Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls klikněte zde na část 2

Cistanche má velmi dobrý neuroprotektivní účinek

Gabriel Gonzalez 1,2 , Jiˇrí Grz 1, Cosimo Walter D'Acunto 1, Petr Ka ˇnovsk2 a Miroslav Strnad1,2,*

1. Laboratoř růstových regulátorů, Ústav experimentální botaniky AV ČR,

a Přírodovědecká fakulta Univerzity Palackého, Šlechtitel °u 27, CZ-78371 Olomouc, Česká republika;

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (G.G.); jiri.gruz@upol.cz (J.G.); waldacun@gmail.com (C.W.D.)

2. Neurologická klinika Fakultní nemocnice Olomouc a Lékařská fakulta,

Univerzita Palackého v Olomouci, CZ-775 20 Olomouc, Česká republika; Petr.Kanovsky@fnol.cz

* Korespondence: miroslav.strnad@upol.cz; Tel.: +420-585-634-850

Abstraktní:Cytokininyjsou fytohormony na bázi adeninu, které regulují klíčové procesy v rostlinách, jako je buněčné dělení a diferenciace, růst kořenů a výhonků, apikální dominance, větvení a klíčení semen. V předběžných studiích také prokázaly ochranné aktivity proti lidským neurodegenerativním onemocněním. Pro rozšíření znalostí o ochraně (ochranné činnosti), kterou nabízejí, jsme zkoumali činnost přírodníchcytokininyproti toxicitě vyvolané salsolinolem (a)Parkinsonova nemocmodel) a glutamátem (Glu)-indukovaná smrtneuron-jako dopaminergní SH-SY5Y buňky. Zjistili jsme, že kinetin-3-glukosid, cis-zeatin ribosid a N6-isopentenyladenosin byly aktivní v modelu PD indukovaném SAL. Navíc trans-, cis-zeatin a kinetin spolu s deferoxaminem železitým chelátorem (DFO) a inhibitorem nekroptózy nekrostatinem 1 (NEC-1) významně snížily míru buněčné úmrtnosti v modelu indukovaném Gluem. Testy laktátdehydrogenázy odhalily, žecytokininyza předpokladu, že nižšíneuroprotektivnínež DFO a NEC-1. Navíc snížily aktivity apoptotické kaspázy-3/7 méně silně než DFO. Nicméně,cytokininyměla velmi podobné účinky jako DFO a NEC-1 na produkci superoxidových radikálů. Celkově vykazovaly ochrannou aktivitu v modelu indukovaném SALparkinsonskáneuronovýbuněčná smrt a Glu-indukovaný model oxidačního poškození hlavně snížením oxidačního stresu.

Klíčová slova: cytokinin; fytohormon; neuroprotekce; neuronovité buňky SH-SY5Y; cytotoxicita; salsolinol; glutamát; oxidační stres; Parkinsonova nemoc

cistanche rostlinao účincích naNeuroprotekce

1. Úvod

Parkinsonova nemoc(PD) je druhým nejčastějším neurodegenerativním onemocněním souvisejícím s motorikou a očekává se, že počet celosvětově diagnostikovaných případů vzroste z 6 milionů v roce 2015 na více než 12 milionů do roku 2040 [1]. Je charakterizován motorickými příznaky spojenými se specifickou degenerací a ztrátou přibližně 30-70% dopaminergních (DA)neuronyv substantia nigra pars compacta a jejich výčnělky do striatu [2,3]. Některé z mnoha známých molekulárních charakteristických znaků PD zahrnují zvýšený oxidační a nitrosativní stres, mitochondriální dysfunkci [4–7], excitotoxicitu [8], dysfunkci ubikvitinu/proteazomálního systému [9] a neurozánět [10]. Současná léčba má různé nežádoucí vedlejší účinky a nabízí pouze symptomatickou úlevu [11], takže existuje intenzivní úsilí o vývoj léků s účinnými léčebnými účinky na degenerující DAneurony. Zdroje, které mohou pomoci takovému úsilí, zahrnují přírodní sloučeniny, které mají tendenci mít méně vedlejších účinků. Mimo jiné látky z Ginkgo biloba (ginkgetin, ginkgolid, bilobalid), ženšen (ginsenosidy) a flavonoidy (baicalein, kaempferol, rutin a luteolin) prokázaly širokou ochrannou aktivitu v několika in vitro modelech (včetně buněčné linie lidského neuroblastomu SH-SY5Y) a in vivo modelech PD indukovaných 1,1'-dimethyl-4,4'-bipyridinium dichloridem (parakvat), 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridinem (MPTP), 1-methyl-4-fenylpyridinium (MPP+), a 6-hydroxydopamin (6-OHDA) [12].

