Část 1 Preventivní účinky fenylethanolových glykosidů z Cistanche Tubulosa na albuminem indukovanou jaterní fibrózu u krys.

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Abstraktní

Pozadí:Cistanche tubulosa je tradiční čínská bylinná medicína, která se široce používá k regulaci imunity.Fenylethanolglykosidy z cistanche(CPhG) z tohoto závodu jsou primárně účinné materiály. Cílem této studie bylo vyhodnotit preventivní a terapeutické účinky CPhG na jaterní fibrózu indukovanou BSA u potkanů ​​a související molekulární mechanismy zahrnující jaterní hvězdicové buňky. Biejiarangan (BJRG), další tradiční čínský bylinný lék, byl použit jako pozitivní kontrola. Metody: V experimentech in vivo bylo 75 SD potkanů ​​náhodně rozděleno do 6 skupin: normální (ošetřené destilovanou vodou), modelové (ošetřené BSA), pozitivní léčivo (ošetřené BSA plus BJRG 60{{29} } mg/kg/den) a skupiny léčené BSA plus CPhG (125, 250 a 500 mg/kg/den). Indexy jater a sleziny, sérové ​​hladiny aspartátaminotransferázy (AST), alaninaminotransferázy (ALT), kyseliny hexadecenové (HA), lamininu (LN), prokolagenu typu III (PCIII), kolagenu typu IV (IV-C), hydroxyprolinu ( Hyp) a transformující růstový faktor 1 (TGF- 1) byly měřeny v krysích játrech. Histopatologické stupně jaterní fibrózy byly hodnoceny pro každou skupinu pomocí H&E a Massonova trichromového barvení. Exprese TGF- 1, kolagenu I (Col-I) a kolagenu III (Col-III) byla stanovena metodou imunohistochemického barvení. Tyto účinky byly dále hodnoceny in vitro stanovením úrovní exprese NF-KB p65 a Col-I pomocí kvantitativních PCR analýz v reálném čase. Exprese Col-I proteinu byla také zkoumána westernovým přenosem. Výsledky: Všechny dávkové skupiny (125, 250 a 500 mg/kg/den) CPhG významně snížily index jater a sleziny, snížily sérové ​​hladiny ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C, obsah TGF- 1 (P < 0,01,="" p="">< 0,01="" a="" p="">< 0,01)="" a="" obsah="" hyp.="" cphg="" také="" výrazně="" zmírnily="" otok="" jaterních="" buněk="" a="" účinně="" zabraňovaly="" nekróze="" hepatocytů="" a="" infiltraci="" zánětlivých="" buněk.="" imunohistochemické="" výsledky="" ukázaly,="" že="" cphg="" významně="" snížily="" expresi="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" a="" p="">< 0,01),="" col-i="" a="" col-iii.="" in="" vitro="" účinky="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" a="" 25="" ug/ml)="" na="" hsc-t6="" ukázaly,="" že="" cphg="" významně="" snížily="" expresi="" mrna="" nf-kb="" p65="" a="" col-i="" a="" cphg="" také="" snížily="" expresi="" proteinu="" col-i.="" závěry:="" cphg="" mají="" významný="" účinek="" proti="" jaterní="" fibróze="" a="" mohou="" být="" použity="" jako="" hepatoprotektivní="" činidla="" pro="" léčbu="" jaterní="">

Klíčová slova: Jaterní fibróza, Cistanche tubulosa, Phenylethanol glykosid, Chemokine BSA, Prevence a terapie.

