ČÁST 2 Echinakosid inhibuje uvolňování glutamátu potlačením napěťově závislého Ca2 plus vstupu a proteinkinázy C v cerebrokortikálních nervových terminálech potkana

Pro více informací prosím kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

KLIKNĚTE ZDE PRO ČÁST 1

3. Diskuse

V této studii byl echinakosid, aktivní sloučenina vHerba Cistanche, inhiboval4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu v nervových zakončeních mozkové kůry potkana. Možné základní mechanismy pro echinakosidem zprostředkovanou inhibici uvolňování glutamátu jsou dále zkoumány a diskutovány zde.

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

3.1. Mechanismy, na nichž je založena inhibice uvolňování glutamátu zprostředkovaná echinakosidem Uvolňování glutamátu

evokovaný 4-aminopyridinem obsahuje dvě složky: fyziologicky relevantní Ca2 plus-dependentní složku, která je produkována exocytózou synaptických vezikul obsahujících glutamát; a Ca2 plus-nezávislá složka, která pochází z prodloužené depolarizace způsobující membránovým potenciálem zprostředkovaný posun ustáleného stavu glutamátového transportéru směrem ven, čímž ovlivňuje cytosolický odtok glutamátu [31]. Tady jsme to pozorovaliechinakosidneinhiboval významně 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu v přítomnosti média bez Ca2 plus (nezávislé uvolňování Ca2 plus). Dále pozorovanéechinakosid-zprostředkované inhibici uvolňování glutamátu vyvolaného 4-aminopyridinem účinně zabránil bafilomycin A1 (který vyčerpává obsah glutamátu v synaptických vezikulách), ale ne DL-TBOA (který neselektivně inhibuje všechny subtypy přenašečů excitačních aminokyselin). Tyto výsledky tomu nasvědčujíechinakosidovlivňuje Ca2 plus-dependentní exocytózu uvolňování glutamátu, aniž by ovlivnil Ca2 plus-nezávislý cytosolický eflux glutamátu prostřednictvím obrácení transportéru glutamátu z plazmatické membrány nervového terminálu. V synaptických zakončeních inhibice Na plus kanálu nebo aktivace K plus kanálu stabilizuje excitabilitu membrány a následně snižuje evokovaný vstup Ca2 plus a uvolňování neurotransmiteru [32,33]. Proto potenciální mechanismus, který je základemechinakosid- zprostředkovaná inhibice uvolňování glutamátu zahrnuje snížení synaptosomální excitability. Tato možnost je však neudržitelná na základě dvou pozorování: (1) 4-aminopyridinem vyvolaná depolarizace membránového potenciálu, měřená barvivem DiSC3(5) citlivým na membránový potenciál, nebyla ovlivněna přidánímechinakosid; a (2) echinakosid neovlivnil 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování Ca2 plus nezávislého glutamátu, což je komponenta uvolňování, která závisí pouze na membránovém potenciálu [31]. Pokud účinek není způsoben supresí synaptosomální excitability, může se projevit snížením aktivity Ca2 plus kanálů Cav2.2 (N-typ) a Cav2.1 (P/Q-typ) spojené s glutamátovou exocytózou v nervových zakončení [34–36]. Pomocí fura{15}} to dokazujemeechinakosidvýznamně snižuje 4-aminopyridinem vyvolané zvýšení koncentrace Ca2 plus. Naše data navíc ukazují, že inhibiční účinekechinakosidna 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu se snížilo ze 42,4 procent ˘ 2,3 procenta na 12,1 procent ˘ 3,9 procenta po expozici blokátoru Cav2.2 (N-typ) a Cav2.1 (P/Q-typ) Ca2 plus kanály. Navíc jsme to pozorovaliechinakosidnadále významně inhiboval 4-aminopyridinem vyvolané uvolňování glutamátu v přítomnosti intracelulárních inhibitorů uvolňování Ca2 plus. Tyto výsledky naznačují, že současná suprese Cav2.2 (N-typ) a Cav2.1 (P/Q-typ) aktivity Ca2 plus kanálu je potenciálním mechanismem, který je základemechinakosid- zprostředkovaná inhibice uvolňování glutamátu. Kombinovaná aktivace Cav2.2 (typ N) a Cav2.1 (typ P/Q) Ca2 plus kanálová aktivita však nemohla blokovat působeníechinakosidzcela. Na inhibici se tedy mohou podílet další neidentifikované typy Ca2 plus kanálů nebo jiné presynaptické dráhy. Například GABAA receptory jsou přítomny na presynaptické úrovni a bylo prokázáno, že jejich aktivace inhibuje Ca2 plus influx a uvolňování glutamátu [37]. V této studii antagonisté receptoru GABAA SR95531 a bicucullin neblokovali echinakosidy zprostředkovanou inhibici uvolňování glutamátu, což naznačuje, že receptory GABAA se nepodílejí na snížení napěťově závislé aktivity Ca2 plus kanálu a na následné inhibici uvolňování glutamátu.

