Část 2: Antifibrotický účinek 6-bromo-indirubinu-3 ′-oximu (6-BIO) prostřednictvím regulace aktivačního proteinu-1 (AP-1) a specificita proteinu-1 (SP-1) transkripční faktory v buňkách ledvin

Pro část 1 kliknětetady.

3.3. 6-BIO zeslabuje markery fibrózy a s fibrózou spojené signální dráhy v buňkách proximálního tubulu (HK-2) a intersticiálních fibroblastů (NRK49F)

Dále jsme potvrdili účinek 6-BIO na proximální tubulární buňky a intersticiální fibroblastové buňky. Pozorovali jsme koncentračně a časově závislou redukci exprese GSK3 mRNA pomocí 6-BIO v buňkách HK-2 a NRK49F (obr. S2A a B) a expresi zahrnutých proteinů souvisejících s ECM a EMT vledvinabuňkafibrózabyl také snížen (obr. S2E). Kromě toho se zvýšená exprese GSK3 po expozici těchto buněk TGF také snížila 6-BIO ošetřením (obr. S2C a D). Obr. 3 ukazuje proteinovou expresiledvinafibrózamarkery v buňkách HK-2 a NRK49F ošetřených TGF. Jak je znázorněno na obr. 3A, exprese proteinů PAI-1 a CTGF se významně zvýšila v reakci na léčbu 5 a 10 ng/ml TGF v buňkách HK-2 a NRK49F, v daném pořadí. Jejich exprese se však po léčbě 6-BIO výrazně snížila (obr. 3B).SMADa MAPK signální dráhy byly upregulovány léčbou TGF, což bylo zvráceno 6-BIO léčbou (obr. 4). Dále jsme zkoumali expresi AP-1 a SP-1 transkripčních faktorů zapojených do signalizace zprostředkované TGF v buňkách HK-2 a NRK49F. Obr. 4D ukazuje, že TGF-zprostředkované zvýšení PC-JUN a PC-FOS bylo sníženo v reakci na léčbu 6-BIO a JNK inhibitorem SP600125 a po dominantně negativní transfekci C-JUN. Obr. 4E ukazuje změnu intenzity proteinu vzhledem ke kontrole. Navíc zvýšení hladiny SP-1 zprostředkované TGF bylo významně zmírněno v reakci na léčbu siRNA 6-BIO a SP-1 (obr. 4F). Obr. 4G ukazuje změnu intenzity proteinu vzhledem ke kontrole. Tyto výsledky naznačují, že TGF /SMADa MAPK signalizace a také transkripční faktory, AP-1 a SP-1, jsou regulovány 6-BIO.

3.4. 6-BIO tlumí jadernou expresi PC-JUN, PC-FOS a SP-1 proteinů v buňkách proximálních tubulárních a intersticiálních fibroblastů

Obr. 5A a B ukazují lokalizaci PAI-1 a CTGF s PC-JUN, PC-FOS a SP-1. Červené barvení PC-JUN, PC-FOS a SP-1 ukázalo jejich nadměrnou expresi v jádře po léčbě TGF; podobně zelené barvení PAI{12}} a CTGF ukázalo jejich nadměrnou expresi v cytosolu. Hladiny exprese PC-JUN, PC-FOS a SP-1 však byly pomocí 6-BIO léčby sníženy. Tyto výsledky naznačují, že 6-BIO přímo ovlivňuje AP-1 a SP-1, transkripční faktory regulující expresi PAI-1 a CTGF.

3.5. 6-BIO tlumí aktivitu promotorů PAI-1, CTGF, AP-1 a SP-1 v buňkách proximálních tubulárních a intersticiálních fibroblastů

Dále jsme zkoumali, zda 6-BIO inhibuje promotorové aktivity genů PAI-1, CTGF, AP-1 a SP-1. Aktivita promotoru PAI-1 a CTGF se zvýšila v reakci na TGF, ale byla snížena 6-BIO léčbou (obr. 6A a B). Kromě toho byl pokles pozoruhodný, když byly buňky ošetřeny samotným 6-BIO než v přítomnosti TGF. AP-1 a SP-1 se vážou na propagátory PAI{10}} a CTGF. Obr. 6C a 6D ukazují aktivitu promotoru AP-1 a SP-1. Aktivita luciferázy AP-1 a SP{16}} byla zvýšena léčbou TGF a snížena 6-BIO v závislosti na dávce. Obr. 6E ukazuje expresi transkripčního faktoru v extraktech jaderných proteinů. Potvrdili jsme tedy, že jaderná exprese PC-JUN, PC-FOS a SP-1 se zvýšila v reakci na léčbu TGF a byla potlačena 6-BIO léčbou. Obr. 6F ukazuje změnu intenzity proteinu vzhledem ke kontrole. Naše výsledky navíc naznačují, že 6-BIO působí na vazebné místo transkripčního faktoru promotoru a oslabuje vazbu AP-1 a SP-1. Provedli jsme in vitro vazebný test promotoru v přítomnosti 6-BIO, abychom to potvrdili. Vazba jaderných proteinů a PC-JUN, PC-FOS a SP-1 byla oslabena přidáním 6-BIO způsobem závislým na koncentraci (doplňkový obr. 3). Tyto výsledky naznačují, že 6-BIO inhibuje aktivity promotorů PAI{40}} a CTGF a také funkce AP-1 a SP-1; tedy může mít terapeutický potenciál vledvinafibróza.

