Interference fenylethanoidových glykosidů z Cistanche Tubulosa s testem MTT

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yu-Jie Wang, Si-Min Zhou, Gang Xu a Yu-Qi Gao

Abstraktní:

Test MTT jako screeningová metoda se široce používá k měření životaschopnosti a proliferace buněk. Je však třeba poznamenat, že test MTT nemusí přesně odrážet účinekCistanche tubulosaethanolový extrakt na životaschopnost buněk EA.hy926. Aby bylo možné prozkoumat a identifikovat složky odpovědné za protichůdná pozorování testu MTT, echinakosid a akteosid, byly izolovány dva hlavní fenylethanoidní glykosidy z etanolového extraktu C. tubulosa. Data odvozená z testů CCK-8, Hoechst 33342 a annexin V-FITC/PI naznačují, že kofeoylová skupina přítomná v obou izolovaných sloučeninách byla zodpovědná za protichůdné výsledky testu MTT. Tato data zdůrazňují potřebu použití řady různých metod ke stanovení účinku léčivých látek na životaschopnost buněk, aby se zabránilo generování zavádějících výsledků.

Klíčová slova: MTT assay;fenylethanoidní glykosid; kyselina kávová; životaschopnost buněk; rušení

Úvod

Parazitická rostlinaCistanche tubulosa(Schrenk) R. Wight (čeleď Orobanchaceae) je široce rozšířen v severoafrických, arabských a asijských zemích [1]. Vychází zCistanche tubulosaaCistanche deserticolajsou důležité v tradiční čínské medicíně, protože se používají k léčbě impotence, sterility, lumbaga a zácpy v důsledku setrvačnosti tlustého střeva [2]. Navíc bylo prokázáno, že etanolový extrakt z Cistanche tubulosa má významný ochranný účinek proti mozkové hypoxii u myší [3].

Endoteliální buňky hrají klíčovou roli v patogenezi hypoxické plicní hypertenze. Endoteliální buněčná linie EA.hy926 je značně podobná primárním endoteliálním buňkám. Během naší vlastní studie antihypoxického účinkuCistanche tubulosaethanolického extraktu na endoteliální buňce EA.hy926 jsme si všimli, že 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) test, který se běžně používá k hodnocení životaschopnosti buněk ve studiích cytotoxicity a cytostatické aktivity, přinesl protichůdné výsledky tím, že ukázal zvýšenou životaschopnost buněk EA.hy926 po léčbě.

Přesné posouzení buněčné životaschopnosti je nezbytné pro identifikaci potenciálních cytotoxických nebo cytoprotektivních účinků léčivého činidla. Zkoumali jsme proto, které složky přítomné v etanolovém extraktu C. tubulosa mohou být zodpovědné za protichůdné výsledky pozorované u testu MTT. Z ethanolového extraktu C. tubulosa jsme izolovali dva hlavní fenylethanoidové glykosidy (PhGs), echinakosid (dále sloučenina 1) a akteosid (dále sloučenina 2), a stanovili jsme jejich účinek na životaschopnost buněk EA.hy926 pomocí různých metod. Kromě toho, abychom dále objasnili, který substituent sloučenin 1 a 2 může být zodpovědný za protichůdné výsledky, testovali jsme jejich aglykony, kyselinu kávovou (dále sloučenina 3) a 3,4-dihydroxylfenylethanol (dále sloučenina 4), na životaschopnost buněk EA.hy926 za použití stejných metod.

Výsledky a diskuse

Identifikace sloučenin

Struktury dvou sloučenin izolovaných z ethanolového extraktu C. tubulosa byly identifikovány analýzou nukleární magnetické rezonance (NMR) a hmotnostní spektrometrií (MS) a jsou znázorněny na obrázku 1. Sloučenina 1 byla identifikována jako echinakosid porovnáním s dříve uvedenou NMR (tabulka 1) a MS (m/z 785 [M-H]-) data [4]. NMR spektra sloučeniny 2 byla vysoce podobná spektrům sloučeniny 1, s výjimkou nepřítomnosti -D-glukopyranosylové skupiny (tabulka 1). Sloučenina 2 (m/z 623 [M-H]-) byla identifikována jako akteosid [5]. Důležité je, že obě sloučeniny mají stejný aglykon, který zahrnuje kyselinu kávovou (sloučenina 3) a 3,4-dihydroxylfenylethanol (sloučenina 4).

