového hormonu echinakosidem inhibována [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-látkou P , inverzní agonista receptoru ghrelinu. Molekulární modelování ukázalo, že všechny tři fenylethanoidní glykosidy adekvátně interagovaly s vazebnou kapsou ghrelinového receptoru a echinakosid vykazoval o něco lepší interakci s receptorem než tubulosid A a akteosid. Výsledky naznačují, že fenylethanoidní glykosidy, zejména echinakosid, jsou aktivními složkami, které jsou údajně zodpovědné za účinky C. tubulosa proti stárnutí a lze je považovat za nepeptidové analogy ghrelinu.

klíčová slova: cistanchetubulosa; echinakosid; ghrelin; sekrece růstového hormonu; fenylethanoidové glykosidy

Pls klikněte zde pro část 1; Pls klikněte sem pro část 3

echinakosidvcistanchemá mnoho účinků

Obrázek 4.Inhibice [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-látky P (antagonista GHSR) na stimulační účinky sekrece GH pomocí GHRP-6 a léčby echinakosidem.

Primární buňky přední hypofýzy potkana byly inkubovány s GHRP{{0}} (10_7 M) a echinakosidem (10_5 M) v přítomnosti a nepřítomnosti [D-Arg1, D-Phe5 D-Trp7,9, Leull]-látka P (0,5 uM) po dobu 15 min.

Data byla uvedena jako průměr o SD s n =6. Hladiny signifikance pozorované T Testem byly * p < 0.05 oproti kontrole, # p < 0,05 a ## p < 0,005 významné rozdíly mezi sloupci.

2.3. Molekulární připojení echinakosidu, tubulosidu A a akteosidu ke ghrelinovému receptoru

Ve srovnání s GHRP-6 jsou tři fenylethanolové glykosidy vC. tubulosa—echinakosid, tubulosid A a akteosid – byly podrobeny molekulárnímu modelování a dokování do vazebné kapsy ghrelinového receptoru, GHSR. Výsledky ukázaly, že všechny třifenylethanolglykosidyse mohly vázat na ghrelin vazebnou kapsu GHSR, ačkoli jejich interakce ve vazebné kapse byly relativně slabé ve srovnání s GHRP-6 (obrázek 5A). Mezi nimi byly vytvořeny dva typy intermolekulární interakce, H-vazba a vrstveníechinakosida GHSR (obrázek 5B). Mezi echinakosidem a GHSR se vytvořilo šest H-vazeb; dvě mezi C6 hydroxylovou skupinou cukerné části a S207 GHSR, jednu mezi C6 hydroxylovou skupinou cukerné části a V205 GHSR, jednu mezi C2 hydroxylovou skupinou cukerné části a N305 GHSR, jednu mezi C2 hydroxylovou skupinou glykosidu zbytek a R283 z GHSR, a jeden mezi C3 hydroxylovou skupinou dihydroxyfenylethanolového zbytku a Q120 z GHSR. Jedna stohovací interakce se vytvořila mezi kávovou kyselinou echinakosidu a F309 GHSR. Mezi tubulosidem A a GHSR se vytvořil pouze jeden typ intermolekulární interakce, H-vazba (obrázek 5C). Mezi nimi bylo vytvořeno pět H-vazebtubulosidA a GHSR; dvě mezi hydroxylovou skupinou C3 rhamnózové části a N305 GHSR, jednu mezi hydroxylovou skupinou části kávové kyseliny a G208 GHSR, jednu mezi hydroxylovou skupinou dihydroxyfenylethanolové části a R283 GHSR a jednu mezi C4 glykosidu zbytek a Q120 z GHSR. Mezi akteosidem a GHSR se vytvořily dva typy intermolekulárních interakcí, H-vazba a vrstvení (obrázek 5D). Mezi akteosidem a GHSR se vytvořily čtyři H-vazby; dvě mezi hydroxylovými skupinami C2 a C3 rhamnózové části a N305 GHSR, jednu mezi hydroxylovou skupinou části kávové kyseliny a C198 GHSR a jednu mezi hydroxylovou skupinou dihydroxyfenylethanolové části a E124 GHSR. Mezi dihydroxyfenylethanolovou skupinou akteosidu a F220 GHSR se vytvořila jednovrstvová interakce. Vazebné afinity (chemická energie) vypočítané pomocí GEMDOCK tedy ukázaly, že echinakosid, tubulosid A a akteosid mají srovnatelnou sílu interakce ligand-receptor, zatímco echinakosid vykazuje o něco lepší interakci s receptorem než tubulosid A a akteosid při dokování do vazebné kapsy. ghrelinového receptoru konstruovaného s prostorem kapsy obsazeným GHRP-6 (tabulka 1).

Obrázek 5.Modelování čtyř ligandů, GHRP-6 (A),echinakosid(B), tubulosid A (C) a akteosid (D) do GHSR,

a detailní intermolekulární interakce v těchto komplexních strukturách. Levý panel: ligandy (struktura kuličky) ve vazebném místě ghrelinu GHSR (struktura pásu). Střední panel:

aminokyseliny (struktura tyčinky) blízké ligandům (struktura kuličky) v těchto komplexních strukturách. Pravý panel: podrobná intermolekulární interakce mezi ligandy a GHSR. Aminokyseliny GHSR

podílející se na tvorbě interakce s ligandy jsou znázorněny ve čtvercích. Jsou vyznačeny vzdálenosti H-vazby (červené čáry), náboj-náboj (zelená čára) a interakce (modré čáry).

