Část 2 Echinakosid zvyšuje množství spermií u krys zacílením na hypotalamický androgenní receptor

KLIKNĚTE ZDE PRO ČÁST 1

Pro více informací prosím kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Diskuse

Etnofarmakologické záznamy a naše předchozí studie13 to potvrdilyCistanche tubulosaextrakty účinně zvýšily hladiny pohlavních hormonů a zlepšily kvalitu spermií.ECHjako jedna z hlavních sloučenin vCistanche tubulosa19,20, může zvýšit počet spermií a zvýšit sekreci LH a T (obr. 1). V této studii jsme to prokázaliECHbyl distribuován do hypotalamu místo do varlat, což naznačuje nepřímý účinek ECH na varlata. ECH skutečně přímo inhibovala aktivitu AR hypotalamu, translokaci AR do jádra a genovou expresi související s HPG osou a také poskytovala ochranu proti poškození reprodukce vyvolanému BPA.

Ve studiích produkce lidských gonadotropinů jsou hladiny pohlavních hormonů přísně regulovány osou HPG a smyčkou negativní zpětné vazby21. Konkrétně sekrece T je výrazně zvýšena v reakci na konzistentní a trvalé zvýšení hladin LH v krvi v reakci na nedostatek negativní androgenní zpětné vazby do hypofýzy a hypotalamu. V této studii,ECHzvýšil sekreci LH v encefalu plus hypofýze a produkci testosteronu ve varlatech a hladiny mRNA LHR a Gnrhr v encefalu plus hypofýze (obr. 1 a obr. 4), což naznačuje, žeECHmůže ovlivnit negativní zpětnou vazbu osy HPG. Není překvapením, že samotná AR hraje důležitou roli ve zpětnovazební regulaci hladin T a LH22,23. Mužské paradigma HPG osy je zaměřeno na testosteron poskytující negativní zpětnou vazbu na úrovni hypotalamu i hypofýzy24,25. Předchozí studie použily Foxg1-Cre k ablaci genů zájmu v hypofýze, ale ne v hypotalamu, aby se určila relativní důležitost těchto dvou oblastí. Výsledky ukázaly, že signalizace AR v hypofýze samců myši je zbytečná, pokud jde o regulaci sekrece LH závislou na testosteronu26. Z tohoto důvodu jsme se pro další studium rozhodli zaměřit na hypotalamickou AR.

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

Jako receptor steroidního jaderného hormonu je aktivita AR regulována steroidním ligandem T, jehož vazba iniciuje jadernou translokaci a transkripční regulační funkci AR27. V této studii jsme to ukázaliECHléčba inhibovala translokaci AR z cytoplazmy do jader v hypotalamu (obr. 3). Navíc to prokázala PK studieECHmůže výrazně pronikat do hypotalamu spíše než do varlat, což naznačuje, že více ECH prochází hematoencefalickou bariérou, pravděpodobně prostřednictvím endocytózy, spíše než bariérou krevních varlat. Dále jsme pomocí nepřímé ELISA prokázali kombinační kapacitu ECH a AR, což naznačuje, že ECH se může přímo vázat na AR. To bylo dále podpořeno výsledky testu dokování molekul, které ukázaly, že domnělá vazebná místa pro ECH existují v Met-894 a Val-713 v kapse AR (obr. 5D). To podporuje zjištění jiných, že AR se účastní regulace negativní napájecí smyčky a že snížení interakcí AR-T v mozku vede ke zvýšené sekreci LH23,28,29

Steroidogeneze je přísně kontrolovaný, nezbytný proces pro vývoj spermatogeneze se zapojením steroidogenního proteinu (StAR)30 a steroidogenních enzymů, jako jsou CYP11A1, CYP17A1, 3 -hydroxysteroid dehydrogenáza (HSD3) a 17 -hydroxysteroid dehydrogenáza (HSD17), která přeměňuje cholesterol na testosteron31. Ukázali jsme, že hladiny mRNA genů kódujících tyto enzymy významně vzrostlyECHošetření, zatímco exprese mRNA StAR se nezměnila. To naznačujeECHneměl žádný vliv na přenos cholesterolu do vnitřní membrány mitochondrií, zatímco může hrát roli při podpoře přeměny cholesterolu na testosteron. Z toho pak lze vyvodit závěrECHléčba významně zvyšuje počet spermií zvýšením syntézy a sekrece testosteronu.