Vstup Ca2 plus přes napěťově závislé kanály Ca2 plus aktivuje několik proteinkináz spojených s uvolňováním glutamátu v nervových zakončeních, včetně mitogenem aktivované proteinkinázy, proteinkinázy C a proteinkinázy A. Zde ukazujeme, že inhibitory proteinkinázy C účinně antagonizovalyechinakosid-zprostředkovaná inhibice uvolňování glutamátu; nicméně mitogenem aktivovaný inhibitor proteinkinázy PD98059 nebo inhibitor proteinkinázy A H89 byly neúčinné. Navíc, že. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1006 8 13 4-aminopyridinem indukované fosforylace proteinkinázy C se snížila v synaptozomech po předběžném ošetřeníechinakosidv koncentraci účinné pro inhibici uvolňování glutamátu. Proto signální dráhaechinakosid-inhibice uvolňování glutamátu zprostředkovaná může zahrnovat proteinkinázu C. Proteinkináza C je důležitý intracelulární signální systém, který je přítomen na presynaptické úrovni a má klíčovou roli v exocytóze neurotransmiterů. Například několik synaptických proteinů zapojených do přesunu nebo náboru synaptických vezikul a exocytózy, jako je myristoylovaný substrát C kinázy bohatý na alanin, je fosforylováno proteinkinázou C [38,39]. Tento proces fosforylace může být zvýšen depolarizací stimulovaným vstupem Ca2 plus, což usnadňuje uvolňování glutamátu [40]. Můžeme tedy důvodně spekulovat, že inhibiční účinekechinakosidZde pozorovaný vstup Ca2 plus může snížit aktivitu proteinkinázy C a následně uvolňování glutamátu.

3.2. Terapeutické důsledky

Excitotoxicita, patologický proces způsobený nadměrným uvolňováním glutamátu a aktivací glutamátových receptorů, je hlavní příčinou smrti neuronů při akutních a chronických poruchách mozku, jako je mrtvice, traumatické poranění mozku, Parkinsonova a Alzheimerova choroba [13,41] a terapeutické strategie. zahrnující inhibici uvolňování glutamátu mohou být slibnými neuroprotektivními strategiemi pro léčbu takových onemocnění.Echinakosidbylo potvrzeno, že proniká hematoencefalickou bariérou (BBB) ​​a vykazuje neuroprotektivní účinky v různých in vivo modelech neurotoxicity [8,10–12,42]. Ačkoli mechanismus těchto neuroprotektivních účinků není zcela objasněn, bylo popsáno několik možných mechanismů včetně inhibice zánětlivé odpovědi, stabilizace mitochondriální funkce, antioxidace, vychytávání volných radikálů a napodobování neurotrofických funkcí [5,9,12,42]. V současné studii může schopnost echinakosidu snižovat uvolňování glutamátu z nervových zakončení také částečně vysvětlit jeho neuroprotektivní mechanismus. Nicméně, zda tento účinek přispívá ke zjevnému terapeutickému potenciálu echinakosidu u mozkových poruch spojených s glutamátovou excitotoxicitou, vyžaduje další výzkum.