Zde prezentovaná studie se zaměřila na účinky třídy přírodních fytohormonů nazývanýchcytokininy(CK) a jejich metabolity, které jsou dobře známými regulátory buněčného dělení, růstu, diferenciace a stárnutí listů v rostlinách [13]. Strukturně jsou CK deriváty adeninu nahrazené v poloze N6 buď prenylem (isopentenylem) nebo aromatickým postranním řetězcem. Přírodní formy zahrnují 6-(E)-4-hydroxy-3-methyl but-2-enylaminopurin (trans- zeatin, tZ), jeho 6-(Z)-izomer (cis-zeatin, cZ), N6-isopentenyl adenin (iP), 6-benzyl amino purin (BAP), 6-furfurylaminopurin (kinetin, K) a orto-, meta- a para-hydroxylované nebo methoxylované deriváty BAP, nazývané topoliny (oT, mT, pT, MeoT, MemT, MepT). Různé 9-ribosidy, 9-nukleotidy, stejně jako 7-, 9 a O-glukosidy těchto forem se také běžně vyskytují, jak je uvedeno v tabulce 1. Kromě svých přirozených rolí v rostlinách prokázaly CK silnou aktivitu antoxidantů vůči reaktivním druhům kyslíku (ROS), která poskytuje ochranu v několika in vitro stresových modelech poruch spojených se stárnutím [14].

Tabulka 1. Strukturycytokininya látky pozitivní kontroly.

Zejména CK mají údajně cytoprotektivní aktivitu v modelech, jako je H2O2 indukovaná buněčná smrt lidských fibroblastů [15] a Glykoxidační stres indukovaný D-galaktózou v astrocytech potkanů [16]. Ještě důležitější je, že v této souvislosti ukázalineuroprotektivníúčinky v modelech souvisejících s neurodegenerativními onemocněními, jako je familiární PD, toxicita indukovaná inhibitorem proteazomu MG 132 nebo indukovaná H2O2 v buňkách SH-SY5Y [17], Gluem vyvolané oxidační poškození myšího hipokampu HT22neuronový[18] a PC12 buněčný model Huntingtonovy choroby [19]. Jiné studie naznačují, že ochranné aktivity CK zahrnují jak přímou [20,21], tak nepřímou [15,16,22] modulaci buněčných redoxních systémů. Kromě charakteristických antioxidačních aktivit CK mají údajně regulační účinky v mitochondriích, které zvyšujíneuronovýživotaschopnost [17]. Kromě toho může K stabilizovat potenciál mitochondriální membrány a zvýšit produkci ATP, čímž zmírňuje gluem indukovanou smrt buněk HT22 [18]. Navzdory zjištěním o jejich účincích v několika modelech však existují omezené znalosti o ochranné aktivitě CK v nejběžnější (sporadické) formě PD.

Abychom vyřešili výše popsanou mezeru ve znalostech, systematicky jsme hodnotili účinky přírodních CK a jejich metabolitů ve dvou in vitro modelech: Salsolinol (SAL)indukovaný model PD a glutamátem (Glu)indukovaný model oxidačního poškození uneuron-jako buňky SH-SY5Y. Tato linie byla použita kvůli dopaminergnímu fenotypu, citlivosti na dopaminergní toxiny, jako je SAL, a pohodlné tvorbě relativně stabilních populací diferencovanýchneuronovýbuňky se sníženou rychlostí proliferace po 48hodinové expozici 10 uM all-trans kyselině retinové (ATRA) [23–25].

Neuron-podobné buňky byly vystaveny endo/exotoxinu SAL, aby napodobily patologii PD prostřednictvím dysfunkce buněčného redoxního systému: Deplece glutathionu (GSH) a inhibice aktivit antioxidačních enzymů (Cu/Zn superoxiddismutáza a kataláza) a mitochondriálních komplexů (I a II), což vedlo k apoptóze a nekróze [26]. V druhém modelu Glu indukuje potenciálně smrtelné oxidační poškození narušením redoxního systému. Oba modely v buněčné linii SH-SY5Y byly dříve použity v neuroprotekčních studiích [26,27].

