Část 2: Echinakosid zvyšuje množství spermií u potkanů cílením na hypotalamický androgenní receptor
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2
Experiment léčba.
Experiment 1. Myši byly náhodně rozděleny do šesti skupin, sedm myší v každé skupině (n=7).ECH(Echinakosid z cistanche)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Čína) byl podán pomocí intragastrické sondy a byl podán testosteron propionát (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tianjin, Čína). intramuskulární injekcí jednou denně po dobu 14 dnů podle následujícího experimentálního uspořádání: Kontrolní skupina: normální fyziologický roztok (10 ml/kg), ECH(L)skupina (5 mg/kg), ECH(M)skupina (20 mg/kg), ECH(H)skupina (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) a enzalutamid (inhibitor AR, jednou denně každý druhý den po dobu 14 dnů; 20 mg/kg; CAS: 915087- 33-1; Aladdin, Shanghai, Čína).
Po 2 týdnech léčby byly myši anestetizovány diethyletherem, aby byly odebrány vzorky krve pro analýzu hladin hormonů. Myši byly poté pitvány, aby se oddělil hypotalamus, mozek plus hypofýza, varlata a cauda nadvarlata. Vzorky cauda epididymis byly vloženy do normálního fyziologického roztoku s 5% BSA pro hodnocení kvality spermií a hypotalamus, mozek plus hypofýza a varlata byly zmraženy v tekutém dusíku a skladovány při -80 stupních pro další vyšetření.
Experiment 2. Myši byly náhodně rozděleny do 10 skupin, pět zvířat na skupinu. ECH (20 mg/kg) byl podáván orálně a myši v každé skupině byly anestetizovány diethyletherem v časových bodech 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h a 12 h po podání pro odběr vzorku.
Byla odebrána plazma a srdce bylo obnaženo. Perfuze normálního fyziologického roztoku do levé komory byla prováděna infuzním přístrojem, dokud játra a plíce nebyly blanšírovány. Poté byly odebrány hypotalamus a varlata pro stanovení tkáňových koncentrací ECH(Echinakosid z cistanche).
Experiment 3. Myši byly náhodně rozděleny do 4 skupin, sedm v každé skupině. ECH(Echinakosid z cistanche)a BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Shanghai, Čína) byly podávány intragastrickou sondou jednou denně po dobu 6 týdnů podle následujícího experimentálního uspořádání: normální skupina (kukuřičný olej, 10 ml/kg, bw/ d), modelová skupina: skupina BPA (BPA 200 mg/kg, bw/d, kukuřičný olej) a experimentální skupina: skupina BPA plus ECH (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg).
Po 42 dnech léčby byly myši anestetizovány diethyletherem a byly odebrány vzorky krve pro analýzy hladiny hormonů. Varlata a cauda epididymis byly odděleny a odebrány. Pro hodnocení kvality spermií bylo použito cauda epididymis a varlata byla zmražena v tekutém dusíku a skladována při teplotě -80 stupňů pro další vyšetření.
Obrázek 7. Dráhy regulované vybraným hormonem a proteinem souvisejícím s osou HPG v samčí reprodukci, jak předpověděly databáze Pathway Ontology Database a KEGG Pathway Database.
Poznámky: Regulované procesy jsou reprezentovány pozadím různých barev a tvarů a regulační události jsou zobrazeny pomocí šipek a čar.
Reference spojené s každým proteinem byly založeny na Pathway Ontology Database a KEGG Pathway Database a nejsou uvedeny.
Stanovení kvality spermatu. Příprava suspenze spermií. Cauda nadvarlata byla rozemleta do 5 ml normálního fyziologického roztoku s 5 procenty BSA a inkubována po dobu 5 minut při 37 stupních, aby se jejich obsah mohl rozšířit do média.
Počet spermií: Podle metody popsané Yokoi (2003) byla zředěná suspenze spermií (1:10; v/v; suspenze spermií/10% methanol) přenesena do každé počítací komory hemocytometru a byla ponechána stát 5 min a poté počítány pod světelným mikroskopem (Nikon, Instruments Inc., Japonsko) při zvětšení X200.
Životaschopnost spermií: Celkem 20 μl suspenze spermií bylo smícháno se stejným objemem barviva eosin-nigrosin po dobu 2 minut; nezabarvené spermie byly spočítány pod světelným mikroskopem při 200x zvětšení.