4. Materiály a metody

4.1. Chemikálie

Fura-2-acetoxymethylester (Fura-2-AM) a 3',3',3'-dipropylthiadikarbocyanin jodid[DiSC3(5)] byly zakoupeny od Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). ω-konotoxin MVIIC, rotttlerin,2-[1-(3-dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl)maleimid ( GF109203X), 5,6,7,13-tetrahydro-13-methyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3,{ {27}}c]karbazol-12-propannitril (Go6976) a N-[2-(p-bromcinnamylamino)ethyl]-5-isochinolinsulfonamid (H89) byly zakoupeny od TocrisBioscience (Bristol, UK). Echinakosid, dantrolen, DL-threo-beta-benzyl-oxyaspartát (DL-TBOA),7-chlor-5-(2-chlorofeny)-1,5-dihydro -4,1-benzothiazepin-2(3H)-on (CGP37157), 2-(2-amino-3-methoxyfenyl)-4 H-1-benzopyran-4-on) (PD98059), ethylenglykol bis(-aminoethylether)-N,N,N1,N1-tetraoctová kyselina (EGTA) a všechna ostatní činidla byla zakoupena od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).

4.2. Zvířata

Byli použiti dvouměsíční samci potkanů ​​Sprague–Dawley. Zvířata byla chována ve standardizovaných podmínkách prostředí (22 ˘ 1 ˝C; 50 procent relativní vlhkosti; 12 h cyklus světlo/tma) a byl jim umožněn neomezený přístup k potravě a vodě. Zvířata byla usmrcena dekapitací a mozková kůra byla rychle odstraněna při 4 °C. Experimentální postupy byly schváleny Fu Jen InstitutionalAnimal Care and Utilization Committee (A10259) v souladu s National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Bylo vynaloženo veškeré úsilí k minimalizaci utrpení zvířat a použití minimálního počtu zvířat nezbytného k dosažení spolehlivých výsledků.

4.3. Synaptozomální přípravky

Synaptosomy byly purifikovány z mozkové kůry krys na diskontinuálních Percollových gradientech, jak bylo popsáno dříve [43,44]. Stručně, tkáň byla homogenizována v médiu obsahujícím 0,32 M sacharózu (pH 7,4), homogenát byl centrifugován 10 min při 3000ˆg (5{{25 ( 11,000 ot./min v rotoru JA 25.5). Peleta byla jemně resuspendována v 0,32 M sacharóze (pH 7,4) a alikvot této synaptosomální suspenze (2 ml) byl umístěn na 3 ml Percoll diskontinuální gradient obsahující 0,32 M sacharózu, 1 mM EDTA, 0,25 mM DL-dithiothre, 3 procenta, 10 procent a 23 procent Percoll (pH 7,4). Po odstředění při 32 500 ˆ g (16 500 ot./min v rotoru JA 20.5) po dobu 7 minut při 4 ˝C byly synaptozomy získány z 10% a 23% Percoll pásů a byly zředěny na konečný objem 30 ml. HEPES pufrového média (140 mM NaCl, 5 mM KCI, 5 mM NaHC03, 1 mM MgCl2 x 6H20, 1,2 mM Na2HP04, 10 mM glukózy a 10 mM HEPES (pH 7,4)). Po další centrifugaci při 27,000ˆg (15 000 ot./min v JA 25,5) po dobu 10 minut byla synaptosomová peleta resuspendována ve 3 ml pufru HEPES a obsah proteinu byl stanoven pomocí Bradfordova testu. Nakonec bylo 0,5 mg suspenze synaptozomů naředěno v 10 ml pufru HEPES a centrifugováno při 3000ˆg (5000 ot./min v rotoru JA 20.1) po dobu 10 minut. Supernatant byl zlikvidován a pelety obsahující synaptozomy byly uloženy na ledu a použity během 4–6 hodin.