Testy buněčné životaschopnosti

K analýze účinku sloučenin 1–4 na životaschopnost buněk EA.hy926 byly použity testy MTT a CCK{{0}}. Test MTT ukázal, že životaschopnost buněk EA.hy926 se významně zvýšila po ošetření 25 a 50 μM sloučeninou 1, 2 nebo 3 (166,3 procenta a 174,1 procenta pro sloučeninu 1, 205,8 procenta a 224,3 procenta pro sloučeninu 2 a 164,8 procenta a 189,6 procenta pro sloučeninu 3, v tomto pořadí, p < 0,05),="" ve="" srovnání="" s="" kontrolními="" buňkami="" (obrázek="" 2a).="" morfologická="" kontrola="" buněk="" dále="" určila,="" že="" ošetření="" 50="" μm="" sloučeninou="" 1,="" 2="" nebo="" 3="" zvýšilo="" tvorbu="" fialových="" krystalů="" formazanu,="" které="" jsou="" považovány="" za="" přímý="" údaj="" o="" podílu="" živých="" buněk="" (obrázek="" 3).="" naopak="" test="" cck-8="" naznačil,="" že="" životaschopnost="" buněk="" se="" významně="" snížila="" po="" ošetření="" 12,5,="" 25="" a="" 50="" um="" sloučeninou="" 1,="" 2="" nebo="" 3="" (75,5="" procenta,="" 45,1="" procenta="" a="" 43,7="" procenta="" pro="" sloučeninu="" 1,="" 85,5="" procenta,="" 51,8="" procenta="" a="" 34,3="" procenta="" pro="" sloučeninu="" 2="" a="" 64,5="" procenta,="" 48,2="" procenta="" a="" 36,4="" procenta="" pro="" sloučeninu="" 3,="" v="" tomto="" pořadí;="" p="">< 0,05),="" ve="" srovnání="" s="" kontrolními="" buňkami="" (obrázek="" 2b).="" sloučenina="" 4="" neovlivnila="" životaschopnost="" buněk="" v="" testu="" mtt="" ani="" cck-8.="" nesoulad="" mezi="" výsledky="" získanými="" s="" těmito="" dvěma="" testy="" naznačuje,="" že="" jeden="" ze="" dvou="" testů="" nemusí="" přesně="" odrážet="" účinky="" sloučenin="" 1="" a="" 2="" na="" životaschopnost="" buněk="">

Hodnocení apoptózy barvením Hoechst

Hoechst 33342 je buněčně propustné barvivo DNA, které je excitováno ultrafialovým světlem a emituje modrou fluorescenci při 460 až 490 nm. Kondenzovaný chromatin apoptotických buněk se barví jasněji než chromatin normálních buněk [6]. Zatímco kontrolní buňky vykazovaly rovnoměrně rozptýlený chromatin, normální organely a neporušené buněčné membrány, buňky inkubované s 50 uM sloučeninami 1, 2 nebo 3 po dobu 48 hodin vykazovaly typické barvení apoptotických buněk (obrázek 4A). Naopak expozice buněk 50 uM sloučeniny 4 nezvýšila počet apoptotických jader ve srovnání s kontrolním ošetřením.