Stůl 1.Chemická energie vypočtená pomocí GEMDOCK pro interakci mezi vazebnou kapsou ghrelinového receptoru (GHSR) a třemi fenylethanoidními glykosidy (echinakosid, tubulosid A a akteosid).

3. Diskuse

V literatuře, ghrelin (známý jako endogenní hormon) aechinakosidnalezený jako hlavní fenylethanoidní glykosid u druhů Cistanche, bylo zdokumentováno, že má několik ekvivalentních fyziologických aktivit, včetně účinků proti stárnutí, pravděpodobně prostřednictvím osy hypotalamus-hypofýza-gonáda. Ve skutečnosti jak ghrelin, takechinakosidbyly navrženy jako terapeutické léky u Alzheimerovy choroby a Parkinsonovy choroby [3,4,8,25–27]. V této studii jsme ukázali, že echinakosid izolovaný z C. tubulosa by mohl stimulovat sekreci růstového hormonu z primárních buněk předního laloku hypofýzy potkana domněle prostřednictvím aktivace GHSR podobným způsobem jako ghrelin. Zdá se, že stimulace sekrece růstového hormonu spouštěná echinakosidem podporuje dobře známé účinky proti stárnutí druhů Cistanche a fenylethanoidové glykosidy, zejména echinakosid, jsou aktivními složkami, které jsou údajně odpovědné za terapeutické účinky.

Odhadem z relativní schopnosti stimulovat sekreci růstového hormonu z buněk hypofýzy potkana,echinakosidse zdálo být přibližně 100krát slabší než GHRP-6, protože byly pozorovány srovnatelné stimulační aktivity meziechinakosid10_5 M a GHRP-6 10_7 M pro ošetření 15 a 30 minut (obrázek 3). Relativní aktivity echinakosidu a GHRP-6 při indukci sekrece růstového hormonu byly v dobré shodě s molekulárním modelováním, protože GHRP-6 silně interagoval se zbytky kolem vazebné kapsy GHSR prostřednictvím tří typů interakce – H-vazba, náboj-náboj a interakce – zatímco echinakosid interagoval s GHSR prostřednictvím dvou typů interakce – H-vazby a vrstvení (obrázek 5). Zejména bylo zdůrazněno, že interakce náboj-náboj mezi kladně nabitou amoniovou skupinou GHRP-6 a záporně nabitým E124 GHSR hraje zásadní roli ve vazbě GHRP-6 na receptor ghrelinu [28]. Relativně slabý stimulační účinek echinakosidu na indukci sekrece růstového hormonu z buněk krysí hypofýzy by mohl být pravděpodobně přisuzován především chybějící interakci náboj-náboj ve vazebné kapse GHSR.

Podle testu aktivity v této studii (obrázek 3) je minimální účinná koncentrace echinakosidu (Mr 786) pro stimulaci sekrece růstového hormonu z buněk hypofýzy potkana kolem 10_6 M. Pro dospělého 65 kg, objem krve je přibližně 5 l (65 kg × 1/13 =1 kg ≈ 5 l), a proto je k dosažení koncentrace {{10}} M( 5 l × 10_6 M × 786=3,93 mg). Z 1 g sušené natě C. tubulosa se extrahuje přibližně 20 mg echinakosidu [24]. K získání 4 mg echinakosidu je zapotřebí 0,2 g sušené natě C. tubulosa.

Běžně se při přípravě léčivých přípravků přidává více než 1 g sušené natě C. tubulosa. Zdá se tedy, že účinná dávka echinakosidu je v dobré shodě s empirickou konzumací C. tubulosa jako bylinného léku proti stárnutí. Efektivní dávka echinakosidu by samozřejmě měla být vyšší než výše uvedený odhad, protože dostupnost echinakosidu má tendenci být snížena po střevní absorpci a průchodu hematoencefalickou bariérou. K přesnému stanovení účinné dávky echinakosidu u zvířat jsou zapotřebí další experimenty.

V našich předchozích studiích bylo také prokázáno, že teaghrelin a ginkgogrelin, jedinečné acylované flavonoidní glykosidy izolované z čaje Chin-shin oolong a listů Ginkgo biloba, indukují sekreci růstového hormonu v buňkách hypofýzy potkana prostřednictvím vazby na ghrelinový receptor [20,22]. Zajímavé je, že minimální účinná koncentrace teaghrelinu nebo ginkgogrelinu pro stimulaci sekrece růstového hormonu z buněk hypofýzy potkana byla také přibližně 10_6 M, a tedy ekvivalentní

k tomu echinakosidu. Obsah teagrelinu a ginkgogrelinu v čaji Chin-shin oolong a listech Ginkgo biloba byl však relativně nízký; v 1 g čaje Chin-shin oolong bylo přibližně 1 mg teagrelinu a 0.33 mg ginkgogrelinu v 1 g listů Ginkgo biloba na rozdíl od 20 mg echinakosidu v 1 g C. tubulosa. Proto jsou účinné dávky čaje Chin-shin oolong a listů Ginkgo biloba kolem 5–10 g a 10–20 g. Zdá se, že drastický rozdíl v účinné dávce mezi C. tubulosa (0,2 g) a čajem oolong Chin-shin nebo listy Ginkgo biloba vysvětluje, proč se C. tubulosa používá jako bylinný lék proti stárnutí, zatímco čaj Chin-shin oolong a Ginkgo biloba listy se konzumují jako nápoje z bylinných čajů.