Pohyblivost spermií: Celkem 10 μl suspenze spermií bylo umístěno na podložní sklíčko a byly zaznamenány jako pohyblivé nebo nepohyblivé pod světelným mikroskopem při 200x zvětšení.
Stanovení hladiny hormonů. Hladiny testosteronu (T) a LH byly kvantifikovány v homogenátech séra, encefala plus hypofýzy a varlat pomocí souprav pro radioimunoanalýzu (RIA) (Beijing Sino-UK Institute of Biological Technology, Peking, Čína). Krátce, anti-testosteron nebo anti-LH IgG protilátka (100 ul) a 125-I-konjugovaná anti-myší protilátka byly přidány ke vzorkům nebo standardu (100 ul) a míchány na kolébce přes noc při 4 stupních. Po trojnásobném promytí PBS-Tween 20 (500 ul) byly směsi centrifugovány (3500 ot./min.) při 4 stupních po dobu 15 minut. Hodnoty CPM precipitátů byly stanoveny pomocí radioimunoanalytického přístroje (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Peking, Čína) a koncentrace T a LH byly vypočteny podle vzorce standardu křivka. Variační koeficient T a LH je 2,8 procenta a 3,2 procenta ve vzorových skupinách a 2,1 procenta a 2,8 procenta ve standardních skupinách.
Stanovení genových expresí pomocí kvantitativní PCR v reálném čase. Celková RNA byla izolována ze zmrazených tkání varlat a encefala plus hypofýzy za použití soupravy RNA Simple Total RNA (Tiangen, Peking, Čína). Kvantitativní real-time PCR (q RT-PCR) byla provedena pro amplifikaci cDNA pomocí 2 x SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Čína). Postup PCR sestával z 95 stupňů po dobu 30 sekund následovaných 35 cykly 95 stupňů po dobu 15 sekund, 58 stupňů po dobu 30 sekund a 72 stupňů po dobu 30 sekund. Analýza křivky tání byla provedena na produktech PCR, aby se ověřila specificita primeru a čistota produktu. Pro každou destičku byla provedena disociační křivka pro potvrzení produkce jednoho produktu. Bylo vypočteno relativní množství každé mRNA. PCR primery použité pro studii jsou uvedeny v tabulce 2.
Western blot. Pro analýzu exprese AR byla provedena extrakce a izolace cytoplazmatického a jaderného proteinu pomocí soupravy pro extrakci cytoplazmatického a jaderného proteinu (Beyotime, Nanjing, Čína) podle pokynů výrobce. Koncentrace cytoplazmatických a jaderných proteinů byly hodnoceny pomocí soupravy Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Čína). Vzorky proteinů (80 ug) byly naneseny na 12% a 5% SDS-PAGE gel a přeneseny na PVDF membrány. Po zablokování byly membrány inkubovány s anti-AR IgG protilátkami (1:1,000; Bioss; Peking Čína) a myšími polyklonálními anti-GAPDH protilátkami (1:1,000; Wuhan Boster BiologickýTechnology, Wuhan, Čína) nebo myší polyklonální anti-Lamin b1 protilátky po dobu 2 hodin. Membrána byla třikrát promyta TBST a inkubována s HRP-konjugovanou králičí anti-myší IgG protilátkou (1:5, 000; Bioss; Peking Čína). Signál byl vizualizován pomocí systému ChemiDoc Imaging System (Tanon-3,500, Šanghaj, Čína).
Test vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC). Krev byla odebírána do heparinizovaných skleněných zkumavek. Plazma byla oddělena okamžitou centrifugací při 6,000 otáčkách za minutu po dobu 10 min a uložena při -20 stupních pro další experiment. Vzorky hypotalamu a varlat z každého časového bodu byly spojeny a homogenizovány methanolem. Po centrifugaci při 10,000 otáčkách za minutu při 4 stupních po dobu 10 minut byl supernatant zakoncentrován N2 a zbytek byl rozpuštěn v 50 ul methanolu a přefiltrován přes 0,45 um filtr. Deset μl kapaliny filtrované vzorkem bylo vstříknuto do systému HPLC pro analýzu.