Cytoprotektivní a/nebo antioxidační aktivity související s degenerativními poruchami K, iP, BAP, iPR, tZR a jejich volných bází byly testovány a (jak je uvedeno výše) bylo zjištěno, že některé CK mají ochranné aktivity vneuronovýbuňky. Žádná dříve publikovaná studie však nezkoumala strukturuneuroprotektivnívztah aktivity (SAR) přirozených CK (tabulka 1). Proto byla tato studie provedena za účelem zkoumáníneuroprotektivní(proti-parkinsonská) aktivity téměř všech známých přirozeně se vyskytujících CK ve vybraných modelech neurodegenerace indukovaných SAL a Gluem. Nejprve jsme vyhodnotili schopnost absorbance kyslíkových radikálů (ORAC) a (v bezpečnostních testech) cytotoxicitu CK směrem kneuron-jako buňky SH-SY5Y. Poté jsme vyhodnotili neuroprotektivní účinky sloučenin a vliv na hladiny oxidačního stresu měřením produkce superoxidu (O2.) (dihy-droethidium, DHE test) a aktivit apoptotické kaspázy-3,7. Výsledky poskytují první hlášené systematické údaje o vztazích mezi strukturami přirozených CK aneuroprotektivníčinnosti.

Cistanche herbamá velmi dobrýneuroprotektivníefekt

2. Výsledky a diskuse

2.1 Schopnost absorbance kyslíkových radikálů cytokininů (ORAC)

Vzhledem k tomu, že neurodegenerativní onemocnění jsou spojena se zvýšeným oxidačním stresem, antioxidační aktivita hraje klíčovou roli v obraněneuronovýbuňky. Pro posouzení biologického potenciálu CK v tomto ohledu byla antioxidační kapacita určena ORAC, který se běžně používá k určení antioxidační kapacity látek [28]. Antioxidační kapacita byla vyjádřena jako ekvivalenty Trolox (TE), které určují účinnost (nižší až vyšší) sloučenin než Trolox na ekvimolární bázi. Výsledky uvedené v tabulce 1 ukazují, že topoliny (oT, mT a pT) a jejich ribosidy (oTR, mTR, pTR) mají vysokou antioxidační aktivitu, která pravděpodobně úzce souvisí se systémem bohatým na elektrony jejich C6-hydroxybenzyl amino substituentu. Navzdory vysokým hodnotám ORAC neměly topoliny vysokéneuroprotektivníaktivita. Nicméně několik heteroaromatických CK včetně K (N6-furfurylaminopurin) a nearomatického cis-zeatin-O-glukosidu (cZOG), který má 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl)aminosubituent, také vykazovalo vysokou antioxidační kapacitu (tabulka 2). Ostatní metabolity CK – včetně kinetin-3-glukosidu (K3G), kinetin ribosidu 5<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

cistanche kmenové výhodynaproti Alzheimerově chorobě

2.2. Diferenciace buněk SH-SY5Y

Studovat CK"neuroprotektivníneuroblastomové buňky SH-SY5Y (vybrané z již popsaných důvodů [23]) byly diferencovány expozicí 10 uM ATRA po dobu 48 hodin, jak bylo popsáno výše [23,24]. Poté byly obarveny pomocí membránové barvicí soupravy, aby se prozkoumaly morfologické rozdíly mezi nediferencovanými a diferencovanými buňkami. Jak je znázorněno na obrázku 1A,neuronDiferencované buňky rostly méně hustě, byly delší a produkovaly více neuritů (označených žlutými šipkami na obrázku) než nediferencované buňky. Tyto morfologické změny spojené s diferenciací byly pozorovány již dříve, a to i po kratší expozici (24 h) ATRA [24,30]. Ještě důležitější je, že počet neuritů dramaticky stoupá na úroveň, kdy mohou vytvořit neuritovou síť. Z tohoto důvodu byla měřena životaschopnost buněk za účelem porovnání rychlosti proliferace nediferencovaných a diferencovaných buněk SH-SY5Y. Životaschopnost nediferencovaného SH-SY5Y byla považována za maximální míru šíření. Výsledky uvedené v

Obrázek 1B ukazuje, že rychlost proliferace (hodnocená testem životaschopnosti Calcein AM) SH-SY5Y byla snížena o 23 % po 48hodinové léčbě ATRA.