4.4. Uvolňování glutamátu

Uvolňování glutamátu bylo testováno online fluorimetrií, jak bylo popsáno dříve [45,46]. Synaptosomální pelety byly resuspendovány v pufrovém médiu HEPES (0,5 mg/ml) a preinkubovány při 37 °C po dobu 10 minut v přítomnosti 16 uM hovězího sérového albuminu, aby se navázaly volné mastné kyseliny uvolněné ze synaptozomů během preinkubace. Alikvotní část 2-ml synaptozomů byla přenesena do míchané kyvety obsahující 2 mM NADP plus, 50 jednotek glutamátdehydrogenázy a 1,2 mM CaCl2 a FL fluorescence NADPH byla měřena v Perkin-Elmer LS{{ 14}} spektrofluorimetr (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA) při excitačních a emisních vlnových délkách 340 a 460 nm. Protože synaptozomy nejsou přístupné elektrické stimulaci, byl ke stimulaci uvolňování glutamátu použit blokátor draslíkového kanálu 4-aminopyridin. 4-aminopyridin destabilizuje membránový potenciál a předpokládá se, že způsobuje opakovanou spontánní depolarizaci závislou na Na plus kanálu, která se těsně blíží in vivo depolarizaci synaptického zakončení, která vede k aktivaci napěťově závislých Ca2 plus kanálů a uvolňování neurotransmiterů [47 ]. Data byla získávána ve 2s intervalech. Na konci každého experimentu byl přidán standard exogenního glutamátu (5 nmol). Hodnota změny fluorescence FL vytvořená přidáním standardu byla použita k výpočtu uvolněného glutamátu jako nanomolů glutamátu na miligram synaptosomálního proteinu (nmol/mg). Hodnoty uvolňování uvedené v textu jsou úrovně dosažené v ustáleném stavu po 5 min depolarizace (nmol/mg/5 min). Kumulativní data byla analyzována pomocí tabulek Lotus 1-2-3 (IBM, White Plains, NY, USA) a MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).

4.5. Potenciál plazmové membrány

Plazmatický membránový potenciál byl stanoven barvivem citlivým na membránový potenciál, DiSC3(5) [48]. Synaptosomy byly resuspendovány v HEPES pufrovém médiu a 2 ml alikvoty byly přeneseny do míchané kyvety obsahující 5 µM DiSC3(5) při 37 °C ve spektrofluorometru Perkin–Elmer LS-55 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA). Poté, co se směs nechala ekvilibrovat po dobu 3 minut, byla stanovena fluorescence FL při excitačních a emisních vlnových délkách 646 a 674 nm, v daném pořadí. Data byla sbírána ve 2s intervalech. Kumulativní data byla analyzována pomocí MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA) a vyjádřena ve fluorescenčních jednotkách FL.

4.6. Cytosolický Ca2 plus koncentrace ([Ca2 plus ]C)

[Ca2 plus ]C byl měřen pomocí indikátoru Ca2 plus fura-2. Synaptosomy (0,5 mg/ml) byly preinkubovány v HEPES pufrovém médiu obsahujícím 5 µM fura-2 a 0,1 mM CaCl2, po dobu 30 minut při 37 ˝C v míchaném testu trubka. Po nanesení fura-2 byly synaptozomy centrifugovány v mikrocentrifuze po dobu 30 s při 3000ˆg (5000 ot./min). Synaptosomální pelety byly resuspendovány v HEPES pufrovacím médiu a synaptosomální suspenze byla míchána v termostatované kyvetě ve spektrofluorometru Perkin-Elmer LS-55 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA). Po 3 minutách byl přidán CaCl2 (1 mM) a další přídavky byly provedeny po dalších 10 minutách. Fluorescenční data byla shromážděna při excitačních vlnových délkách 340 a 380 nm (emisní vlnová délka 505 nm) ve 2s intervalech. [Ca2 plus]C (nM) byl vypočten pomocí kalibračních postupů [49] a rovnic popsaných dříve [50]. Kumulativní data byla analyzována pomocí MicroCal Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA).

4.7. Western blotting

Synaptosomy byly homogenizovány v lyzačním pufru (10 mM HEPES pufr, pH 7,4), 1% Triton X-100 a směsi inhibitoru proteázy. Lyzáty byly vyčeřeny centrifugací a koncentrace proteinu byla stanovena pomocí soupravy pro stanovení proteinů (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Stejná množství proteinů byla oddělena elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) a přenesena na nitrocelulózovou membránu. Membrány byly blokovány Tris-pufrovaným fyziologickým roztokem, který obsahoval 5 procent nízkotučného mléka a inkubovány s vhodnou primární protilátkou (fosfo-proteinkináza C (pan), 1:3000, NOVUS Biologicals Inc., Beverly, MA, USA) přes noc při 4 ˝C. Po třech promytích v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku byla membrána poté ošetřena sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (1:3000) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Membrány byly poté promyty alespoň třikrát Tris-pufrovaným fyziologickým roztokem a vizualizovány za použití vylepšeného chemiluminiscenčního systému (Amersham, Buckinghamshire, UK). Alikvot vzorků byl nanesen a sondován anti-PKC protilátkou pro detekci PKC jako kontrola nanášení. Úroveň exprese nebo fosforylace byla hodnocena hustotou pásu, která byla kvantifikována denzitometrií. Denzitometrická kvantifikace pásů byla analyzována pomocí softwaru Syngene (Synoptics, Cambridge, UK).