Pozadí

Jaterní fibróza je reakce hojení ran na vážné poškození jater, které se vyskytuje v patogenezi chronické hepatitidy vyvolané různými faktory. Těmito faktory jsou virová infekce, abúzus alkoholu, cholestáza a metabolická a autoimunitní onemocnění [1–3]. Progresivní akumulace extracelulární matrix (ECM) a snížená remodelace narušují normální architekturu jater, což vede k jaterní fibróze [4]. Jaterní fibróza je kritická u chronického onemocnění jater a často se vyvine do ireverzibilní cirhózy a karcinogeneze. V současné době neexistují žádné metody ani účinné léky pro léčbu jaterní fibrózy. Proto je naléhavé najít lék proti jaterní fibróze, který zmírní progresi poškození jater k fibróze a rakovině.Cistanche tubulosaW (z čeledi Orobanchaceae) je parazitická rostlina, která se hojně pěstuje v jižní oblasti Xinjiang v Číně [5]. Lidé jej obvykle používají k povzbuzení ledvin, výživě krve, uvolnění střev a oddálení stárnutí. Je oficiálně uveden v čínském lékopisu [6]. C. tubulosa obsahuje různé aktivní složky. Tyto zahrnujíFenylethanolglykosidy z cistanche(CPhG), iridoidy a polysacharidy. Jako jedna z mnoha aktivních složek vC. tubulosaCPhG prokázaly přesvědčivé antioxidační, protiúnavové, neuroprotektivní a protizánětlivé účinky ve studiích in vivo i in vitro [7]. V posledních letech bylo hlášeno, že CPhGs(Fenylethanolglykosidy z cistanche) mají hepatoprotektivní účinky. Potenciální mechanismy, které jsou základem těchto účinků, jsou vychytávání volných radikálů, ochrana jaterních membrán, imunoregulace, inhibice apoptózy, inhibice exprese HBsAg a HBeAg a inhibice replikace HBV DNA a další [8–11]. Nicméně jen málo studií v literatuře se zabývá účinkem grafiky proti jaterní fibróze. Proto se tato studie zaměřovala na zkoumání účinku GPhC proti jaterní fibróze pomocí modelu jaterní fibrózy u potkanů ​​indukované hovězím sérovým albuminem (BSA). Související molekulární mechanismy byly zkoumány v buňkách HSC-T6.

Metody

Chemikálie a činidla

Hydroxyprolinová souprava (alkalická hydrolýza) (šarže: 20140616) byla zakoupena od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Čína). Krysí TGF- 1 sendvičové soupravy ELISA (šarže: 238240615) byly zakoupeny od Lianke Biotech Co., Ltd. (Čína). Králičí protilátka proti kolagenu I (šarže: 140619), králičí protilátka proti kolagenu III (šarže: 980788 W) a králičí protilátka proti TGF- 1 (šarže: 140619) poskytla společnost Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (Čína). Uzavřené s normálním ovčím sérem (pracovní tekutina) (šarže: WP141214), PV-6000 (šarže: WK141225) a souprava DAB (šarže: K136621D) byly zakoupeny od společnosti Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Čína) . Detekce primárních protilátek byla provedena pomocí 2. roztoku protilátky (Alk-Phos. konjugovaný, anti-králičí) a 2. roztoku protilátky (Alk-Phos. konjugovaný, anti-myš) (šarže: 272387) zakoupeného od Invitrogen Company (USA ). Bovinní sérový albumin (BSA) (šarže: SLBG8239V) byl zakoupen od Sigma (USA). Před použitím byl BSA připraven v koncentraci 18 g/l v normálním fyziologickém roztoku, bakterie byly odstraněny filtrací a BSA skladován při 4 stupních. Freundovo nekompletní adjuvans obsahující 1 g lipidu z ovčích chlupů (šarže: AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Čína,) bylo smícháno s 2 g tekutého parafínu (šarže: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co. Ltd. (Čína), sterilizované v parním autoklávu a skladované při 4 stupních Pozitivní lék BJRG byl získán jako tablety Biejiarangan od společnosti Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Čína). Zásoby léků BJRG byly připraveny rozpuštěním BJRG tablety v destilované vodě v koncentraci 600 mg/kg.

Rostlinné materiály

C. tubulosa(rodina Orobanchaceae) byla zakoupena z oblasti Minfeng v Xinjiang v Číně. Materiál byl ověřen výzkumníkem Jun Zhao, Klíčová laboratoř pro ujgurskou medicínu, Institute of Materia Medica of Xinjiang. Poukazové vzorky byly uloženy v Institutu Materia Medica v Xinjiangu.