Prozkoumat ochranný účinekECHna poranění spermií byl bisfenol A (BPA), typický exogenní endokrinní disruptor, použit jako model samčího reprodukčního poškození u myší32.ECHléčba účinně obnovila počty spermií, pohyblivost spermií, hladiny T a LH snížené BPA (obr. 6A, B), což naznačuje, že ECH může zmírnit poškození spermií.

Ve srovnání s uměle syntetizovanými chemikáliemi pro hormonální substituční terapii,ECHje přírodní nehormonální sloučenina, která ovlivňuje negativní zpětnou vazbu na HPG ose a tím zvyšuje sekreci LH, T a kvalitu spermií. Tato mechanická cesta může chránit mužský reprodukční systém a tímECHlze považovat za potenciální přírodní reprodukční ochranný prostředek. Regulace hormonů jsou však složité a často vedou k systémovým účinkům. Jak je naznačeno na obr. 7, ECH zvýšila sekreci T a LH a inhibovala aktivaci AR, což může také vést k následkům na jiné cesty spojené se zdravím nebo onemocněním, jako je osteoporóza33 a deprese u mužů34, proto by komplexní účinky ECH měly být dále vyšetřován.

Dohromady to naznačují naše výsledkyECHse váže na AR v hypotalamu a inhibuje přenos AR z cytoplazmy do jádra. Naše údaje naznačují, že ECH se váže na místa v kapse AR na aminokyselinách Met-894 a Val-713. To může vysvětlit zvýšení hladin T a AR jako systémovou odpověď na vyvážení hladin hormonů podporou sekrece LH a následným zvýšením produkce T a počtu spermií (obr. 8).

Metody

Etické prohlášení.

Tato studie byla provedena v přísném souladu s Směrnicemi pro experimentální zvířata stanovenými Ministerstvem vědy a technologie (Peking, Čína). Všechny experimentální protokoly byly přezkoumány a schváleny etickou komisí Anyang Institute of Technology.

Pokusná zvířata.

Čtyřtýdenní inbrední myši Kunming (22 g–25 g) byly získány ze zvířecího centra čtvrté vojenské lékařské univerzity (Xi'an, Čína). Zvířata byla držena za kontrolovaných podmínek při teplotě 22 stupňů ± 2 stupně, 70 procent ± 4 procenta vlhkosti s 12 hodinovým cyklováním světlo-tma a volným přístupem ke krmivu a vodě.

Experimentální léčba.

Experiment 1. Myši byly náhodně rozděleny do šesti skupin, sedm myší v každé skupině (n=7).ECH(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Čína) byl podán pomocí intragastrické sondy a byl podán testosteron propionát (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Čína). intramuskulární injekcí jednou denně po dobu 14 dnů podle následujícího experimentálního uspořádání: Kontrolní skupina: normální fyziologický roztok (10 ml/kg), skupina ECH(L) (5 mg/kg), skupina ECH(M) (20 mg/kg),ECH(H) skupina (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) a enzalutamid (inhibitor AR, jednou denně každý druhý den po dobu 14 dnů; 20 mg/kg; CAS: 915087-33-1; Aladdin, Shanghai, Čína).

Po 2 týdnech léčby byly myši anestetizovány diethyletherem, aby byly odebrány vzorky krve pro analýzu hladin hormonů. Myši pak byly pitvány, aby se oddělil hypotalamus, mozek plus hypofýza, varlata a cauda nadvarlata. Vzorky cauda epididymis byly vloženy do normálního fyziologického roztoku s 5% BSA pro hodnocení kvality spermií a hypotalamus, mozek plus hypofýza a varlata byly zmraženy v kapalném dusíku a skladovány při teplotě -80 stupňů pro další vyšetření.