Obrázek 1. (A) Fluorescenční mikrografy buněk SH-SY5Y s membránami obarvenými pomocí soupravy pro růst neuritu (Invitro-gen™): Kontrolní, nediferencované buňky (vystavené falešnému roztoku:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p=""><>

Tabulka 2. Kapacita absorpce kyslíkových radikálů (ORAC) testovanéhocytokininy(CK) vyjádřené jako ekvivalenty Trolox (TE) na ekvimolárním základě. Názvy, zkratky a struktury CK jsou znázorněny na obrázku 1.

2.3. Cytotoxicita cytokininů vůči neuronovitým buňkám SH-SY5Y

Při zkouškách potenciální cytotoxicity CK s testem životaschopnosti Calceinu AM [31] většina vykazovala nízkou toxicitu vůčineuron-jako buňky SH-SY5Y. Snížení životaschopnosti pod 90 % bylo považováno za prahovou hodnotu neurotoxického účinku. Jedinými dvěma výjimkami byly KR (11,9 %) a pTR (10,5 %), v souladu s předchozími zjištěními, že některéCytokininmetabolity, zejména ribosidy, mohou mít cytotoxické účinky [32]. Jiné ribosidy, jako cZR, iPR, oTR, mTR, nezpůsobily žádné zjevné sníženíneuron-jako životaschopnost buněk SH-SY5Y (tabulka 3). DFO [33,34] a NEC-1 [35,36] použité jako pozitivní kontroly v našem in vitro modelu byly také prokázány jinými studiemi na buňkách SH-SY5Y jako netoxické. Závěrem lze říci, že hlavně deriváty KR a pTR vykazovaly nižší životaschopnost než 90 %, a proto byly považovány za méně zajímavé pro další hodnocení v obou in vitro modelech neurodegenerace.

Tabulka 3. Životaschopnost buněkneuron-jako SH-SY5Y buňky po expozicicytokininypo dobu 24 hodin. Životaschopnost je vyjádřena jako procento kontroly DMSO.

2.4 Identifikace neuroprotektivních cytokininů v SAL indukovaném modelu PD

Pro tyto testyneuronovýBuňky SH-SY5Y byly diferencovány po dobu 48 hodin a poté společně ošetřeny 500 uM SAL a každým CK ve třech koncentracích (0,1, 1, 10 uM). Jak ukazuje tečkovaná čára na obrázku 2A, aplikace neurotoxinu SAL při 500 uM snížila životaschopnost diferencovaných buněk SH-SY5Y podle testu Calcein AM o 30%. N-acetylcystein (NAC) byl v těchto testech použit jako pozitivní kontrola kvůli jeho dříve hlášenému neuroprotektivnímu účinku ve stejném modelu in vitro založeném na buňkách SH-SY5Y [37]. Koncentrace 10, 100 a 1000 uM NAC byly použity k indukci částečného nebo téměř úplného zotavení v modelu SAL. NAC byl schopen zvýšit životaschopnost buněk při koncentraci 100 uM a 1 mM, což odpovídá 83,39 ± 1,74% a 89,21 ± 2,89%. Ochranná aktivita NAC při 100 uM (označená přerušovanou čarou na obrázku 2A) byla použita jako práh účinnosti pro výběr CK pro další testy. Podle tohoto nastavení byly biologicky významné neuroprotektivní aktivity pozorovány u K3G při 10 uM (81,84 ± 2,36%), cZR při 0,1 uM (81,14 ± 2,30%) a 1 uM (81,53 ± 2,24%) a iPR při 1 uM (82,43 ± 2,51%). IPR a cZR byly tedy účinnými neuroprotektivy při nižších mikro nebo submikromolárních koncentracích než NAC. TenCytokininScreening také ukázal, že mnoho dalších metabolitů může mírně zvýšit životaschopnost diferencovaných buněk SH-SY5Y vystavených SAL. Některé testované CK (včetně tZR, tZMP, mT, mTR, pT a pTR) však měly velmi malý ochranný účinek.

