Část 2: Akteosid potlačuje osteoklastogenezi zprostředkovanou RANKL inhibicí indukce C-Fos a dráhy NF-KB a zeslabením produkce ROS

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*

Pls klikněte zde zpět na část 1

AkteosidInhibuje kostní resorpci makrofágy Akteosid také zabránil RANKL-zprostředkované kostní resorpci způsobem závislým na dávce, jak bylo měřeno in vitro modelovým systémem (obr. 3A). Kostní resorpce byla významně inhibována, když byly BMM inkubovány s 1 mM akteosidem (obr. 3B). Ošetření 10 mM akteosidem téměř úplně zeslabilo tvorbu důlků indukovanou RANKL pomocí BMM. Podobně akteosid snižoval kostní resorpci v buňkách RAW264.7 stimulovaných RANKL (obr. S2A a B). Schopnost akteosidu inhibovat kostní resorpci závisela na načasování léčby ve vztahu ke stimulaci RANKL. Akteosid (10 mM) přidaný 4 dny po stimulaci RANKL nesnížil tvorbu jamek u BMM, zatímco potlačil počet vytvořených osteoklastů (obr. 3C). Tento rozdílný výsledek byl částečně způsoben oblastí jamky již vytvořené po 4 dnech tvorby stimulace RANKL (obr. 3D).

EXTRAKT CISTANCHE

AkteosidDown-reguluje časné signální dráhy RANKL

RANKL indukuje aktivaci 3 dobře známých MAPK a NF-kB v prekurzorech osteoklastů a tato aktivace je nutná pro časnou diferenciaci osteoklastů. Abychom pochopili možné mechanismy, kterýmiakteosidinhibuje osteoklastogenezi, zkoumali jsme účinekakteosidna MAPK a aktivaci NF-kB v makrofázích. Buňky BMM a RAW264.7 byly předem ošetřeny 10 mM akteosidem po dobu 2 hodin a poté stimulovány 100 ng/ml RANKL po dobu 30 minut. Fosforylace MAPK byla zkoumána Western blotem a imunometrickou analýzou. RANKL indukoval fosforylaci p38, ERK a JNK v BMM (obr. 4A) a RAW264.7 buňkách (obr. 4B). Akteosid zabránil těmto RANKL-indukovaným zvýšením p-p38, p-ERK a p-JNK. Tento výsledek byl podpořen imunometrickou analýzou, která předběžná úprava 10 mM akteosidem významně inhibovala hladiny fosforylovaných MAPK v těchto makrofázích (obr. 4C). Léčba RANKL zvýšila vazbu DNA NF-kB, zatímco akteosid inhiboval RANKL-indukovanou aktivaci vazby NF-kB-DNA (obr. 5A). Tato inhibice byla výraznější u BMM než u buněk RAW264.7. Akteosid také snížil RANKL-stimulovanou fosforylaci p65 a IkBa v buňkách BMM a RAW264.7 (obr. 5B a C). Přidání 10 mM akteosidu téměř úplně inhibovalo jak degradaci, tak aktivaci IkBa v BMM (obr. 5B). Aby se dále potvrdilo, že aktivace NF-kB se účastní působení akteosidu, konstrukty promotor-luciferáza kB byly přechodně transfekovány do buněk RAW264.7. Buňky inkubované se 100 ng/ml RANKL měly 3-krát vyšší aktivitu promotoru kB, která byla významně oslabena 10 mM akteosidem (obr. 5D).

AkteosidPotlačuje produkci zánětlivých cytokinů a expresi TNF-a, c-Fos a NFATc1 v RANKL-stimulovaných makrofázích TNF-a, IL-1b a IL-6 jsou důležité při tvorbě osteoklastů a funkce, která je zprostředkována signalizací NF-kB v makrofázích stimulovaných RANKL. RANKL stimuloval produkci těchto cytokinů a tato produkce byla výrazně snížena předběžnou úpravou 10 mM akteosidem u BMM (obr. 6A). Podobně akteosid zeslabil RANKL-indukovanou produkci cytokinů, kromě IL-6, v makrofázích RAW264.7 (obr. S3). Abychom porozuměli molekulárním mechanismům účinku akteosidů v osteoklastogenezi, dále jsme zkoumali účinek akteosidu na expresi TNF-a, c-Fos a NFATc1. RANKL up-reguloval expresi mRNA těchto faktorů v buňkách BMM a RAW264.7 (obr. 6B a C). Předběžné ošetření 10 mM akteosidem významně inhibovalo RANKL-indukovanou expresi těchto faktorů v obou