Experiment 2. Myši byly náhodně rozděleny do 10 skupin, pět zvířat na skupinu.ECH(20mg/kg) byl podáván orálně a myši v každé skupině byly anestetizovány diethyletherem v časových bodech 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h, a 12 hodin po podání pro odběr vzorku. Byla odebrána plazma a srdce bylo obnaženo. Perfuze normálního fyziologického roztoku do levé komory byla prováděna infuzním přístrojem, dokud játra a plíce nebyly blanšírovány. Pro stanovení tkáňových koncentrací ECH bylo odebráno deset hypotalamu a varlat.

Experiment 3. Myši byly náhodně rozděleny do 4 skupin, sedm v každé skupině.ECHa BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, Čína) byly podávány pomocí intragastrické sondy jednou denně po dobu 6 týdnů podle následujícího experimentálního uspořádání: normální skupina (kukuřičný olej, 10 ml/kg, bw/d) modelová skupina: skupina BPA (BPA 200 mg/kg, bw/d, kukuřičný olej) a experimentální skupina: skupina BPA plus ECH (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg). Po 42 dnech léčby byly myši anestetizovány diethyletherem a byly odebrány vzorky krve pro analýzy hladiny hormonů. Testis a cauda epididymis byly odděleny a odebrány. Pro hodnocení kvality spermií bylo použito cauda epididymis a varlata byla zmražena v tekutém dusíku a skladována při teplotě -80 stupňů pro další vyšetření.

Stanovení kvality spermatu. Příprava suspenze spermií. Cauda nadvarlata byla rozemleta do 5 ml normálního fyziologického roztoku s 5 procenty BSA a inkubována po dobu 5 minut při 37 stupních, aby se jejich obsah mohl rozšířit do média. Počet spermií: Podle metody popsané Yokoi (2003) byla zředěná suspenze spermií (1:10; v/v; suspenze spermií/10% methanol) přenesena do každé počítací komory hemocytometru a ponechána stát po dobu 5 minut. a poté počítáno pod světelným mikroskopem (Nikon, Instruments Inc., Japonsko) při 200-násobném zvětšení. Životaschopnost spermií: Celkem 20 ul suspenze spermií bylo smícháno se stejným objemem barviva eosin-nigrosin po dobu 2 minut; neobarvené spermie byly spočítány pod světelným mikroskopem při 200x zvětšení. Pohyblivost spermií: Celkem 10 μl suspenze spermií bylo umístěno na podložní sklíčko a byly zaznamenány jako pohyblivé nebo nepohyblivé pod světelným mikroskopem při 200násobném zvětšení.

Stanovení hladiny hormonů. Hladiny testosteronu (T) a LH byly kvantifikovány v homogenátech séra, encefala plus hypofýzy a varlat pomocí souprav pro radioimunoanalýzu (RIA) (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Peking, Čína). Krátce, anti-testosteron nebo anti-LH IgG protilátka (100 ul) a 125-I-konjugovaná anti-myší protilátka byly přidány ke vzorkům nebo standardu (100 ul) a míchány na kolébce přes noc při 4 stupních. Po trojnásobném promytí PBS-Tween 20 (500 ul) byly směsi centrifugovány (3500 ot./min.) při 4 stupních po dobu 15 minut. Hodnoty CPM precipitátů byly stanoveny pomocí radioimunoanalytického přístroje (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Peking, Čína) a koncentrace T a LH byly vypočteny podle vzorce standardu křivka. Variační koeficient Te T a LH je 2,8 procent a 3,2 procent ve skupinách vzorků a 2,1 procent a 2,8 procent ve standardních skupinách.

Stanovení genových expresí pomocí kvantitativní PCR v reálném čase. Celková RNA byla izolována ze zmrazených tkání varlat a encefala plus hypofýzy za použití soupravy RNA Simple Total RNA (Tiangen, Peking, Čína). Kvantitativní real-time PCR (q RT-PCR) byla provedena pro aplikaci cDNA pomocí 2×SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Čína). Postup PCR sestával z 95 stupňů po dobu 30 sekund následovaných 35 cykly 95 stupňů po dobu 15 sekund, 58 stupňů po dobu 30 sekund a 72 stupňů po dobu 30 sekund. Analýza křivky tání byla provedena na produktech PCR, aby se ověřila specificita primeru a čistota produktu. Pro každou destičku byla provedena disociační křivka pro potvrzení produkce jednoho produktu. Bylo vypočteno relativní množství každé mRNA. PCR primery použité pro studii jsou uvedeny v tabulce 2.