4.8. Statistická analýza

Data byla získána z jednoho synaptosomálního preparátu a nebyla na sobě nezávislá. K testování významnosti účinku léku oproti kontrole byl použit dvoustranný Studentův t-test. Když bylo požadováno další srovnání (jako například zda druhé ošetření ovlivnilo účinek echinakosidu), byla použita jednocestná ANOVA následovaná Tukeyho testem. Analýza byla dokončena pomocí softwaru SPSS (17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Data jsou vyjádřena jako průměr ˘ SEM; významnost byla vyhodnocena při p < 0,05="" pro="" všechna="" statistická="">

5. Závěry

Toto je první studie, která to dokazujeechinakosidinhibuje uvolňování glutamátu z cerebrokortikálních synaptosomů potkana snížením Ca2 plus influx přes kanály Cav2.2 a Cav2.1 a tato inhibice uvolňování je pravděpodobně závislá na supresi dráhy proteinkinázy C, alespoň částečně. Toto zjištění je cenné, protože poskytuje nový pohled na mechanismy působení echinakosidu v mozku.

Poděkování:Tato práce byla podpořena grantem Ministerstva vědy a technologie (MOST 103-2320-B-030-001 MY3).

Příspěvky autora:Tzu Yu Lin a Su Jane Wang navrhli a navrhli experimenty; Cheng Wei Lu provedl experimenty; Cheng Wei Lu a Shu Kuei Huang analyzovali data; Su Jane Wang napsala noviny.

Střet zájmů:Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Střet zájmů: Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Tu, PF; Wang, B.; Deyama, T.; Zhang, ZG; Lou, ZC Analýza fenylethanoidových glykosidůHerba cistanchepomocí RP-HPLC. Acta Pharm. Hřích. 1997, 32, 294-300.

2. Dalby-Brown, L.; Barrett, H.; Landbo, AK; Meyer, AS; Molgaard, P. Synergické antioxidační účinky alkamidů, derivátů kyseliny kávové a polysacharidových frakcí z Echinacea purpurea na in vitro oxidaci lidských lipoproteinů s nízkou hustotou. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 9413-9423. [CrossRef] [PubMed]

3. Dapas, B.; Dall'Acqua, S.; Bulla, R.; Agostinis, C.; Perissutti, B.; Invernizzi, S.; Grassi, G.; Voinovich, D. Imunomodulace zprostředkovaná bylinným sirupem obsahujícím standardizovaný extrakt z kořene Echinacea: Pilotní studie na zdravých lidských subjektech na expresi cytokinového genu. Fytomedicína 2014, 21, 1406-1410. [CrossRef] [PubMed]

4. On, WJ; Fang, TH; Tu, PF Pokrok ve výzkumu farmakologických aktivit echinakosidu. Čína J. Chin. Mater. Med. 2009, 34, 476-479.

5. Deng, M.; Zhao, JY; Tu, PF.; Jiang, Y; Li, ZB; Wang, YH Echinakosid zachraňuje neuronální buňky SHSY5Y před apoptózou vyvolanou TNFalfa. Eur. J. Pharmacol. 2004, 505,11-18. [CrossRef] [PubMed]

6. Koo, KA; Sung, SH; Park, JH; Kim, SH; Lee, KY; Kim, YC In vitro neuroprotektivní aktivity fenylethanoidních glykosidů z Callicarpa dichotoma. Planta Med. 2005, 71, 778-780. [CrossRef] [PubMed]

7. Wang, YH; Xuan, ZH; Tian, ​​S.; Du, GH Echinakosid chrání před 6-mitochondriální dysfunkcí indukovanou hydroxydopaminem a zánětlivými reakcemi v buňkách PC12 prostřednictvím snížení produkce ROS. Evid. Založený doplněk. Alternativní. Med. 2015, 2015, 189239. [CrossRef] [PubMed]

