Část 1: Verbascoside chrání pankreatické buňky před ER-stresem
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 a Carla Perego 1,*
Abstraktní:
Podstatné epidemiologické důkazy naznačují, že strava bohatá na polyfenoly chrání před rozvojem diabetu 2. typu. Fenylethanoidní glykosidverbaskosid/akteosid, široce rozšířená polyfenolická rostlinná sloučenina, má několik biologických vlastností včetně silných antioxidačních, protizánětlivých a neuroprotektivních aktivit. Cílem tohoto výzkumu bylo otestovat možné účinkyverbascosidena buňkách slinivky břišní, cíl nikdy předtím netestovaný. Myší a lidské buňky byly inkubovány sverbascoside(0,8–16 uM) po dobu až pěti dnů a kombinace biochemických a zobrazovacích technik byly použity k posouzení přežití a funkce buněk za normálních nebo endoplazmatických retikulum (ER)-stres vyvolávajících podmínek. Zjistili jsme na dávce závislý ochranný účinekverbascosideproti oxidativnímu stresu v klonálních a lidských buňkách. Mechanistické studie odhalily, že polyfenol chrání buňky před dysfunkcemi zprostředkovanými ER stresem, moduluje aktivaci větve proteinkinázy RNA-like endoplazmatické retikulum kinázy (PERK) v rozvinuté proteinové odpovědi a podporuje mitochondriální dynamiku. V důsledku toho byla v těchto buňkách zjištěna zvýšená životaschopnost, mitochondriální funkce a obsah inzulínu. Tyto studie poskytují důkaz, ževerbascosidezvyšuje schopnost buněk vyrovnat se s ER-stresem, což je důležitý přispěvatel k dysfunkci a selhání buněk při diabetických stavech a podporuje terapeutický potenciál verbascosidu u diabetu.
klíčová slova:
verbascoside; polyfenoly; buňky produkující inzulín; diabetes; UPR; oxidační stres; ER-stres; VYZDOBIT; protizánětlivé; mitochondrie
1. Úvod
Diabetes je chronické onemocnění postihující stovky milionů lidí [1]. Diabetes typu 1 (T1D) a diabetes typu 2 (T2D) jsou charakteristické odlišnou etiologií, přičemž oba se vyznačují nedostatkem inzulínu [2]. Inzulín reguluje koncentraci glukózy v plazmě, stimuluje vychytávání glukózy ve svalových a tukových buňkách a moduluje metabolismus glukózy v játrech. Dostupnost živin, hormony a nervové vstupy regulují pankreatickou sekreci inzulínu a udržují koncentrace glukózy v krvi ve fyziologickém rozmezí [3–5]. Proto dysfunkce -buněk vede k diabetu charakterizovanému hyperglykémií nalačno.
T2D je progresivní stav, ve kterém jsou inzulinová rezistence a nesprávné funkce buněk spojeny a nedávné důkazy zvýšily zájem o kritickou primární roli buněk při hyperglykemickém stavu [6,7]. U nediabetických obézních jedinců kompenzují buňky inzulínovou rezistenci zvýšenou sekrecí hormonu. U některých subjektů však se zhoršujícím se stavem inzulinémie klesá a hladina glukózy stoupá k hyperglykémii [8,9].
Glukóza je nejdůležitější modulátor funkcí buněk. Glukózová stimulace ovlivňuje regulaci genů a expresi proteinů zapojených do mnoha buněčných funkcí, jako je glykolýza, syntéza inzulínu a sekrece [10]. Glukózou indukovaná sekrece inzulínu závisí na oxidativním metabolismu za vzniku adenosintrifosfátu (ATP) a fyziologicky je produkována nízká hladina reaktivních forem kyslíku (ROS). -buňky však nejsou příliš dobře vybaveny scavengerovými enzymy a tato slabost je činí velmi náchylnými k oxidativnímu stresu [11,12]. Jak oxidační stres stoupá, produkce inzulínu v buňkách klesá a buňky produkují cytokiny, které podněcují poškození buněk prostřednictvím zánětu a apoptózy [13]. Je zajímavé, že ačkoliv byla snížená hmota -buněk dříve připisována buněčné smrti, nedávné studie naznačují hlavní roli buněčné dediferenciace [14,15]. Ukázalo se, že několik fází směřuje k T2D. Metabolické a oxidační poškození způsobují stres endoplazmatického retikula (ER), který vede k poklesu syntézy a sekrece inzulínu, zánětlivým procesům po uvolnění cytokinů a ztrátě buněk může dojít apoptózou a dediferenciací. Tyto znalosti jsou zásadní pro vývoj vhodných strategií léčby, protože oxidačnímu stresu a zánětu lze čelit a plasticita pankreatických buněk umožňuje přeměnit kmenové buňky na buňky, jak bylo prokázáno u myší [16].