Příprava CPhG(Fenylethanolglykosidy z cistanche)

Sušené a nakrájené oddenkyC. tubulosa(6 0 kg) byly postupně extrahovány pod zpětným chladičem třikrát 70 procentním ethanolem a rozpouštědlo bylo odstraněno, čímž byl získán ethanolový extrakt. Ethanolové extrakty byly purifikovány za použití pryskyřice AB-8, čímž byly získány fenylethanolglykosidy (CPhGs). Zásobní roztoky CPhG používané pro různé dávkové skupiny ve studiích na zvířatech (500 mg/kg, 250 mg/kg, respektive 125 mg/kg) byly rozpuštěny v 0,5 procenta (5 g/l) karboxymethylcelulóze (sodná sůl).

Kvantifikace CPhGs(Fenylethanolglykosidy z cistanche)

The contents of two components (echinacoside and acteoside) in the CPhGs were determined by HPLC using a previously reported method (Zhang et al. 2004) [12]. HPLC was performed by using a Shimadzu LC-10A HPLC equipped with a UV detector. The HPLC column was a Phenomenex Gemini ODS column (250 × 4.6 mm, 5 μm). The isocratic mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-1 percent acetic acid (15:10:75, v/v/v). Elution was for 40 min and the flow rate was kept at 0.6 mL/min. The column temperature was kept constant at 30 degree . UV detection was at 334 nm.

Zvířata a buněčná linie HSC-T6

[Stupeň SPF] zdraví dospělí samci potkanů ​​Sprague–Dawley (SD) (180–220 g) byli zakoupeni od Xinjiang Medical University Animal Center, číslo licence: SCXK (New) 2011–0004. Krysy byly krmeny potravou bez specifických patogenů (SPF). Všechny postupy související s pokusy na zvířatech byly schváleny Výborem pro etiku zvířat První přidružené nemocnice lékařské univerzity Xinjiang. Potkani byli umístěni v klecích za kontrolovaných podmínek prostředí (25 stupňů a 12 hodinový cyklus světlo/tma) a měli volný přístup ke standardnímu krmivu pro krysy ve formě pelet a vodě z vodovodu. Potkani se před ošetřením aklimatizovali. Imortalizovaná krysí jaterní hvězdicová buněčná linie, HSC-T6, byla získána od Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Čína). Buňky HSC-T6 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (vysoká glukóza) (DMEM, Peking, Čína) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (Gibco, Jižní Amerika), 100 IU/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu (Beijinging , Čína) ve zvlhčovaném inkubátoru při 37 stupních s 5 procenty CO2.

BSA-indukované poškození jater a léčby

Sedmdesát pět SD potkanů ​​bylo náhodně rozděleno do šesti skupin: normální (ošetřené destilovanou vodou), modelové (ošetřené BSA), pozitivní léčivo (ošetřené BSA plus BJRG 600 mg/kg/den) a léčené BSA plus CPhG(Fenylethanolglykosidy z cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/den) skupin. Skupiny léčené BSA plus CPhG (125, 250, 500 mg/kg/den) měly 13 krys v každé skupině a druhá skupina měla 12 krys v každé skupině. Model poškození jater vyvolaného BSA se dělí na primární senzibilizaci následovanou imunologickým záchvatem) [13]. S výjimkou normální skupiny bylo ostatním skupinám podáváno několik subkutánních injekcí s 0,5 ml (9 mg/ml) BSA Freundova nekompletního adjuvans v den 1, den 15, den 22, den 29 a den 36 pro primární senzibilizaci. Sedm dní po páté injekci byla získána krev z plexu retinální žíly potkana a testována na protilátky proti sérovému albuminu. Protilátka BSA v krysím séru byla detekována metodou dvojité agarové difúze. Ataková injekce byla provedena podáním 0,4 ml BSA v normálním fyziologickém roztoku do kaudální žíly u potkanů ​​s pozitivními protilátkami BSA dvakrát týdně po desetkrát. Koncentrace a časy injekcí byly 5.{28}}, 5,50, 6.{32}}, 6,50, 7.00, 7,50, 8,50, 9.00, 9,50 a 10:00 g/l v den 46, den 50, den 53, den 57, den 60, den 64, den 67, den 71, den 74 a den 78, v tomto pořadí. V normální skupině byl pro imunologické primární (senzibilizace) a sekundární (útok) injekce místo BSA použit normální fyziologický roztok a ostatní podmínky byly stejné jako v modelové skupině. Normální skupině byla perorálně podávána destilovaná voda v dávce 10 ml/kg/den. Modelové skupině bylo orálně podáváno 10 ml/kg/den 0,5% roztoku CMC-Na. Pozitivní lékové skupině bylo orálně podáváno 600 mg/kg/den BJRG. BSA ošetřené plus CPhG (125,