Western blot. Pro analýzu exprese AR byla provedena extrakce a izolace cytoplazmatického a jaderného proteinu pomocí soupravy pro extrakci cytoplazmatického a jaderného proteinu (Beyotime, Nanjing, Čína) podle pokynů výrobce. Koncentrace cytoplazmatických a jaderných proteinů byly hodnoceny pomocí soupravy Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Čína). Vzorky proteinů (80 ug) byly naneseny na 12% a 5% SDS-PAGE gel a přeneseny na PVDF membrány. Po zablokování byly membrány inkubovány s anti-AR IgG protilátkami (1:1,000; Bioss; Peking Čína) a myšími polyklonálními anti-GAPDH protilátkami (1:1,000; Wuhan Boster Biologický

Technology, Wuhan, Čína) nebo myší polyklonální anti-Lamin b1 protilátky po dobu 2 hodin. Membrána byla třikrát promyta TBST a inkubována s HRP-konjugovanou králičí anti-myší IgG protilátkou (1:5, 000; Bioss; Peking Čína). Signál byl vizualizován pomocí systému ChemiDoc Imaging System (Tanon-3,500, Šanghaj, Čína).

Test vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC).

Krev byla odebírána do heparinizovaných skleněných zkumavek. Plazma byla oddělena okamžitou centrifugací při 6,{1}} otáčkách za minutu po dobu 10 min a uložena při -20 stupních pro další experiment. Vzorky hypotalamu a varlat z každého časového bodu byly spojeny a homogenizovány methanolem. Po centrifugaci při 10, 000ot./min při 4 stupních po dobu 10 minut byl supernatant zakoncentrován N2 a zbytek byl rozpuštěn v 50 μl methanolu a přefiltrován přes 0,45 μm filtr. Deset μl kapaliny filtrované vzorkem bylo vstříknuto do systému HPLC pro analýzu. Standardní křivka sestávala ze vzorků obsahujících 50, 100, 250, 500 a 750 ng/ml ECH (Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, Čína). Vzorky pro kontrolu kvality plazmy s přídavkem 75 ng/ml (nízká), 150 ng/ml (střední) a 300 ng/ml (vysoká) ECH byly odpovídajícím způsobem připraveny pro měření přesnosti a preciznosti metody.

Chromatografie byla provedena pomocí systému HPLC (D2{{1{12}}}}}00 Elite series, Hitachi, Japonsko) připojeného k UV detektoru (L-2400, Hitachi, Japonsko). Separace byla provedena na Termo-C18 (250 mm x 4,6 mm vnitřní průměr, 4,6 um částice) koloně udržované při 25 stupních. Mobilní fází byl gradient připravený z 0,1 % kyseliny fosforečné obsahující 0,04 % trimethylaminu (složka A) a methanolu (složka B). Lineární gradient byl následující: 70–90 procent A za 0-2 min, 60–70 procent A za 2–6 minut, 55–60 procent B za 6–8 minut a poté se vrátil na 90 procent A při 8 min ihned. Průtok byl 0,8 ml/min. UV detektor pracoval při 332 nm. Oblast píku byla vyhodnocena jako analytické měření.

Farmakokinetické studie na myších. Průnik ECH do hypotalamu a varlat byly podrobeny farmakokinetické analýze pomocí softwaru Drug and Statistics (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China). Farmakokinetické parametry byly stanoveny nekompartmentální metodou založenou na teorii statistického momentu. Předběžné farmakokinetické parametry včetně doby do dosažení maximální konstanty (Tmax), maximální koncentrace (Cmax), konstanty rychlosti eliminace (Ke), poločasu eliminace (T0.5), plochy pod křivkou (AUC{ {4}}–12), zdánlivý distribuční objem (Vc) a clearance (CL) byly získány pro další analýzu. Poměry mozek/plazma byly vypočteny na základě hodnot AUC0-t pro plazmu a mozek.