8. Zhu, M.; Lu, C.; Li, W. Přechodná expozice echinakosidu je dostatečná k aktivaci signalizace Trk a ochraně neuronových buněk před rotenonem. J. Neurochem. 2013 124, 571-580. [CrossRef] [PubMed]

9. Geng, X.; Tian, ​​X.; Tu, P.; Pu, X. Neuroprotektivní účinky echinakosidu v myším MPTP modelu Parkinsonovy choroby. Eur. J. Pharmacol. 2007, 564, 66-74. [CrossRef] [PubMed]

10. Wei, LL; Chen, H.; Jiang, Y; Tu, PF.; Zhong, M.; Du, J.; Liu, F.; Wang, L.; Liu, CY Účinky echinakosidu na histiocentrální hladiny aktivní hmoty u krys s uzávěrem střední mozkové tepny. Biomed. Environ. Sci. 2012, 25, 238-244. [PubMed]

11. Wu, ČR; Lin, HC; Su, MH Reverze pomocí vodných extraktůCistanche tubulosaz behaviorálních deficitů v modelu potkanů ​​podobných Alzheimerově chorobě: Relevance pro ukládání amyloidu a funkci centrálního neurotransmiteru. Doplněk BMC. Alternativní. Med. 2014, 14, 202. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, Q.; Gao, J.; Li, W.; Cai, D. Neurotrofické a neurozáchranné účinky echinakosidu v subakutním MPTP myším modelu Parkinsonovy choroby. Brain Res. 2010, 1346, 224-236. [CrossRef] [PubMed]

13. Meldrum, BS Glutamát jako neurotransmiter v mozku: přehled fyziologie a patologie. J. Nutr. 2000, 130, 1007S-1015S. [PubMed]

14. Lee, D.; Shim, MS; Kim, KY; No, YH; Kim, H.; Kim, SY; Weinreb, RN; Ju, WK Koenzym Q10 inhibuje glutamátovou excitotoxicitu a mitochondriální alteraci zprostředkovanou oxidačním stresem na myším modelu glaukomu. Vyšetřování. Oftalmol. Vis. Sci. 2014, 55, 993-1005. [CrossRef] [PubMed]

15. Choi, DW Vápník a excitotoxické neuronální poškození. Ann. NY Acad. Sci. 1994, 747, 162-171. [CrossRef] [PubMed]

16. Lau, A.; Tymianski, M. Glutamátové receptory, neurotoxicita a neurodegenerace. Pflugers. Oblouk. 2010, 460, 525-542. [CrossRef] [PubMed]

17. Sattler, R.; Tymianski, M. Molekulární mechanismy excitotoxické smrti neuronových buněk zprostředkované glutamátovým receptorem. Mol. Neurobiol. 2001, 24, 107-129. [CrossRef]

18. Schauwecker, PE Neuroprotekce antagonisty glutamátového receptoru proti záchvatům indukované excitotoxické buněčné smrti ve stárnoucím mozku. Exp. Neurol. 2010, 224, 207-218. [CrossRef] [PubMed]

19. Yeganeh, F.; Nikbakht, F.; Bahmanpoui; S.; Rastegar, K.; Namavar, R. Neuroprotektivní účinky NMDA a antagonistů metabotropního glutamátového receptoru skupiny I proti neurodegeneraci indukované homocysteinem v hippocampu potkana: Studie in vivo. J. Mol. Neurosci. 2013, 50, 551-557. [CrossRef] [PubMed]

20. Doble, A. Role excitotoxicity u neurodegenerativních onemocnění: důsledky pro terapii. Pharmacol. Ther. 1999, 81, 163-221. [CrossRef]

21. Muir, KW Terapeutické přístupy založené na glutamátu: Klinické studie s antagonisty NMDA. Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6, 53-60. [CrossRef] [PubMed]