BMM a buňky RAW264.7. Předběžné ošetření akteosidy také silně snížilo hladiny proteinu c-Fos a NFATc1 v BMM stimulovaných RANKL (obr. 6D). Tyto výsledky naznačují, že akteosid down-reguluje RANKL indukující mediátory tvorby osteoklastů na úrovni genů a proteinů.

EXTRAKT CISTANCHE: ACTEOSID

Akteosid snižuje intracelulární tvorbu ROS u BMM způsobem závislým na dávce

Protože je známo, že intracelulární produkce ROS koreluje s osteoklastogenezí stimulovanou RANKL, zkoumali jsme, zda akteosid inhibuje produkci ROS během diferenciace osteoklastů zprostředkované RANKL pomocí barviva DCFH-DA, které propouští buňky a je citlivé na oxidaci. Analýza průtokovou cytometrií ukázala, že střední fluorescenční signál specifický pro DCF u BMM byl zjevně posunut doprava po stimulaci RANKL ve srovnání s neošetřenými kontrolními buňkami (obr. 7A). Tento posun byl podobný případu, kdy byly po stimulaci RANKL pozorovány makrofágy RAW264.7 (data nejsou uvedena). Léčba BMM akteosidem snížila intenzitu signálu DCF způsobem závislým na dávce. Předběžné ošetření 10 mM akteosidem téměř úplně snížilo hladiny intracelulárního ROS produkovaného během diferenciace osteoklastů na neošetřené kontrolní hladiny (obr. 7B).

Orální podávání akteosidů inhibuje změnu osteoporotických biochemických markerů a úbytek kostní hmoty u myší po ovariektomii

Abychom prozkoumali účinek akteosidu na ztrátu kostní hmoty, připravili jsme osteoporotický zvířecí model pomocí ovariektomie. Během experimentálního období nebyl žádný významný rozdíl v tělesné hmotnosti mezi OVX a Sham myšmi (data nejsou uvedena). Skupina OVX měla významně vyšší sérové ​​hladiny IL-1ba IL-6 než skupina Sham (obr. 8). Zvýšení těchto zánětlivých cytokinů vyvolané ovariektomií bylo zmírněno perorálním podáváním akteosidů (skupina AC). Sérové ​​hladiny markerů kostního obratu, jako je ALP, vápník, TRAP5b a OC, byly významně zvýšeny ve skupině OVX. Z těchto osteoporotických markerů byly zvýšené hladiny vápníku, TRAP5b a OC u OVX myší zjevně inhibovány léčbou akteosidy, zatímco sérová hladina ALP se léčbou nezměnila. Průměrné maximální zatížení zlomeninou do středu pravé diafýzy femuru bylo významně nižší ve skupině OVX než ve skupině Sham (obr. 9A). Léčba akteosidy zvýšila maximální zlomeninu zpět na zlomeninu u skupiny Sham. Když byla vypreparována kortikální kost stehenní kosti a pozorována optickou mikroskopií, osteoporotické rysy u OVX skupiny téměř úplně zmizely u AC myší (obr. 9B). Pro ověření účinku akteosidu na model osteoporózy indukované OVX byly BMD a kostní morfologické parametry v trabekulární části lehkého proximálního femuru analyzovány pomocí mikro-CT. Jak je znázorněno na obr. 9C, u OVX myší byla nalezena změna femorální trabekulární architektury, zatímco tato změna byla zmenšena ošetřením akteosidem. Výsledky z mikro-CT analýzy odhalily, že BMD, měřítko síly kosti, byla u OVX myší dramaticky snížena (obr. 9D). Ve srovnání se skupinou Sham vykazovaly myši OVX také významné změny v BV/TV, Tb. Sp, a Tb. N, ale ne v Tb.Th. Orální léčba akteosidy u OVX myší významně zabránila změně BMD, stejně jako BV/TV a Tb.N.