Nedávno zranitelnost -buněk vůči oxidativnímu stresu úspěšně podnítila použití dietních antioxidantů k prevenci diabetu [17]. Olivový olej patří mezi nejzajímavější antioxidační potraviny a je známý pro své blahodárné vlastnosti již od starověkých Řeků. Olivový olej obsahuje dobré množství mono-nenasycených mastných kyselin (MUFA) a několik polyfenolů, jako je tyrosol, hydroxytyrosol, oleuropein a verbascosid.
Verbascoside, také známý jako akteosid, je fenylethanoidní glykosid extrahovaný z Olea europea, rostlin druhu Verbascum a 23 dalších rostlinných čeledí [18–20]. Může být také získán z vedlejších produktů olivového oleje (je obohacen odpadní vodou z olivového mlýna pocházející ze zpracování plodů oliv) nebo může být produkován přístupy metabolického inženýrství a syntetické biologie [21].
Dosud nebyly hlášeny žádné údaje o biologické dostupnosti verbascosidu u lidí. Studie provedené na myších, buňkách SKBR3 a Caco{1}} naznačují, že je možné, aby nemetabolizovaný verbascosid procházel střevní bariérou, cirkuloval v krevní plazmě a vykazoval antioxidační účinky [20,22,23]. Na rozdíl od většiny rostlinných polyfenolů působí verbaskosid na buňky především prostřednictvím modulace genové transkripce různých enzymů a regulačních faktorů s antioxidačními a protizánětlivými účinky [24–30].
Přestože je známo mnoho příznivých účinků verbascosidu na lidské zdraví, neexistují žádné údaje o jeho účinku na pankreatické buňky. Protože oxidační stres a zánět jsou základem patogeneze T2D, zkoumali jsme, zda léčba verbascosidem může zlepšit životaschopnost buněk a
funkci v podmínkách vyvolávajících ER stres a charakterizovali jsme molekulární mechanismy jejího působení. Naše data ukazují, že verbascosid zabraňuje oxidačnímu stresu a zánětu buněk, moduluje aktivaci rozložené proteinové odpovědi a podporuje mitochondriální dynamiku, což vede ke zvýšené životaschopnosti buněk a obsahu inzulínu.
2. Materiály a metody
2.1. Buněčná kultura a materiály
Myší buňky tc3 (laskavě poskytnuté prof. Hanahanem – Ústav biochemie a biofyziky, University of California, San Francisco, CA [31]) byly kultivovány v médiu RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90). 0, Pero MI, Itálie) doplněné 10 procenty (v/v) tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Itálie), 1 procentem (v/v) penicilin-streptomycinem (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Itálie) a 1 procento (v/v) L-glutaminu (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Itálie). Lidské Langerhansovy ostrůvky byly izolovány v Miláně (Niguarda Ca' Granda) z kadaverózních multiorgánových dárců podle postupu popsaného Ricordi et al. [32]; byly kultivovány v kultivačním médiu RPMI obsahujícím 5,5 mmol/l glukózy, 10 procent teplem inaktivovaného fetálního bovinního séra, 0,7 mM glutaminu, 50 jednotek/ml penicilinu a 50 ug/ml streptomycinu (EuroClone, SpA, Pero MI, Itálie). Byly použity čtyři různé preparáty ostrůvků, čistota ostrůvků byla 80 ± 10 procent. Izolace ostrůvků a studie ostrůvků byly schváleny Etickou komisí nemocnice Niguarda Ca' Granda v Miláně (11.12.2009). Buňky tc3 byly ošetřeny 0,8, 1,6 a 16 uM verbaskosidu (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), kyselinou kafeovou a hydroxytyrosolem (laskavý dar prof. Dell'Agli, Ústav farmakologických a biomolekulárních věd, Universita degli Studi di Milano, Milán, Itálie) v kompletním médiu RPMI po dobu 5 dnů, zatímco lidské ostrůvky s 16 uM verbascoside. Buňky ošetřené methanolem/ethanolem byly použity jako kontroly. Za účelem vyvolání oxidačního stresu byly buňky před analýzou ošetřeny H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM v kompletním médiu RPMI po dobu 20 minut, zatímco byly ošetřeny tunicamycinem 2 ug/ml (T7765, Sigma Aldrich ) po dobu 7 hodin pro vyvolání stresu ER.