Průtoková cytometrická analýza apoptotických buněk

Test dvojitého barvení annexinem V-FITC/PI identifikuje apoptotické buňky vysokoafinitní vazbou annexinu V-FITC k fosfatidylserinu, který je externalizován v buňkách procházejících apoptózou [7]. V tomto testu se životaschopné buňky nevážou ani na annexin V ani PI, a proto nejsou obarveny (levý dolní kvadrant), časné apoptotické buňky jsou obarveny zeleně vazbou annexinu V-FITC (pravý dolní kvadrant) a pozdní apoptotické buňky jsou obarveny zeleně a červeně vazbou annexinu V-FITC na fosfatidylserin a PI na nekrotické buňky, v daném pořadí (horní pravý kvadrant). Jak je znázorněno na obrázku 4B, buňky inkubované s 50 uM sloučeninami 1, 2 nebo 3 po dobu 48 hodin se procento apoptotických buněk zvýšilo z 3,74 procent (kontrolní buňky) na 10,32 procent, 12,95 procent a 11,30 procent, v tomto pořadí. Ve srovnání s kontrolními buňkami sloučenina 4 nezvýšila procento apoptotických buněk EA.hy926.

V souladu s výsledky získanými pomocí testu CCK{0}} a barvením Hoechst 33342 test průtokové cytometrie ukázal, že sloučeniny 1, 2 a 3 indukovaly apoptózu v buňkách EA.hy926. Celkově tato pozorování naznačují, že zvýšení viability buněk EA.hy926 pozorované pomocí testu MTT po léčbě sloučeninami 1–3 představovalo falešně pozitivní výsledek.

Diskuse

V roce 1983 vyvinul Mosmann kolorimetrický test MTT na mikrotitračních destičkách pro měření buněčné proliferace a cytotoxicity [8]. Tento jednoduchý test a jeho modifikace se nyní široce používají v laboratořích buněčné biologie po celém světě. Frakční studie na savčích buňkách ukázaly, že redukovaný pyridinový nukleotidový kofaktor, NADH, je zodpovědný za většinu snížení MTT. To bylo podpořeno studiemi využívajícími celé buňky [9]. Snížení MTT je tedy spojeno s metabolicky aktivními buňkami a není spojeno pouze s mitochondriální respirací, ale také s cytoplazmou a nemitochondriálními membránami včetně kompartmentu endozom/lysozom a plazmatické membrány [10]. Čistý kladný náboj na molekule MTT je primárním faktorem pro její buněčnou absorpci prostřednictvím potenciálu plazmatické membrány.

Je pozoruhodné, že test MTT nemusí občas přesně odrážet skutečný účinek, který má testovaná sloučenina na specifické buňky. Chemické struktury nebo skupiny, které mohou způsobit konfliktní výsledky v testu MTT, však nebyly identifikovány. Nedávné studie ukázaly, že test MTT by mohl podcenit antiproliferativní účinek (−)-epigalokatechin-3-galátu, nejhojnějšího polyfenolu v zeleném čaji [11]. Ve studiích využívajících MTT test k detekci chemosenzitivity nádoru prokázala protirakovinná chemoterapeutika, jako je epirubicin, paklitaxel, docetaxel a imatinib mesylát (Gleevec), zvýšenou životaschopnost buněk [12,13]. Řada studií navíc uvádí, že určité rostlinné extrakty a redox-aktivní polyfenoly by mohly interferovat s testem MTT, protože přímo redukují tetrazoliovou sůl MTT v nepřítomnosti buněk [14].

Potřeba solubilizovat MTT formazanové krystaly před spektrofotometrickou analýzou ve čtečce mikrodestiček a inherentní koncová povaha reakce omezují použití MTT testu na určité aplikace. To vedlo k vývoji tetrazoliových analogů, ve kterých byly fenylové části zdobeny záporně nabitými sulfonátovými skupinami, jako je 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro- 5- sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxamid (XTT), záporně nabitá vnitřní sůl [15] a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5-(3-karboxymethoxyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS), slabě kyselá vnitřní sůl blízce příbuzná MTT [16] . Tyto modifikace vedly k produkci formazanových produktů rozpustných v kultivačním médiu, které eliminovaly požadavek solubilizačního kroku před kvantifikací. V souladu s tím, protože zvýšený záporný náboj na těchto molekulách snižoval jejich schopnost pohybovat se přes buněčné membrány [17], intermediální akceptory elektronů (IEA), jako je 1-methoxy-5-methylfenazinium methylsulfát ({{25 }}methoxy PMS) byly požadovány pro usnadnění redukce tetrazolového barviva nebo pro zvýšení rychlosti redukce.