Akteosid neovlivňuje osteoblastogenezi v buňkách kostní dřeně

Úloha akteosidu na osteoblastickou diferenciaci byla dále zkoumána pomocí buněk kostní dřeně. Jak je znázorněno na obr. 10A, ošetření DAG zvýšilo počet buněk barvených alizarinovou červení a toto nebylo změněno předběžnou úpravou 10 mM akteosidem. Množství přítomného barviva ukazuje, že kombinovaný akteosid aOšetření DAG nezměnilo mineralizaci (obr. 10B). Podobně DAG-indukované zvýšení obsahu intracelulárního vápníku (obr. 10C) a hladin mRNA (obr. 10D) kostně specifických markerů, jako je Runx2, osterix, BSP a OC, nebylo ovlivněno předběžnou léčbou akteosidem.

účinek akteosidu cistanche

Diskuse

Remodelace kosti je přísně regulována rovnováhou mezi tvorbou kosti osteoblasty a resorpcí kosti osteoklasty. Prodloužená a nadměrná kostní resorpce způsobuje nerovnováhu kosterního obratu, což má za následek onemocnění kostní resorpce. Ke zkoumání účinků akteosidu na osteoklastogenezi jsme použili dva makrofágy, primárně kultivované BMM a RAW264.7 buňky.

Tyto buňky byly stimulovány RANKL k diferenciaci na osteoklasty v přítomnosti a nepřítomnosti akteosidu. Poprvé jsme ukázali, že akteosid inhibuje diferenciaci a tvorbu osteoklastů. Samotný akteosid ve zkoumaných koncentracích nezpůsobil snížení životaschopnosti primárně kultivovaných makrofágů v podmínkách růstu i diferenciace.

Léčba akteosidy také snížila resorpční aktivitu zralých osteoklastů. Tyto výsledky naznačují, že akteosid potlačuje tvorbu osteoklastů z makrofágů a aktivitu resorpce osteoklastů. Výsledky z našeho kultivačního systému, který nezahrnoval osteoblasty nebo stromální buňky, také naznačují, že akteosid zabraňuje tvorbě osteoklastů přímým působením na prekurzory osteoklastů.

RANKL aktivuje MAPK včetně p38, ERK a JNK. Tyto tři kinázy se účastní časné osteoklastické diferenciace, a tak jejich inhibice farmakologicky nebo s dominantně negativní transfekcí JNK potlačuje osteoklastogenezi indukovanou RANKL [29]. Naše výsledky odhalily, že předběžná úprava akteosidy inhibovala všechny tyto kinázy, což ukazuje na nespecifickou down-regulaci MAPK. Tento výsledek se částečně lišil od předchozí zprávy, že EGCG, hlavní protizánětlivá sloučenina v zeleném čaji, specificky zeslabila aktivaci JNK, aniž by ovlivnila aktivaci ERK nebo p38 u BMM stimulovaných RANKL [7]. Paeonol, protizánětlivá sloučenina odvozená z čínské byliny, také inhibuje fosforylaci ERK a p38, nikoli však JNK, v buňkách RAW264.7 stimulovaných RANKL [30]. Naproti tomu silibinin, nový inhibitor v kosti, zmírnil aktivaci p38, ERK a JNK indukovanou RANKL [31]. Tato zjištění naznačují, že účinky antiresorpčních sloučenin na aktivaci MAPK pomocí RANKL závisí na sloučenině, ačkoli všechny tři MAPK se účastní časné osteoklastogeneze.