2.2. Detekce buněčné životaschopnosti testem MTT
Buňky byly umístěny na 96 vícejamkových destičkách a pět dní po ošetření verbascosidem byly inkubovány s 0,5 mg/ml MTT (3-(4,5-dimethyltiazol{{7} }yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) po dobu 4 hodin ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent CO2 při 37 oC. Po inkubaci byly buňky jemně resuspendovány ve 100 ul DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Itálie) a absorbance při 540 nm byla detekována čtečkou mikrodestiček (Benchmark, čtečka mikrotitračních destiček, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) [33]. Experimenty byly provedeny v triplikátech a data byla vyjádřena jako násobek zvýšení oproti kontrolním vzorkům.
2.3. Detekce buněčné smrti průtokovou cytometrií
Pět dnů po inkubaci s 16 uM verbascosidem byly buňky odděleny 7 minutovou inkubací s trypsinem/EDTA, shromážděny a odstředěny; peleta byla jemně resuspendována ve fosfátovém pufru s nízkým obsahem solí. Buňky byly obarveny pomocí MuseTM count and viability reagent (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) podle protokolu výrobce a analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Experimenty byly provedeny trojmo a data byla vyjádřena jako procento mrtvých buněk z celku.
2.4. generace ROS
Intracelulární ROS byly hodnoceny pomocí DCFDA (2/,7/-dichlorofuorescein diacetát) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA), membránou propustné sondy, která se stává fluorescenční, když je navázána na ROS [34]. Buňky tc3 byly předem naplněny 15 uM DCFDA v Krebs-Ringerově pufru (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgS04, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 a 2 mM CaCl2)
doplněné 11 mM glukózou po dobu 1 hodiny při 37 oC. Obsah ROS byl detekován po dobu 30 minut v bazálních i stresových podmínkách pomocí čtečky mikrodestiček (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Švýcarsko). Průměrné hodnoty a standardní odchylky byly založeny na třech nezávislých experimentech.
2.5. Western blotting
Buňky tc3 byly shromážděny a solubilizovány v pufru RIPA (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1 procento TERGITOLw NP40, 0,5 procenta deoxycholátu) s přidaným aprotininem (Sigma Aldrich, St A45. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) a inhibitory Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) po dobu 40 minut při 4 oC. Koncentrace proteinu byla stanovena Bradfordovým testem [35] za použití Bradfordova činidla (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA), 30 ug proteinů bylo rozděleno pomocí 10% SDS-PAGE a přeneseno na nitrocelulózové membrány (Millipore, Burlington MA, USA). Primární protilátky byly aplikovány po dobu 2 hodin v blokovacím pufru s 5% odtučněným mlékem nebo 5% roztoky BSA; byly použity následující primární protilátky: myší anti- -aktin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), myší anti-akrolein (Abcam, ab48501,Cambridge, UK), myší anti-BIP (laskavý dar prof. Borgese Nica, Institute of Neuroscience, CNR, Milán, Itálie), králičí anti-HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), myší anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), králičí anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), myší anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc ., 4814, Danvers, MA, USA), králičí anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), králičí anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), ovčí anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), králičí anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), králičí anti-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Danvers, MA, USA) a králičí anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). Sekundární protilátky konjugované s HRP (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) byly použity v ředění 1:5000. Proteiny byly detekovány pomocí detekčního systému ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Itálie) pomocí systému Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Německo) a hustota pásů byla kvantifikována softwarem Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. Experimenty byly provedeny v triplikátech a data byla vyjádřena jako násobek zvýšení oproti kontrolním vzorkům.