Nedávno byla vyvinuta nová generace ve vodě rozpustných tetrazoliových solí, jejichž prototypem je WST-1 [18]. WST-1, záporně nabitá disulfonovaná vnitřní sůl obsahující zbytek jódu, je stabilnější než XTT a MTS v přítomnosti 1-methoxy PMS, což je jeho povinná IEA. To vedlo k marketingu WST-1/1-methoxy PMS jako praktické soupravy pro proliferaci buněk s jedním činidlem. Bylo vyvinuto několik dalších tetrazoliových solí ze série WST, z nichž nejužitečnější je pravděpodobně WST-8 [19]. Zdá se, že WST-8 má velmi podobné vlastnosti buněčné redukce jako WST-1 a je prodáván nezávisle jako test CCK{11}}. WST-8 je pro buňky nepropustná, a proto je redukována extracelulárně, prostřednictvím transportu elektronů z intracelulárního NADH do WST-8 přes plazmatickou membránu zprostředkovaného 1-methoxy PMS. Ačkoli snížení MTT i WST-8/1-methoxy PMS je řízeno intracelulárním NADH, zdá se, že zdroj NADH se v rámci těchto dvou metod liší. Snížení WST-8/1-methoxy PMS je více závislé na malátově/aspartátovém raketoplánu, který spojuje mitochondriální cyklus trikarboxylové kyseliny-NADH s extramitochondriálním prostorem [20].

V předběžných experimentech jsme potvrdili, že sloučeniny 1, 2, 3 a 4 nemohly přímo redukovat MTT tetrazoliovou sůl (nezobrazeno). V této studii byl přímý vliv samotných sloučenin s činidlem eliminován pečlivým promytím mikrodestiček fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) před přidáním roztoku MTT nebo CCK-8, jak je uvedeno v protokolech výrobce. Nicméně výsledky získané pomocí těchto dvou metod byly stále protichůdné (obrázek 2). Jak se očekávalo, inkubace buněk se sloučeninami 1, 2 a 3 zvýšila redukci tetrazoliové soli na purpurový formazan ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 3), což naznačuje, že pouhá redukce tetrazoliové soli v přítomnosti specifické sloučeniny není dostatečná k posouzení schopnosti sloučeniny interferovat s MTT testem.

Aby se určilo, zda sloučeniny 1, 2, 3 a 4 mohou indukovat apoptózu v buňkách EA.hy926, byly hodnoceny buněčné morfologické změny a externalizace fosfatidylserinu. V souladu s poklesem buněčné životaschopnosti pozorovaným u testu CCK-8 výsledky Hoechstova barvení a analýzy průtokové cytometrie pomocí annexinu V-FITC/PI naznačovaly, že inhibice růstu pozorovaná po ošetření sloučeninou 1, 2 a 3 byla alespoň částečně kvůli apoptóze buněk EA.hy926. Naše výsledky také podpořily myšlenku, že kafeoylová skupina přítomná ve sloučeninách 1 a 2 byla zodpovědná za protichůdné výsledky získané pomocí MTT testu.

Podobně jako u našich zjištění, Rottlerin, silný otvírač draslíkových kanálů s velkou vodivostí, nevykazoval in vitro reaktivitu vůči MTT. Silně však zesílil tvorbu krystalů formazanu uvnitř buněk, což byl výsledek, který byl v evidentním rozporu s inhibicí NF-κB Rottlerinem a buněčnou proliferací pozorovanou analýzou inkorporace [3H]-thymidinu do DNA [21]. Mechanismus, kterým Rottlerin zvýšil redukci MTT, byl přisuzován jeho mitochondriálnímu uncoupling efektu [22]. Rottlerin má substituční skupinu cinnamoylové kyseliny. Ve srovnání se cinnamoylovou kyselinou má sloučenina 3 další dva hydroxylové zbytky, které se nacházejí na C-3 a C-4. Proto spekulujeme, že mechanismus, kterým sloučeniny 1 a 2 způsobují konfliktní výsledky v testu MTT, může být také spojen s jejich mitochondriálními odpojovacími účinky. K testování této hypotézy jsou zapotřebí srovnávací studie mezi sloučeninami 1, 2 a chemickým odpojovačem, jako je trifluorkarbonylkyanidfenylhydrazon (FCCP).