Vezmeme-li v úvahu pozorování, že akteosid oslabil p-JNK

hladin v RANKL-stimulovaných BMM, dokonce i při 1 mM, blokáda JNK spíše než p38 MAPK nebo ERK se zdála být specifičtější událostí v akteosidy zprostředkované anti-osteoklastogenezi v buňkách. Ačkoli akteosid ve stejné koncentraci nesnížil počet osteoklastů v BMM, došlo k významnému snížení tvorby jamek působením akteosidů. Také jsme zjistili, že předběžné ošetření SP600125, farmakologickým inhibitorem specifickým pro JNK, dramaticky zabránilo tvorbě osteoklastů (data nejsou uvedena). Souhrnně tato zjištění naznačují, že signalizace zprostředkovaná JNK úzce souvisí s akteosidy zprostředkovanou supresí osteoklastogeneze stimulovanou RANKL.

Signalizace NF-kB reguluje buněčné děje, včetně apoptózy, progrese buněčného cyklu, buněčné adheze, produkce cytokinů a přežití v makrofázích [32]. Signalizace NF-kB je také nutná pro vývoj osteoklastů, což bylo prokázáno objevením se osteopetrózy u myší s knokautovaným NF-kB [33,34]. Proto je inhibice NF-kB navržena jako účinný cíl pro antiresorpční činidla pro down-regulaci aktivity osteoklastů a léčbu osteoporózy. Posttranslační modifikace proteinů podrodiny NF-kB je klíčová při modulaci aktivity NF-kB. Zejména fosforylace p65 podjednotky a IkB kinázy je kritická pro NF-kB k indukci osteoklastogeneze [7]. Naše současné poznatky ukázaly, že stimulace RANKL zvýšila DNA vazebnou aktivitu NF-kB a fosforylaci podjednotky p65 a IkBa v buňkách BMM i RAW264.7. Předběžné ošetření akteosidem inhibovalo tato zvýšení indukovaná RANKL, což vedlo ke snížení aktivity NF-kB. V důsledku toho tyto výsledky naznačují, že kromě MAPK je hlavním cílem akteosidu při inhibici diferenciace a tvorby osteoklastů z makrofágů stimulovaných RANKL signalizace NF-kB.

Kromě signalizace NF-kB hraje klíčovou roli ve vývoji osteoklastů dráha c-Fos/c-Jun/NFATc1, takže nedostatek některého z těchto proteinů může zastavit osteoklastogenezi [35,36]. V této studii jsme zjistili, že akteosid zabraňuje expresi c-Fos a NFATc1 indukované RANKL na úrovni mRNA a proteinu. JNK je upstream kináza c-Jun, která je nezbytná pro expresi NFATc1 a osteoklastogenezi v reakci na RANKL [29].

Blokování dráhy JNK/c-Jun nevyžádaným inhibitorem snížilo tvorbu osteoklastů indukovanou RANKL a expresi c-Fos a NFATc1 [7]. Naše výsledky a předchozí zjištění naznačují, že inhibice signalizace zprostředkované JNK akteosidem je úzce spojena s prevencí c-Fos a NFATc1 zprostředkovaných RANKLexprese, která potlačuje diferenciaci osteoklastů v makrofázích. Rozdíly v účincích akteosidů na BMM a RAW264.7 buňky jsou alespoň částečně způsobeny rozdíly v citlivosti na inhibici JNK.