Obrázek 2. (A)Neuroprotektivníčinnostcytokininya N-acetylcystein (NAC) v SAL indukovaném modelu PD naneuron-jako buňky SH-SY5Y. Přerušovaná čára ukazuje prahovou hodnotu efektu NAC, při kterécytokininybyly vybrány pro další testování; tečkovaná čára pak počítá počet živých buněk v testu Calcein AM po ošetření buněk 500 uM SAL; zdravé kontrolní buňky (CTR, DMSO< 0.1%).="" triplicates="" in="" at="" least="" three="" separated="" days.="" (b)="" normalized="" sh-sy5y="" cell="" death="" after="" propidium="" iodide="" staining.="" triplicates="" in="" at="" least="" five="" independent="" days.="" *="" p="" compared="" with="" the="" vehicle="" with="" 500="" um="" sal,="" #="" p="" compared="" with="" the="" vehicle="" without="" 500="" um="">

Pro potvrzení nejaktivnějších přírodních aktivit CK proti PD byla celková míra buněčné úmrtnosti kvantifikována barvením jodidem propidia (PI), které (na rozdíl od testů životaschopnosti založených na buněčném metabolismu) označuje pouze buňky s narušenou integritou membrány, umírající buňky a již mrtvé buňky [38]. Výsledky byly normalizovány s ohledem na míru buněčné úmrtnosti po léčbě samotným SAL (nastaveno na 100 %). Jak je znázorněno na obrázku 2B, látka pozitivní kontroly NAC významně snížila míru buněčné úmrtnosti při 100 a 1000 uM (na 77,3 ± 2,21 % a 77,5 ± 4,44 %). Celkově se NAC ukázalo jakoneuroprotektivnílátka se srovnatelnými aktivitami zaznamenanými v jiných studiích v závislosti na dávce (v rozmezí 50–500 uM) pro buňky SH-SY5Y [37]. Test PI také ukázal, že CK cZR, K3G a iPR mají ochranné aktivity, zejména cZR, což snížilo míru buněčné úmrtnosti na 71,6 ± 5,08% při 0,1 uM. Na rozdíl od cZR měl K3G reverzní účinky závislé na dávce, s maximální aktivitou při 10 uM (snížení míry buněčné úmrtnosti na 75,0 ± 3,69%) a aktivita NPR dosáhla vrcholu na 1 uM (snížení rychlosti na 73,9 ± 4,99%). Celkově vzato, jak je znázorněno na obrázku 2, CK poskytly srovnatelnýneuroprotektivníaktivita na 100 uM NAC podle testů životaschopnosti i cytotoxicity. Účinné koncentrace CK, jako jsou cZR a iPR, byly navíc mnohem nižší než koncentrace NAC v submikromolárních a mikromolárních rozmezích. Předchozí pozorování získaná po dvojitém barvení PI a annexinem V/PI naznačují, že K může snížit apoptózu [39], proto jsme také zkoumali účinky CK a NAC na oxidační stres a aktivaci kaspázy-3,7 (dobře známý marker apoptózy).