22. Gonzalez, JC; Egea, J.; del Carmen Godino, M.; Fernandez-Gomez, FJ; Sanchez-Prieto, J.; Gandia, L.; Garcia, AG; Jordan, J.; Hernandez-Guijo, JM Neuroprotektivní minocyklin tlumí glutamátergní neurotransmisi a signalizaci Ca2 plus v hipokampálních neuronech. Eur. J. Neurosci. 2007, 26, 2481-2495. [CrossRef] [PubMed]

23. Lu, CW; Lin, TY; Wang, SJ Memantin potlačuje uvolňování glutamátu prostřednictvím inhibice napěťově závislého vstupu Ca2 plus a proteinkinázy C v nervových zakončeních mozkové kůry potkana: Mechanismus nezávislý na NMDA receptoru. Neurochem. Int. 2010, 57, 168-176. [CrossRef] [PubMed]

24. Wang, SJ; Sihra, TS Nekompetitivní antagonista metabotropního glutamátového 5 receptoru (E)-2-methyl-6-styryl-pyridin (SIB1893) potlačuje uvolňování glutamátu prostřednictvím inhibice napěťově závislého Ca2 plus vstupu do cerebrokortikálních nervových zakončení potkana (synaptosomy). J. Pharmacol. Exp. Ther. 2004, 309, 951-958. [CrossRef] [PubMed]

25. Dunkley, PR.; Jarvie, PE; Heath, JW; Kidd, GJ; Rostas, JA Rychlá metoda pro izolaci synaptozomů na Percollových gradientech. Brain Res. 1986, 372, 115-129. [CrossRef]

26. Araque, A.; Li, N.; Doyle, RT; Haydon, PG SNARE protein-dependentní uvolňování glutamátu z astrocytů. J. Neurosci. 2000, 20, 666-673. [PubMed]

27. Dunlop, J. Terapeutické přístupy založené na glutamátu: Cílení na transportní systém glutamátu. Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6, 103-107. [CrossRef] [PubMed]

28. Zucchi, R.; Ronca-Testoni, S. Ca2 plus kanál/ryanodinový receptor sarkoplazmatického retikula: Modulace endogenními efektory, léky a chorobnými stavy. Pharmacol. Rev. 1997, 49, 1-51. [PubMed]

29. Fan, Y.; Li, J.; Zhang, YQ; Jiang, LH; Zhang, YN; Yan, CQ Proteinkinázou C delta zprostředkovaná cytotoxicita 6-hydroxydopaminu prostřednictvím trvalé aktivace kinázy 1/2 regulované extracelulárním signálem v buňkách PC12. Neurol. Res. 2014, 36, 53-64. [CrossRef] [PubMed]

30. Gschwendt, M.; Muller, HJ; Kielbassa, K.; Zang, R.; Kittstein, W.; Rincke, G.; Marks, F. Rottlerin, nový inhibitor proteinkinázy. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 199, 93-98. [CrossRef] [PubMed]

31. Nicholls, DG; Sihra, TS; Sanchez-Prieto, J. Na vápníku závislé a nezávislé uvolňování glutamátu ze synaptozomů monitorované kontinuální fluorometrií. J. Neurochem. 1987, 49, 50-57. [CrossRef] [PubMed]

32. Nicoll, RA Spojení neurotransmiterových receptorů s iontovými kanály v mozku. Science 1988, 241, 545-551. [CrossRef] [PubMed]

33. Wu, LG; Saggau, P. Presynaptická inhibice vyvolaného uvolňování neurotransmiteru. Trendy Neurosci. 1997, 20, 204-212. [CrossRef]

34. Turner, TJ; Dunlap, K. Farmakologická charakterizace presynaptických kalciových kanálů pomocí subsekundových biochemických měření synaptosomální neurosekrece. Neuropharmacology 1995, 34, 1469-1478. [CrossRef]

35. Millan, C.; Sanchez-Prieto, J. Diferenciální spojení vápníkových kanálů typu N a P/Q s glutamátovou exocytózou v mozkové kůře potkana. Neurosci. Lett. 2002, 330, 29-32. [CrossRef]

36. Vázquez, E.; Sanchez-Prieto, J. Presynaptická modulace uvolňování glutamátu se zaměřuje na různé vápníkové kanály v cerebrokortikálních nervových zakončeních potkana. Eur. J. Neurosci. 1997, 9, 2009-2018. [CrossRef] [PubMed]