Skupinám s 250 a 500 mg/kg/den) bylo orálně podáváno 125, 250 a 500 mg/kg/den CPhG(Fenylethanolglykosidy z cistanche), resp. Denní dávkování u potkanů ​​pokračovalo dva týdny po poslední injekci. Po experimentálním období byly krysy ponechány na lačno po dobu 12 hodin před podáním 10% chloralhydrátu a poté byly okamžitě usmrceny. Od každé krysy byly odebrány vzorky séra a okamžitě použity. Játra byla odebrána pro dva účely: (1) konzervace v kapalném dusíku pro Hyp kity a (2) fixace v 10% formaldehydu pro histologická a imunohistochemická vyšetření. Celková doba trvání studií na zvířatech byla 93 dní.

Indexy jater a sleziny

Játra a slezina byly vypreparovány laparotomií a promyty 4° normálními fyziologickými roztoky. Po absorbování přebytečné vody filtračním papírem byly játra a slezina zváženy, aby se vypočítaly odpovídající indexy: Relativní hmotnost orgánu=hmotnost orgánu (g)/hmotnost těla jednotlivce (g) × 100 procent [14].

Buněčné experimenty

Buňky HSC-T6 byly umístěny na 96-jamkovou destičku. Zpočátku byly buňky kultivovány s DMEM obsahujícím 10 procento FBS po dobu 48 hodin. Médium bylo poté nahrazeno DMEM bez FBS, aby se buňky vyhladověly po dobu 12 hodin. Buňky byly poté kultivovány s DMEM, který obsahoval 5,0 ng/ml TGF- 1 (bez FBS) po dobu 24 hodin. Konečně různé koncentrace CPhG(Fenylethanolglykosidy z cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml a 25 ug/ml), akteosid (6 ug/ml, 3 ug/ml a 1,5 ug/ml) a echinakosid (500 ug/ml, 250 ug/ml a 125 ug/ml) byly provedeny na destičce ve čtyřech jamkách a inkubovány po dobu 48 hodin.