Standardní křivka se skládala ze vzorků obsahujících 50, 100, 250, 500 a 750 ng/ml ECH(Echinakosid z cistanche)(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sichuan, Čína). Vzorky pro kontrolu kvality plazmy s přídavkem 75 ng/ml (nízká), 150 ng/ml (střední) a 300 ng/ml (vysoká) ECH byly odpovídajícím způsobem připraveny pro měření přesnosti a preciznosti metody.
Chromatografie byla provedena pomocí systému HPLC (D2{{1{12}}}}}00 Elite series, Hitachi, Japonsko) připojeného k UV detektoru (L-2400, Hitachi, Japonsko). Separace byla provedena na Thermo-C18 (250 mm x 4,6 mm vnitřní průměr, 4,6 um částice) koloně udržované při 25 stupních. Mobilní fází byl gradient připravený z 0,1 % kyseliny fosforečné obsahující 0,04 % trimethylaminu (složka A) a methanolu (složka B). Lineární gradient byl následující: 70–90 procent A během 0-2 min, 60–70 procent A během 2–6 minut, 55–60 procent B během 6–8 minut a poté se vrátil na 90 procent A v 8 min ihned. Průtok byl 0,8 ml/min. UV detektor pracoval při 332 nm. Oblast píku byla vyhodnocena jako analytické měření.
Farmakokinetické studie na myších. Průnik ECH(Echinakosid z cistanche)do hypotalamu a varlat byl podroben farmakokinetické analýze pomocí softwaru Drug and Statistics (Drug and Statistics, Mathematical Pharmacology Professional Committee of China). Farmakokinetické parametry byly stanoveny nekompartmentální metodou založenou na teorii statistického momentu. Předběžné farmakokinetické parametry včetně doby do dosažení maximální konstanty (Tmax), maximální koncentrace (Cmax), konstanty rychlosti eliminace (Ke), poločasu eliminace (T0.5), plochy pod křivkou (AUC{ {4}}–12), zdánlivý distribuční objem (Vc) a clearance (CL) byly získány pro další analýzu. Poměry mozek/plazma byly vypočteny na základě hodnot AUC0-t pro plazmu a mozek.
Syntéza a identifikace ECH-ovalbuminu (ECH-OVA). Celkem 9,8 mg ECH(Echinakosid z cistanche)a 1 0 mg anhydridu butandiolu bylo rozpuštěno ve 2 ml pyridinu, mícháno po dobu 12 hodin za míchání při teplotě místnosti. Směs byla zakoncentrována pomocí N2 a zbytek byl spojen s 10,8 mg N-hydroxysukcinimidu (NHS) a 19,3 mg dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) a rozpuštěn ve 4 ml N,N-dimethylformamidu (DMF) po dobu 12 hodin za míchání při teplotě místnosti. . Po centrifugaci při 2,000g po dobu 5 minut při 4 stupních byl supernatant přidán do 5 ml PBS, ve kterém bylo rozpuštěno 14,4 mg ovalbuminu (OVA). Nová směs se míchá 24 hodin při 4 stupních. Reakční roztok byl poté dialyzován proti PBS po dobu tří dnů. Přítomnost ECH-OVA byla potvrzena UV spektry (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) při vlnové délce v rozmezí od 190 do 400 nm a také denaturací PAGE.
Nepřímá ELISA (iELISA). Mikrotitrační destička byla potažena ECH-OVA (2 ug/100 ul) a inkubována přes noc při 4 stupních. Destička byla promyta třikrát PBST a dvakrát PBS; a 5 procent PBSM (PBS obsahující 5 procent odstředěného mléka) bylo přidáno k blokování nenavázaných míst při 37 stupních po dobu 2 hodin. Poté, co byly destičky promyty PBST a PBS, byly jamky rozděleny do 4 skupin; experimentální skupina, 1 ug celkového proteinu AR/100 μl; pozitivní skupina, králičí anti-OVA protilátka (1:1, 000); negativní skupina, 1 ug hovězího sérového albuminu; a prázdnou skupinu obsahující PBS. Po inkubaci po dobu 1,5 hodiny byly destičky promyty a do pozitivní skupiny bylo přidáno 100 μl/jamku králičího IgG konjugovaného s HRP (1:1,000), bylo přidáno 100 μl/jamka anti-AR (1:1,000) ostatním skupinám. Po inkubaci po dobu 1,5 hodiny bylo na destičky přidáno ředění králičího HRP-konjugovaného IgG (1:5,000). Po inkubaci při 37 stupních po dobu 1 hodiny byly destičky promyty třikrát PBST a dvakrát PBS. Poté byl přidán TMB a inkubován po dobu 10 minut ve tmě při teplotě místnosti a k zastavení reakce byla přidána 2 M H2S04. Absorbance byla odečítána při vlnové délce 450 nm.