4. Diskuze

Použití krysího modelu ošetření UUO a TGFledvinaProkázali jsme, že 6-BIO léčba může zmírnitledvinapoškození. Model UUO je reprezentativní zvířecí model obstrukční nefropatie, která se vyznačuje progresivní tubulointersticiálnífibróza[43]. Histopatologická analýzaledvinatkáně získané z modelu UUO ukázaly, že akumulace ECM a tubulární atrofie v intersticiálním prostoru byly obnoveny 6-BIO léčbou. Navíc s použitím TGF-ošetřenéledvinabuňkách proximálních tubulů a intersticiálních fibroblastech jsme prokázali, že 6-BIO léčba může zeslabitledvinapoškození. V modelu UUO a buňkách HK-2 a NRK49F ošetřených TGF inhiboval 6-BIO expresiledvinafibrózamarkery a také MAPK aSMADsignální dráhy. Kromě toho 6-BIO léčba snížila expresi PC-JUN, PC-FOS a SP-1 proteinů indukovanou UUO a TGF, stejně jako jadernou expresi a promotorovou aktivitu AP{{6 }} a SP-1 v buňkách HK-2 a NRK49F ošetřených TGF- -. Inhibice transkripčních faktorů AP-1 a SP-1 pomocí 6-BIO léčby byla spojena s inhibicí akumulace ECM, která vede k exacerbaciledvinafibróza. Toho je dosaženo potlačením MAPK aSMADsignální dráhy, které vedou ke snížení exprese PAI-1 a CTGF. Naše výsledky naznačují, že 6-BIO může být potenciálním terapeutickým prostředkem protiledvinanemocí, tak i pro prevenciledvinaškody způsobené UUO a TGF .

Klikněte na organický Cistanche pro onemocnění ledvin

Polosyntetický pro buňky propustný indirubinový derivát 6-BIO patří do rodiny bis-indolů a přirozeně se vyskytuje v jedlých plžech a rostlinách [12]. Indirubin obsahuje intramolekulární vodíkovou vazbu mezi 2-C dvojnou vazbou O a N1-H skupinou a další intermolekulární vodíkovou vazbu mezi molekulami. 6-BIO má chemicky upravenou strukturu, ve které je pozice 6- substituována Br, aby se překonala nevýhoda špatných farmakokinetických vlastností způsobená nízkou rozpustností indirubinu ve vodě [44]. Mnoho indirubinů, kvůli kompetitivní vazbě s ATP, působí jako duální inhibitory cyklin-dependentní kinázy (CDK) a glykogensyntázy kinázy{{10}} (GSK-3), vykazují více než {{ 12}násobná selektivita oproti CDK5 [12]. Kromě toho 6-BIO vykazuje výrazně selektivní inhibici GSK-3 s hodnotou IC50 0,005 μM [12]. Podle zpráv několika skupin 6-BIO zcela inhibuje proliferaci buněk MCF{22}} a blokuje migraci přibližně o 75 procent při koncentraci 10 μM a inhibuje fosforylaci PDK1. To ukázalo, že 6-BIO byl vložen do vazebné kapsy PDK1 za vzniku tří vodíkových vazeb se zbytky v pantové oblasti a vazebná kapsa snadno pojala další atomy Br v 6-BIO [45]. S těmito vlastnostmi je 6-BIO studován jako nový lék na regulaci buněčných procesů, jako jsou záněty související se stárnutím, oxidační stres, přežití buněk, proliferace a apoptóza u rakoviny, cukrovky a degenerativních onemocnění [46,47 ]. Nicméně studie o genové regulaci a souvisejících molekulárních mechanismechledvinabuňkafibrózajsou vzácné. Proto jsme se snažili prozkoumat, zda 6-BIO oslabujeledvinafibrózainhibicí regulace genů PAI-1 a CTGF vledvinabuňky, čímž se snižuje akumulace ECM.