2.5. Cytokininy snižují tvorbu superoxidových radikálů indukovanou SAL

Oxidační stres (OS) je klíčovým patologickým přispěvatelem k několika neurodegenerativním onemocněním a sal (při > 100 uM) i tetrahydroisochinoliny jsou silnými induktory OS [26,40]. Měřili jsme tedy také tvorbu superoxidu (ROS a důležitý OS marker) v přítomnosti SAL s a bez vybraných CK nebo NAC. Aby bylo zajištěno, že SAL způsobil dostatečné poškození OS v buňkách SH-SY5Y pro detekci odpovědí, byly buňky vystaveny 500 uM SAL po dobu 24 hodin, stejně jako v předchozí práci [37] a v souladu s výše uvedenými zjištěními. Buňky byly poté obarveny dihydroethidiem (DHE), aby se zjistila tvorba superoxidových radikálů [41,42]. Jak je vidět na obrázku 3A, buňky byly vizuálně pozorovány po označení DHE (který poskytuje červené fluorescenční signály po reakci se superoxidem). SAL vyvolala jasný nárůst fluorescence DHE ve srovnání s hladinami v kontrolních a NAC ošetřených buňkách. Navíc tři CK (cZR, K3G a iPR) měly podobné vizuální efekty jako NAC (100 uM) na fluorescenci DHE. Spektrofotometrická kvantifikace s ohledem na hladiny detekované v buňkách léčených samotným SAL (nastaveno na 100 %) byla navíc v souladu s mikroskopickým pozorováním. Jak je znázorněno na obrázku 3B, normalizovaná hladina superoxidu ve zdravých kontrolních buňkách (CTR) byla nižší než 39 % a pozitivní kontrolní látka NAC poskytla mírné až úplné snížení produkce ROS vyvolané SAL při 100 a 1000 uM (na 76,3 ± 4,33 a 44,3 ± 5,12 %), což naznačuje, že deplece glutathionu (GSH) hraje v modelu klíčovou roli [26]. Zajímavé je, že SAL vyvolal dramatické snížení obsahu GSH v buňkách SH-SY5Y doprovázené zvýšením OS na úrovně podobné těm, které byly dříve pozorovány ve studii, která také zaznamenala účinky zprostředkované NAC na životaschopnost buněk, buněčnou smrt a obsah glutathionu [43]. Zde prezentované výsledky ukazují, že NAC také snížil tvorbu superoxidových radikálů na bazální úrovně (tj. hladiny v kontrolách ošetřených DMSO). CK ribosidy byly testovány v aktivních koncentracích (0,1–1 uM) spolu s K3G a významně snížily obsah superoxidových radikálů v buňkách na následující úrovně (ve srovnání s úrovněmi buněk léčených samotným SAL): cZR 80,34 ± 5,99% při 0,1 uM; K3G 77.1 ± 4.89% při 10 uM; iPR 79,2 ± 5,91 % při 1 uM, což je srovnatelné s účinky 100 uM NAC. Souhrnně ortogonální demonstrace silně naznačují, že silná aktivita proti operačnímu systému hraje klíčovou roli v ochranných účincích NAC a CK v modelu PD indukovaném SAL. Korelace mezi zlepšením OS a neuroprotekcí byla také zaznamenána jinými autory [29] a několik studií zjistilo, že K a BAP mohou přímo zlepšit aktivity OS [44] prostřednictvím tvorby komplexů s ionty Cu2 +, což vede k aktivitě podobné superoxiddismutáze [45,46]. Nicméně, CK byly také popsány jako nepřímé antioxidanty s účinky zprostředkovanými indukcí nukleárního faktoru erytroidu 2-příbuzného faktoru 2 (NRF2) antioxidační odpovědi dráhy (iPR) [22] nebo částečné obnovení glutathionperoxidázy a SOD aktivit (K) [16]. Kromě toho K údajně máneuroprotektivníaktivity proti poškození OS vyvolanému H2O2 v buňkách SH-SY5Y [17]. Oba typy hlášené anti-ROS aktivity CK by mohly potenciálně vysvětlit účinky cZR, K3G a iPR při redukci superoxidových radikálů v SAL indukovaném MODELU SH-SY5Y buněk PD [47–50].

Obrázek 3. (A) Mikrofotografie ukazující oxidační stres vyvolaný SAL a aktivity snižující oxidační strescytokininyu člověka diferencovanéhoneuron-jako buňky SH-SY5Y vizualizované fluorescenční mikroskopií po dihydroethidiovém (DHE) značení. Bary = 50 um. Obrázky ukazují buňky ošetřené roztokem DMSO (kontroly), 500 uM salsolinol (SAL) sám a kombinace 500 uM SAL a 1000 uM NAC (+ NAC), 0,1 uM cZR (+cZR); 10 uM K3G (+K3G), 1uM iPR (+iPR) po dobu 24 hodin před barvením DHE. (B) Tvorba superoxidových radikálů vyvolaná SAL aCytokininnebo ochranná aktivita N-acetylcysteinu (NAC). Graf ukazuje kvantifikaci buněk obarvených DHE pomocí čtečky mikrodestiček Infinite M200 Pro (Tecan, Rakousko). Ztrojnásobuje za nejméně pět nezávislých dnů. * P ve srovnání s vozidlem s 500 uM SAL, # P ve srovnání s vozidlem bez 500 uM SAL.