TNF-a může indukovat osteoklastogenezi nezávisle na signalizaci RANKL-RANK [37]. IL-1 je účinným mediátorem patologické destrukce kosti vyvolané nedostatkem estrogenu nebo zánětem [7]. Narušení signalizace IL-1 receptoru typu I nebo IL{6}} může zvrátit úbytek kostní hmoty vyvolaný ovariektomií [38] nebo revmatoidní artritidou [39]. Tato studie prokázala schopnost akteosidu snižovat produkci zánětlivých cytokinů, jako je TNF-a, IL- 1b a IL-6 v makrofázích. Předpokládá se, že akteosid inhibuje produkci zánětlivých cytokinů potlačením p38 kinázy a signalizace ERK, protože pro lipopolysacharidy indukovanou produkci těchto cytokinů v makrofázích je nutná aktivace ERK1/2, p38 MAPK nebo obou [40,41]. Bylo také popsáno, že luteolin, zánětlivá sloučenina, potlačuje produkci zánětlivých mediátorů inhibicí aktivace p38 MAPK [42]. V této studii jsme také zjistili, že akteosid zmírnil ztrátu kostní hmoty u myší po ovariektomii, o čemž svědčí obnovená maximální lomová síla ve středním dříku pravého femuru a vymizení osteoporotické kortikální kosti. Orální podávání akteosidů snížilo ovariektomií indukované zvýšení hladin sérového IL-1b a IL-6, ale ne ALP. Zvýšené sérové ​​hladiny vápníku, TRAP a OC u OVX byly také inhibovány perorální léčbou akteosidem, což naznačuje, že akteosid zmírňuje alteraci biomarkerů specifických pro tvorbu kosti a také resorpci. Protože osteoporóza je charakterizována sníženou hustotou hmoty a zhoršenou mikroarchitekturou trabekulární kosti, OVX-indukovaný úbytek trabekulární kosti a změna morfometrických parametrů byly významně inhibovány orálním podáváním akteosidů. Tato zjištění naznačují, že akteosid může být použit jako antiresorpční činidlo k léčbě osteoporózy zvrácením nevyvážené aktivace osteoklastů. Osteoblasty jsou však primárním faktorem odpovědným za novotvorbu kosti. K posílení kostní tvorby je tedy zapotřebí činidlo schopné zvýšit proliferaci nebo diferenciaci osteoblastů [30]. Na rozdíl od toho jsme zjistili, že akteosid neovlivňuje diferenciaci nebo mineralizaci osteoblastů v buňkách kostní dřeně ošetřených DAG. Celkově naše výsledky naznačují, že akteosid má antiresorpční účinek, ale neovlivňuje přímo tvorbu kosti. K objasnění toho, zda akteosid prospívá osteoblastogenezi, jsou zapotřebí podrobnější experimenty analyzující parametry specifické pro kosti in vivo a in vitro.

Tato studie zdůrazňuje inhibiční účinek akteosidu na diferenciaci osteoklastů a kostní resorpci potlačením MAPK a několika transkripčních faktorů, jako jsou NF-kB, c-Fos a NFATc1. Údaje naznačují dva možné mechanismy, kterými má akteosid tyto výhody.

CISTANCHE ECHINACOSID A ACTEOSID LÉČIT osteoporózu

Reference

1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimunologie: interakce imunitního a kosterního systému. Molekuly a buňky 17: 1–9.

2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Kost a kostní dřeň: stejný orgán. Archives of Biochemistry Biophysics 503: 28–34.

3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporóza: nyní a budoucnost. Lancet 377: 1276–1287.

4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Kostní metastázy u rakoviny prostaty: objevující se terapeutické strategie. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.

5. Goltzman D (2002) Objevy, drogy a kosterní poruchy. Nature Reviews Drug Discovery 1: 784–796.

6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Terapeutické přístupy k onemocněním kostí. Science 289: 1508–1514.

7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H, et al. (2010) Epigalokatechin-3- galát inhibuje osteoklastogenezi snížením exprese c-Fos a potlačením signálu jaderného faktoru-kappaB. Molekulární farmakologie 77: 17–25.

8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K, et al. (2012) MS-275, inhibitor benzamid histondeacetylázy, zabraňuje osteoklastogenezi snížením exprese c-Fos a potlačuje ztrátu kostní hmoty u myší. European Journal of Pharmacology 691: 69–76.

9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, MaJY (2013) Antiosteoporotický účinek Yijung-tang v modelu krysy s ovariektomií zprostředkovaný inhibicí diferenciace osteoklastů. Journal of Ethnopharmacology 146: 83–89.

10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Rybí olej potlačuje kostní resorpci inhibicí osteoklastogeneze prostřednictvím snížené exprese M-CSF, PU.1, MITF a RANK u krys po ovariektomii. Molecular Medicine Reports 7: 1896–1903.

11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklast: vícejaderná osteoimunitní buňka, původem z krvetvorby, resorbující kost. Journal of Cellular Biochemistry 102: 1130–1139.

12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Regulační mechanismus osteoklastogeneze signály RANKL a Wnt. Frontiers in Bioscience 16: 21–30.