Syntéza a identifikace ECH-ovalbuminu (ECH-OVA). Celkem 9,8 mg ECH a 1,{5}} mg anhydridu butandiolu bylo rozpuštěno ve 2 ml pyridinu, mícháno po dobu 12 hodin za míchání při teplotě místnosti. Směs se koncentruje N2 a zbytek se spojí s 10,8 mg N-hydroxysukcinimidu (NHS) a 19,3 mg dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) a rozpustí se ve 4 ml LN, N-dimethylformamidu (DMF) po dobu 12 hodin za míchání při teplotě místnosti. Po centrifugaci při 2,000 g po dobu 5 minut při 4 stupních byl supernatant přidán k 5 ml PBS, ve kterém bylo rozpuštěno 14,4 mg ovalbuminu (OVA). Nová směs se míchá 24 hodin při 4 stupních. Reakční roztok byl poté dialyzován proti PBS po dobu tří dnů. Přítomnost ECH-OVA byla potvrzena UV spektry (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) při vlnové délce v rozmezí od 190 do 400 nm, stejně jako denaturací PAGE.

Nepřímá ELISA (iELISA). Mikrotitrační destička byla potažena ECH-OVA (2 ug/100 ul) a inkubována přes noc při 4 stupních. Destička byla promyta třikrát PBST a dvakrát PBS a bylo přidáno 5 procent PBSM (PBS obsahující 5 procent odstředěného mléka), aby se blokovala nenavázaná místa při 37 stupních po dobu 2 hodin. Poté, co byly destičky promyty PBST a PBS, byly jamky rozděleny do 4 skupin; experimentální skupina, 1 ug AR celkového proteinu/100 μl; pozitivní skupina, králičí anti-OVA protilátka (1:1, 000); negativní skupina, 1 ug hovězího sérového albuminu; a prázdnou skupinu obsahující PBS. Po inkubaci po dobu 1,5 hodiny byly destičky promyty a do pozitivní skupiny bylo přidáno 100 ul/jamku králičího IgG konjugovaného s HRP (1:1,000), bylo přidáno 100 ul/jamku anti-AR ( 1:1,000) ostatním skupinám. Po inkubaci po dobu 1,5 hodiny bylo na destičky přidáno ředění králičího HRP-konjugovaného IgG (1:5,000). Po inkubaci při 37 stupních po dobu 1 hodiny byly destičky promyty třikrát PBST a dvakrát PBS. Poté byl přidán TMB a inkubován po dobu 10 minut ve tmě při teplotě místnosti a k ​​zastavení reakce byla přidána 2M H2S04. Absorbance byla odečtena při vlnové délce 450 nm.

Molekulární dokování. Byla provedena studie molekulárního dokování, aby se prozkoumal vazebný režim sloučeniny ECH k lidskému androgennímu receptoru (AR) pomocí Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Trojrozměrná (3D) struktura AR (PDB ID: 2YHD) byla stažena z Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). 3D struktura ECH byla získána pomocí softwaru ChemBioDraw Ultra 14.0 a ChemBio 3D Ultra 14.0. Ke generování vstupních souborů dokování byl použit balíček AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu). Vyhledávací mřížka AR byla identifikována jako střed x: 36,141, střed y: 8,513 a střed z: 21,304 s rozměry velikost x: 15, velikost y: 15 a velikost z: 15. Hodnota vyčerpání byla nastavena na 20. Pro dokování Vina byly použity výchozí parametry, pokud to nebylo uvedeno. Nejlépe hodnocená pozice podle hodnocení Vina docking score byla vybrána a vizuálně analyzována pomocí softwaru PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org). Analýza dat a statistické metody.

Analýza dat a statistické metody. Data byla analyzována pomocí statistického softwaru SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Pro srovnání mezi skupinami byla použita jednocestná ANOVA. Byly stanoveny Tukeyho srovnávací testy významných rozdílů mezi skupinami. Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (SD) za použití softwaru Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Sofware, Inc, Kalifornie, USA).

Etický souhlas a souhlas s účastí. Etický souhlas pro tuto studii byl získán od Etického výboru Anyang Institute of Technology