Analýza PCR v reálném čase

Hladina exprese mRNA NF-KB, p65 a kolagenu I byla stanovena pomocí PCR v reálném čase. Pro stanovení exprese mRNA v buňkách HSC-T6 byly buňky (4 x 105 buněk) naočkovány do šestijamkových destiček s 3 ml DMEM s 10 procenty FBS a inkubovány přes noc při 37 stupních a 5 procentech CO2, poté bylo kultivační médium pro buňky byly změněny na DMEM bez séra. Dále CPhGs(Fenylethanolglykosidy z cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml a 25 ug/ml), akteosid (6 ug/ml, 3 ug/ml a 1,5 ug/ml) a echinakosid (500 ug/ml 250 ug/ml a 125 ug/ml) byly přidány do jamek. Po 48 hodinách inkubace s CPhG nebo monomerními kompozicemi byla celková RNA extrahována pomocí činidla TRIzol (Invitrogen, USA) a intenzivně míchána s chloroformem po dobu 15 sekund. Po sezení při pokojové teplotě po dobu 3 minut byl lyzát centrifugován při 12,000 x g po dobu 15 minut při 4 stupních. RNA ve vodné fázi byla vysrážena isopropanolem a horní vodná fáze byla přenesena do nové mikrocentrifugační zkumavky. RNA byla vysrážena přidáním 0,75 procenta ethanolu, poté byla mikrocentrifugační zkumavka a centrifugována při 12,000 x g při 4 stupních po dobu ne delší než 5 minut. Supernatant byl odstraněn a RNA byla sušena při pokojové teplotě po dobu 5-10 minut. Specifické sady primerů (Sangon, Shanghai, Čína), které byly použity pro amplifikaci potkaního aktinu [GenBank: NM_031144.3], kolagenu I [GenBank: NM_ 053304.1] a NF Geny -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] byly navrženy pomocí dávkového primeru 3. Dopředné (fw) a reverzní (rv) primery byly následující: Kolagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -actin (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Výsledky byly normalizovány na mRNA provozního genu -aktinu jako vnitřní kontrola a jsou prezentovány jako relativní hladiny mRNA. Reakce byly provedeny s 8 μl iQ SYBR Green Supermix, 1 μl 10 pM páru primerů, 8,5 μl destilované vody a 2,5 μl cDNA. Každá polymerázová řetězová reakce byla provedena za následujících podmínek: 95 stupňů po dobu 3 minut, poté 40 cyklů po 10 s při 95 stupních, 30 s při 55 stupních a 10 s při 55 stupních – 95 stupních pro prodloužení, následované jednoduchým měřením fluorescence . Konečné výsledky byly popsány s relativními hodnotami (2-ΔACt). Výpočet a analýza byly provedeny pomocí detekčního systému iQ5 Real-Time PCR.

Western blot analýza

Hladiny exprese proteinu kolagenu I (Abcam, Cambridge, Spojené království, Art No: ab34710) byly stanoveny metodou Western blotting [s -actinem (šarže: 60008-1-lg; Proteintech, Čína) jako kontrolní kontrolou. Extrakty celých buněk byly připraveny za použití radioimunoprecipitačního testu (RIPA) (Thermo Scientific, USA) pufru s 1 procentem koktejlu Halt inhibitoru proteázy (Thermo Scientific, USA) a 1 procenta koktejlu inhibitoru Halt fosfatázy (Thermo Scientific, USA). Koncentrace proteinu byla měřena a kvantifikována Bradfordovou metodou [18]. Protein (10–50 ug) byl separován na 10% SDS-PAGE gelu a přenesen na PVDF membrány (Millipore, USA). Membrány byly blokovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti pomocí 5 procent BSA a primární protilátky (protilátka Anti-Colla gen I, ředění 1:200 nebo myší mAb -aktinu, ředění 1:5000) byly inkubovány při 4 stupních přes noc. Odpovídající Alk-Phos. konjugované sekundární protilátky byly inkubovány při teplotě místnosti. Nakonec byly membrány třikrát promyty 1 x Tris-HCl fyziologickým roztokem s 0,1 procenta Tween 20 a signály byly skenovány a vizualizovány pomocí GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Na sledovaných proteinech byla provedena denzitometrická analýza a normalizována na -aktin pomocí softwaru GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). -aktin byl použit jako vnitřní kontrola.

Statistická analýza

Shapiro-Wilkův test normality a Levenův test homogenity rozptylu byly použity k ověření normality a You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Strana 4 z 13homogenity rozptylu. Analýza rozptylu (ANOVA) následovaná Tukeyho post hoc testem byla použita k identifikaci statistických rozdílů nehomogenních, normálně distribuovaných dat. Kruskal-Wallisův neparametrický test byl použit k analýze dat, která nejsou normálně distribuovaná nebo homogenní. Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± SD. Významnost byla stanovena na P < 0,05.="" všechna="" data="" byla="" analyzována="" softwarem="" spss="" 16.0="" (xinjiang="" medical="">

Výsledek

Kvantitativní stanovení CPhGs

CPhG v C. tubulosa obsahují dva fenylethylalkoholové glykosidy, echinakosid a akteosid, a jejich obsah v CPhG byl stanoven pomocí HPLC analýzy (obr. 1) na 42,71 ± 0,42 procent a 14,27 ± {{7 }}.18 procent, resp.