37. Dlouhý, P; Mercer, A.; Begum, R.; Stephens, GJ; Sihra, TS; Jovanovic, JN Nervový terminál GABAA receptory aktivují signalizaci závislou na Ca2 plus/kalmodulinu k inhibici napěťově řízeného přílivu Ca2 plus a uvolňování glutamátu. J. Biol. Chem. 2009 284, 8726-8737. [CrossRef] [PubMed]

38. Turner, JR; Angle, JM; Černá, ED; Joyal, JL; Sacks, DB; Madara, JL PKC-dependentní regulace transepiteliální rezistence: Role MLC a MLC kinázy. Dopoledne. J. Physiol. 1999, 277, C554-C562. [PubMed]

39. Vaughan, PF; Walker, JH; Peters, C. Regulace sekrece neurotransmiterů proteinkinázou C. Mol. Neurobiol. 1998, 18, 125-155. [CrossRef] [PubMed]

40. Coffey, ET; Sihra, TS; Nicholls, DG; Pocock, JM Fosforylace synapsinu I a MARCKS v nervových zakončeních je zprostředkována vstupem Ca2 plus přes kanál Ca2 plus citlivý na Aga-GI, který je spojen s glutamátovou exocytózou. FEBS Lett. 1994, 353, 264-268. [CrossRef]

41. Obrenovič, TP; Urenjak, J. Změněný glutamátergní přenos u neurologických poruch: Od vysokého extracelulárního glutamátu k nadměrné synaptické účinnosti. Prog. Neurobiol. 1997, 51, 39-87. [CrossRef]

42. Zhang, D.; Li, H.; Wang, JB Echinakosid inhibuje amyloidní fibrilaci HEWL a chrání před neurotoxicitou indukovanou Ap. Int. J. Biol. Macromol. 2015, 72, 243-253. [CrossRef] [PubMed]

43. Lin, TY; Lu, CW; Wang, CC; Lu, JF; Wang, SJ Hispidulin inhibuje uvolňování glutamátu v cerebrokortikálních nervových zakončeních potkana. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2012, 263, 233-243. [CrossRef] [PubMed]

44. Chang, CY; Lin, TY; Lu, CW; Huang, SK; Wang, YC; Chou, SS; Wang, SJ Hesperidin inhibuje uvolňování glutamátu a uplatňuje neuroprotekci proti excitotoxicitě vyvolané kyselinou kainovou v hippocampu krys. Neurotoxikologie 2015, 2015, 157-169. [CrossRef] [PubMed]

45. Nicholls, DG; Sihra, TS synaptosomy mají exocytotickou zásobu glutamátu. Nature 1986, 321, 772-773. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Wang, CC; Kuo, JR; Wang, SJ Dimebon, antihistaminikum, inhibuje uvolňování glutamátu v cerebrokortikálních nervových zakončeních potkanů. Eur. J. Pharmacol. 2014, 734, 67-76. [CrossRef] [PubMed]

47. Tibbs, GR; Barrie, AP; van Mieghem, FJ; Mc-Mahon, HT; Nicholls, DG Repetitivní akční potenciály v izolovaných nervových zakončeních v přítomnosti 4-aminopyridinu: Účinky na cytosolický volný Ca2 plus a uvolňování glutamátu. J. Neurochem. 1989,53,1693-1699. [CrossRef] [PubMed]

48. Akerman, KE; Scott, LG; Heikkila, JE; Heinonen, E. Iontová závislost membránového potenciálu a odezvy spojené s glutamátovým receptorem v synaptoneuzosomech, jak bylo měřeno s cyaninovým barvivem, DiSC2(5). J. Neurochem. 1987, 48, 552-559. [CrossRef] [PubMed]

49. Sihra, TS; Bogonez, E.; Nicholls, DG Lokalizovaný vstup Ca2 plus přednostně ovlivňuje proteinovou defosforylaci, fosforylaci a uvolňování glutamátu. J. Biol. Chem. 1992, 267, 1983-1989. [PubMed]

50. Grynkiewicz, G.; Poenie, M.; Tsien, RY Nová generace indikátorů Ca2 plus s výrazně zlepšenými fluorescenčními vlastnostmi. J. Biol. Chem. 1985, 260,3440-3450. [PubMed]