experimentální sekce

Činidla a chemikálie

Sloučenina 3 (kyselina kávová – prášek, čistota=98,6 procent) byla zakoupena od společnosti Chengdu Push Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Čína). Sloučenina 4 (3,4-dihydroxylfenylethanol–olej, čistota=98,5 procenta) byla získána od společnosti Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Čína). MTT a dimethylsulfoxid (DMSO) byly získány od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Test CCK{11}} byl zakoupen od Dojin Laboratories (Kumamoto, Japonsko). Hoechst 33342 a soupravy pro detekci apoptózy annexin V-FITC/PI byly zakoupeny od Beyotime Institute of Biotechnology (Haimen, Čína)

Přírodní materiál

Stonky C. tubulosa byly odebrány z prefektury Yutian, Ujgurská autonomní oblast Xinjiang, Čína. Poukazové vzorky byly uloženy v Key Laboratory of High Altitude Medicine, Third Military Medical University (Chongqing, Čína) a ověřeny Yi Zhangem z Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Chengdu, Čína)

Extrakce a izolace rostlinného materiálu

Na vzduchu sušené stonky C. tubulosa (0,6 kg) byly rozdrceny na prášek a extrahovány 50procentním ethanolem po dobu 2 hodin při 70 stupních. Po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku byl ethanolový extrakt (212,5 g) rozpuštěn a suspendován ve vodě (2 1) a extrahován n-butanolem (2 1 x 3). N-butanolový extrakt (110 g) byl chromatografován na polyamidové koloně a eluován směsí ethanol/voda (0:100, 5:95, 15:85, 30:70, 50:50) za vzniku pěti frakcí (A–E) . Frakce B (65 g) byla frakcionována na ODS koloně; elucí směsí ethanol:voda (1:9) se oddělí sloučenina 1 (3 g). Frakce D (10,5 g) byla frakcionována na ODS koloně; elucí směsí ethanol/voda (1:4) se oddělí sloučenina 2 (1 g).

NMR spektra byla zaznamenána na spektrometru Bruker Avance 600 v CD3OD s tetramethylsilanem (TMS) jako vnitřním standardem. Hmotnostní spektra byla změřena na hmotnostním spektrometru BioTOF-Q.

Buněčná kultura

Buněčné linie EA.hy926 byly získány z American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Buňky byly kultivovány v médiu RPMI 1640 doplněném 10 procenty (obj./obj.) fetálním bovinním sérem a 1 procentem (obj./obj.) penicilin-streptomycinem ve zvlhčeném prostředí s 5 procenty CO2 při 37 stupních.

Životaschopnost buněk

Životaschopnost buněk byla hodnocena pomocí testů MTT a CCK {{0}}. Sloučeniny 1 a 2 a jejich aglykony, kyselina kávová (3) a 3, 4-dihydroxylfenylethanol (4) byly rozpuštěny v DMSO na konečnou koncentraci DMSO < 0,1="" procenta="" (v/v)="" v="" kultivačním="">