Několik studií použilo model UUO ke zjištění korelace mezi akumulací ECM a chronickouledvinaonemocnění způsobené tubulární intersticiálnífibróza[43]. Nadměrně exprimované PAI-1 a CTGF jsou navíc údajně spojeny s vysokou akumulací ECM během progrese chronickéledvinachoroba. Identifikace terapeutické molekuly, která inhibuje signalizaci a transkripci genů spojených se zvýšenou akumulací ECM, je tedy důležitá pro účinnou inhibiciledvinafibróza. Proto jsme v této studii hodnotili 6-BIO, jeden z inhibitorů glykogensyntázy kinázy 3 (GSK-3), vledvinafibróza.

Studovali jsme vliv proteinů PAI-1 a CTGF naledvinabuňkafibrózaa potvrdili, že jejich exprese byla regulována běžnými transkripčními faktory, AP-1 a SP-1. Transkripční faktor, AP-1, je heterodimer složený z proteinů patřících k JUN (C-JUN, JUNB a JUND), FOS (C-FOS, FOSB, Fra{5}} a Fra{ {6}}), ATF (aktivační transkripční faktor) a JDP (JUN dimerizační protein) rodiny [48]. Reguluje několik buněčných procesů, jako je buněčná proliferace, smrt,

diferenciace a vaskularizace. Dřívější studie uvádí, že aktivita AP-1 je zvýšena v játrech a plicích aktivací kolagenu typu VI a fibroblastů [49,50]. Dvě hlavní složky AP-1, C-JUN a C-FOS reagují na různé podněty, jako jsou cytokiny, růstové faktory a stres [51]. Pozorovali jsme zvýšenou fosforylaci C-JUN a C-FOS v UUO potkaním modelu a buňkách HK-2 a NRK49F ošetřených TGF (obr. 2D a 4D). C-JUN a C-FOS tvoří heterodimery a vážou se na vazebné místo AP-1 v DNA, čímž působí jako transkripční faktory pro regulaci exprese jiných genů. Kromě toho fosforylace ERK1/2 a JNK aktivuje C-FOS a C-JUN, v daném pořadí. V naší studii byla fosforylace ERK1/2 a JNK, stejně jako C-JUN a C-FOS v jádře, pozoruhodně zvýšená v reakci na léčbu TGF. 6-BIO léčba však tyto účinky významně zvrátila. Naše studie ukázala, že 6-BIO účinně inhibuje fosforylaci ERK1/2 a JNK a snižuje aktivitu transkripčního faktoru AP-1, čímž inhibuje fosforylaci C-JUN a C-FOS, které jsou jeho downstream efektory. SP-1 inhibice v jaterních astrocytech působí anantifibrotickýúčinek [52]. Jiná studie ukázala, že SP-1 hrál důležitou roli vfibróza[52,53]. Proto jsme hodnotili, zda 6-BIO může inhibovat transkripční faktor SP-1. Pozorovali jsme, že exprese SP-1 proteinu se zvýšila v reakci na léčbu TGF, stejně jako v modelu UUO, zatímco po 6-BIO léčbě se snížila. Navíc jaderná exprese SP-1 indukovaná TGF byla potlačena 6-BIO léčbou. V důsledku toho byly promotorové aktivity PAI-1 a CTGF, které mají vazebná místa AP-1 a SP{10}}, také sníženy působením 6-BIO (obr. 6 ). Tato zjištění tedy naznačují, že snížení promotorové aktivity PAI-1 a CTGF pomocí 6-BIO léčby snížilo expresi proteinu PAI{15}} a CTGF a snížilo akumulaci ECM, čímž se snížiloledvinabuňkafibróza.

5. Závěr

6-BIO léčba snížila expresi PAI{1}} a CTGF v modelu UUO a léčena TGFledvinabuňky. Kromě toho 6-BIO inhibovala aktivaci vyvolanou TGFSMADa MAPK signalizace a zároveň inhibuje aktivity AP-1 a SP-1, dvou z několika transkripčních faktorů, které se váží na promotory genů PAI-1 a CTGF. Inhibice AP-1 a SP-1 se zdá být jedním z klíčových mechanismů, kterými 6-BIO inhibujeledvinafibróza. Naše výsledky tedy naznačují, že 6-BIO může být potenciálním terapeutickým prostředkem protiledvinanemocí.

prohlášení o autorském příspěvku CRediT

Jung Sun Park: Konceptualizace, Metodika, Kurátorství dat, Psaní − příprava původního návrhu, Psaní − recenze a úpravy, Vizualizace, Získávání finančních prostředků. In Ae Jung: Kurátorství dat, psaní – recenze a úpravy. Hong Sang Choi: Správa dat, psaní – recenze a úpravy. Dong-Hyun Kim: Metodologie, zpracování dat. Hoon In Choi: Metodologie, Správa dat. Eun Hui Bae: Psaní – recenze a úpravy, supervize. Seong Kwon Ma: Psaní – recenze a úpravy,

6. Reference

Zdroj pochází od Jung Sun Park et, al na Biomedicine & Pharmacotherapy 145 (2022) 112402