Molekulární dokování. Byla provedena studie molekulárního dokování, aby se prozkoumal vazebný režim sloučeniny ECH(Echinakosid z cistanche)na lidský androgenní receptor (AR) pomocí Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). Trojrozměrná (3D) struktura AR (PDB ID: 2YHD) byla stažena z Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). 3D struktura ECH byla získána pomocí softwaru ChemBioDraw Ultra 14.0 a ChemBio 3D Ultra 14.0. Ke generování vstupních souborů dokování byl použit balíček AutoDockTools 1.5.6 (http://mgltools.scripps.edu). Vyhledávací mřížka AR byla identifikována jako střed x: 36,141, střed y: 8,513 a střed z:
21.304 s rozměry velikost x: 15, velikost y: 15 a velikost z: 15. Hodnota vyčerpání byla nastavena na 20. Pro dokování Vina byly použity výchozí parametry, pokud nebyly uvedeny. Nejlépe hodnocená pozice podle hodnocení Vina docking score byla vybrána a vizuálně analyzována pomocí softwaru PyMOL 1.7.6 (http://www.pymol.org).
Analýza dat a statistické metody. Data byla analyzována pomocí statistického softwaru SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Pro srovnání mezi skupinami byla použita jednocestná ANOVA. Byly stanoveny Tukeyho srovnávací testy významných rozdílů mezi skupinami. Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (SD) za použití softwaru Graph Pad Prism v.7 (GraphPad Software, Inc, Kalifornie, USA).
Etický souhlas a souhlas s účastí. Etický souhlas pro tuto studii byl získán od Etického výboru Anyang Institute of Technology.
Reference
1. Cano, SN, Misra, M. & Ackerman, KE Cvičení, trénink a osa hypotalamus-hypofýza-gonadální osa u mužů a žen.Přední. Horm. Res. 47, 27–43 (2016).
2. Papadopoulos, V. & Miller, WL Role mitochondrií v steroidogenezi. Nejlepší praxe. Res. Cl. En. 26, 771–790 (2012).
3. Rone, MB a kol. Identifikace dynamického mitochondriálního proteinového komplexu, který řídí import cholesterolu, obchodování a metabolismus na steroidní hormon. Mol. Endocrinol. 26, 1868–1882 (2012).
4. Shibari, S., Ylonen, H. & Palme, R. Vylučování a měření kortikosteronu a metabolitů testosteronu u hraboše obecného (Myodes glareolus). Gen. Comp. Endocrinol. 243, 39–50 (2017).
5. O'Hara, L. a kol. Signalizace hypofyzárního androgenního receptoru reguluje prolaktin, ale ne gonadotropiny u samců myši. PloS jedna. 10, e0121657 (2015).
6. Amador, AG, Parkening, TA, Beamer, WG, Bartke, A. & Collins, TJ Testikulární LH receptory a hladiny cirkulujícího hormonu ve třech myších modelech pro dědičné choroby (Tfm/y, lit/lit a hyt/hyt). Endocrinol. Exp. 20, 349-58 (1986).
7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. & Scheiner-Bobis, G. Neklasická testosteronová signalizace zprostředkovaná prostřednictvím ZIP9 stimuluje expresi klaudinu a tvorbu těsného spojení v Sertoliho buňkách. Buňka. Signál. 28, 1075–85 (2016).
8. Walker, WH Testosteronová signalizace a regulace spermatogeneze. Spermatogeneze. 1, 116–20 (2011).
9. Cao, C. & Kindscher, K. The Medicinal Chemistry of Echinacea Species (ed. Kindscher, K.) 127–145 (Springer, 2016).
10. Jiang, ZH, Jian, W., Li, XP & Zhang, XYEchinakosidaCistanche tubulosa (Schenk) R. Wight zmírňuje poškození varlat a spermií vyvolané bisfenolem A u potkanů prostřednictvím steroidogenních enzymů regulovaných osou gonád. J. Ethnopharmacol. 193, 321–328 (2016).