2.6. Potenciál mitochondriální membrány
Buňky tc3 a lidské Langerhansovy ostrůvky byly inkubovány se 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milán, Itálie) nebo 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Milán, 37 Itálie) pro 03 Srl oC; Intenzity fluorescence byly detekovány pomocí čtečky mikrodestiček TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em pro MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em pro MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd., Mändorf, Switzerland). Buňky byly inkubovány s 500 uM H202 po dobu 20 minut a intenzita fluorescence byla detekována, jak bylo popsáno dříve. Průměrné hodnoty a standardní odchylky byly založeny na třech různých experimentech.
2.7. Mitochondriální morfologie a dynamika
Buňky tc3 byly předem naplněny 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milán, Itálie) v 11 mM glukózovém Krebs-Ringerově pufru při 37 oC po dobu 30 minut. Vzorky byly umístěny do zobrazovací komory a náhodná pole byla zobrazena pomocí rhodanového filtru mikroskopu Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Německo). Pro vyhodnocení mitochondriální morfologie byly pomocí softwaru ImageJ částicového analyzátoru analyzovány následující parametry: plocha (um2), kruhovitost (4mArea2/Perimeter2) a Feretův maximální průměr (um) [37].
U časosběrných experimentů bylo jednobuněčné zobrazování prováděno rychlostí 1 snímek za sekundu po dobu 30 s za podmínek kontroly nebo oxidačního stresu. Pro měření mitochondriální kumulativní vzdálenosti (um2) byly obrázky nejprve opraveny na vyblednutí fotografií, poté byla videa analyzována pomocí existujícího modulu Image-Pro Plus Plug-in (sledování objektů) (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Až dvanáct
buňky byly zobrazeny ve třech nezávislých experimentech a data byla prezentována jako střední hodnoty a standardní odchylky.
2.8. Sekrece inzulínu
Lidské izolované Langerhansovy ostrůvky byly nasazeny na 96-jamkovou destičku v hustotě 20 ostrůvků na jamku a po 5 dnech léčby byl obsah inzulínu a sekrece měřeny v bazální (3,3 mM glukózy) a stimulovány (16,7 mM glukózy ) podmínky pomocí imunotestu ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Švédsko).
2.9. Statistické analýzy
Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí GraphPad Prism 8.0 na nezávislých biologických replikátech. Průměry mezi dvěma skupinami byly hodnoceny pomocí dvoustranného Studentova t-testu a p-hodnota < 0,05="" byla="" brána="" jako="" důkaz="" statistické="" významnosti.="" průměry="" mezi="" třemi="" nebo="" více="" skupinami="" byly="" porovnány="" analýzou="" rozptylu="" (anova),="" následovanou="" vícenásobným="" post-hoc="" (tukeyho)="" srovnávacím="" testem.="" použitý="" statistický="" test,="" přesné="" hodnoty="" p="" a="" počet="" replik="" (n)="" jsou="" uvedeny="" v="" legendách="" jednotlivých="" obrázků.="" chybové="" úsečky="" na="" obrázcích="" zobrazují="" průměr="" ±="" sd="" nebo="" průměr="" ±="" se,="" jak="" je="">
3. Výsledky
3.1. Verbaskosid zlepšuje životaschopnost buněk
Protože nebyly k dispozici žádné údaje o účinku verbascosidu na -buňky, provedli jsme MTT test k vyhodnocení životaschopnosti buněk a jak je znázorněno na obrázku 1A, byl pozorován pozitivní trend závislý na dávce. Pro další studie jsme tedy vybrali 16 uM koncentraci, u které se statisticky prokázalo, že je účinná pro zvýšení životaschopnosti buněk. Pomocí průtokové cytometrie jsme studovali vliv pětidenní inkubace verbascosidu na přežití buněk v bazálních podmínkách a po 2{{21} } min předúpravy 500 uM H2O2. V bazálním stavu verbascosid neovlivnil přežití buněk, což naznačuje, že zvýšená životaschopnost buněk pozorovaná v testu MTT může být způsobena zlepšenou mitochondriální aktivitou. Zatímco po expozici H2O2 předúprava 16 uM verbascosidem významně snížila smrt buněk vyvolanou oxidačním stresem (obrázek 1B,C). Verbascosid je komplexní molekula, kterou lze modifikovat hydrolyzujícími enzymy [18]. Aby se otestovalo, zda metabolity verbascosidu mohou být zodpovědné za pozorovaný ochranný účinek, byly buňky tc3 ošetřeny hydroxytyrosolem a kafeovými kyselinami (0,8 a 16 uM) po dobu 5 dnů. Oba metabolity nezvyšovaly životaschopnost buněk, naopak cytotoxický účinek, relevantnější po expozici H2O2, byl detekován pro koncentraci 16 uM (obr. S1). Toto zjištění dokazuje, že ochranný účinek na léčbu H2O2 má verbascosid a nikoli jeho metabolity.