Buňky EA.hy926 byly nasazeny na 96-jamkové destičky v množství 4 x 103 buněk/jamku. Po inkubaci po dobu 24 hodin byly buňky ošetřeny 6, 25–50 uM sloučeniny 1, 2, 3 nebo 4 po dobu 24 hodin. Kultivační médium bylo odstraněno a buňky byly dvakrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Alikvoty (10 μl) zásobního roztoku MTT (5 mg·ml−1 ) byly přidány do každé jamky obsahující 100 μl média a inkubovány s buňkami po dobu 4 hodin. Po inkubaci bylo médium odstraněno a do každé jamky byly přidány 150 ul alikvoty DMSO, aby se rozpustily krystaly formazanu. Absorbance byla měřena při 490 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Bio-Tek Synergy HT, Winooski, VT, USA). Životaschopnost buněk byla vyjádřena jako procento snížení MTT, přičemž 100procentní hodnota byla přiřazena absorbanci kontrolních buněk. Všechny experimenty byly provedeny třikrát a prezentovány jako průměr ± standardní odchylka (SD).

Stanovení CCK-8 bylo provedeno podle literatury s mírnými úpravami [23]. Konkrétně byly buňky ošetřeny 6,25–50 μM sloučeninami 1, 2, 3 nebo 4 po dobu 24 hodin a dvakrát promyty PBS před přidáním 10 μl roztoku CCK-8 a 100 μl kultivačního média. Po inkubaci mikrodestičky při 37 stupních po dobu 2 hodin byla měřena absorbance při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Životaschopnost buněk byla vyjádřena jako procento životaschopných buněk vzhledem ke kontrolním buňkám (100 procent). Všechny experimenty byly provedeny třikrát a vyjádřeny jako průměr ± SD.

Hodnocení apoptózy pomocí barvení Hoechst 33342

Apoptotické morfologické změny byly pozorovány barvením Hoechst 33342. Stručně, buňky EA.hy926 byly nasazeny na 48-jamkové destičky (2 x 104 buněk/jamka) a ošetřeny 50 uM sloučeninou 1, 2, 3 nebo 4 po dobu 48 hodin při 37 stupních, dvakrát promyty PBS, a fixována 4 % (obj./obj.) paraformaldehydem po dobu 15 minut při teplotě místnosti. Po dvojnásobném promytí PBS byly buňky obarveny Hoechst 33342 (10 ug.ml-1) po dobu 5 minut při teplotě místnosti a dvakrát promyty PBS. Hoechstově obarvená jádra byla vizualizována pomocí fluorescenčního mikroskopu (Olympus, Tokio, Japonsko).

Analýza apoptózy průtokovou cytometrií

Apoptotické buňky byly detekovány pomocí annexinu V-FITC/PI dvojitým barvením a analýzou průtokovou cytometrií. Stručně řečeno, po ošetření 50 uM sloučeninou 1, 2, 3 nebo 4 po dobu 48 hodin byly buňky sklizeny a resuspendovány v PBS na 1 x 105 buněk · ml-1. Po centrifugaci při 500 x g po dobu 5 minut při 25 stupních bylo přidáno 195 ul vazebného pufru pro annexin V-FITC a 5 ul pro annexin V-FITC. Po jemném vortexovém míchání byla směs inkubována po dobu 10 minut při teplotě místnosti ve tmě. Po centrifugaci při 500 x g po dobu 5 minut při 25 stupních bylo přidáno 190 ul vazebného pufru pro annexin V konjugovaný s FITC a 10 ul PI. Po jemném vortexovém míchání byly vzorky analyzovány pomocí FACSCalibur Flow Cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) během 30 minut.

Statistická analýza

Všechna experimentální data byla vyjádřena jako průměr ± SD. Významnost rozdílů mezi experimentálními vzorky a odpovídající kontrolou byla hodnocena jednocestnou analýzou rozptylu (ANOVA) pomocí softwaru SPSS (verze 11.5). Statistická významnost byla stanovena na p <>

Závěry

Naše výsledky naznačují, že nadhodnocení počtu životaschopných buněk pozorované v testu MTT by mohlo maskovat cytotoxicitu určitých sloučenin. Proto během procesů screeningu léků doporučujeme používat různé metody ke stanovení účinku konkrétní sloučeniny na životaschopnost buněk (jako jsou testy CCK{0}} a 3H-TdR), aby nedocházelo ke generování zavádějících výsledků.