3.2. Verbaskosid moduluje redoxní homeostázu a má protizánětlivý účinek v buňkách
Nejprve jsme u buněk tc3 potvrdili protizánětlivé a antioxidační účinky verbascosidu pozorované u jiných typů buněk [24,29,34]. Aktivita vychytávání ROS verbascosidem byla hodnocena pomocí buněk tc3 značených buněčnou permeabilní sondou DCFDA (2/,7/-dichlorofuorescein diacetát) specifickou pro ROS. Jak je znázorněno na obrázku 2A, po předběžném ošetření verbascosidem byl detekován významný pokles obsahu ROS, a to jak za podmínek bazálního, tak oxidačního stresu.
Western blot analýzy odhalily významný pokles exprese markerů oxidativního stresu akroleinu a 4-hydroxynonenalu (HNE) v buňkách ošetřených verbascosidem. Kromě toho jsme zjistili zvýšení exprese superoxiddismutázy (SOD1), což naznačuje, že verbascosid uplatňuje svou antioxidační aktivitu pravděpodobně dvěma různými mechanismy, přímo jako lapač ROS a nepřímo indukcí exprese antioxidačních enzymů (obrázek 2B, C).
Protizánětlivý účinek verbascosidu na -buňky byl hodnocen vyhodnocením aktivace NFKB dráhy, nejdůležitější prozánětlivé dráhy v těchto buňkách [38]. Western blot analýzou jsme zjistili sníženou expresi inhibitoru nukleárního faktoru kappa B (IKB ) a nukleárního faktoru kappa-light-chain-enhancer (NFKB) a signifikantní snížení fosforylace NFKB v předem ošetřených buňkách, což podporuje hypotézu účinnost verbascosidu snížit buněčný zánět (obrázek 2D,E).
3.3. Verbaskosid moduluje rozloženou proteinovou odpověď -buněk
Poté jsme do hloubky analyzovali molekulární mechanismus, kterým verbascosid vykonává antioxidační a protizánětlivé role, se zaměřením na endoplazmatické retikulum, které se objevuje jako klíčový senzor metabolických a stresových signálů v buňkách. Za stresových podmínek organela vyvolá homeostatickou odezvu, známou jako odpověď na rozložený protein (UPR), zaměřenou na obnovení funkce ER; nadměrná aktivace této dráhy však vede k apoptóze [39,40].
Markery zvýšeného ER stresu jsou upregulace chaperonových proteinů a aktivace UPR reakce. Analýza Western blotting buněk ošetřených verbascosidem odhalila snížené hladiny dvou chaperoninů proteinu tepelného šoku 70 (HSP70) a vazebného imunoglobulinového proteinu (BIP) (obrázek 3A,B). Dále byla detekována významná redukce exprese proteinkinázy RNA-like ER kinase (PERK) a snížená fosforylace jejího downstream efektoru, eukaryotického translačního iniciačního faktoru 2 (eIF2).