Indexy jater a sleziny

Jak ukázala tabulka 1, indexy jater a sleziny modelové skupiny byly významně zvýšeny [P < 0.01,="" p="">< 0,05].="" jaterní="" a="" slezinové="" indexy="" pozitivního="" léku="" bjrg="" a="" cphgs="" v="" různých="" dávkových="" skupinách="" byly="" významně="" sníženy="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="" skupinou="" [pjiver="0.004," pjiver="0.003," pjiver="0." 004,="" pjátra="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," v="" tomto="" pořadí].="" indexy="" jater="" a="" sleziny="" byly="" nižší="" než="" u="" modelové="">

Účinky CPhG na aktivity ALT, AST a markery jaterní fibrózy

V této studii byly sérové ​​hladiny jaterních enzymů AST a ALT významně zvýšeny v modelové skupině, což odráží hepatocelulární poškození u potkanů ​​s jaterní fibrózou vyvolanou BSA. Nicméně experimenty.

ukázaly, že léčba pomocí BJRG (600 mg/kg) a CPhG (125, 250 a 5{{10}}0 mg/kg) významně snížil AST [PAST < 0.0{{60}}1,="" minulost="">< 0,001,="" minulost="">< 0,001,="" minulost="">< 0,001="" ,="" v="" tomto="" pořadí]="" a="" hladiny="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," v="" tomto="" pořadí]="" u="" potkanů="" ​​s="" jaterní="" fibrózou="" .="" (tabulka="" 2).="" hladiny="" ha,="" ln,="" pc="" a="" iv-c="" u="" krysích="" modelů="" byly="" významně="" zvýšeny="" [pha="">< 0,001,="" pln="">< 0,001,="" ppciii="0,002," piv-c="">< 0,001].="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="" skupinou="" byly="" úrovně="" ha="" [pha="0,009," pha="0,007," pha="0,009," pha="0,023," v="" tomto="" pořadí],="" ln="" [pln="0,011," pln="0,004," p="" ln="0,026," p="" ln="0,069," v="" tomto="" pořadí],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," v="" tomto="" pořadí]="" a="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" v="" tomto="" pořadí]="" u="" potkanů="" ​​byly="" výrazně="" sníženy="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" a="" cphg="" při="" různých="" dávkových="" skupinách="" (125,="" 250="" a="" 500="" mg/kg)="" (tabulka="" 3).="" obsah="" hyp="" a="" tgf-="" 1="" obsah="" kolagenu="" byl="" také="" zjištěn="" měřením="" hladin="" hyp="" v="" jaterní="" tkáni.="" jak="" ukazuje="" tabulka="" 4,="" střední="">hladina v modelové skupině byla významně vyšší než u normální skupiny, ale byla výrazně snížena ve skupině BJRG a ve skupinách s různými dávkami CPhGs. Jaterní koncentrace TGF{{0}} modelové skupiny u potkanů ​​byla významně zvýšena [P < 0.001].="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="" skupinou="" byly="" hladiny="" tgf-="" 1="" pozitivního="" léku="" a="" skupiny="" s="" různými="" dávkami="" cphg="" výrazně="" sníženy="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" v="" tomto="" pořadí].="" výsledky="" jsou="" shrnuty="" v="" tabulce="">

Histopatologické vyšetření

Pozorování řezů normální jaterní tkáně obarvených H&E a Massonovým trichromem vykazuje odlišné jaterní lalůčky a jaterní sinusoidy. Struktura jaterní tkáně u modelových krys byla narušena a jaterní tkáň a jaterní sinusoidy byly nahrazeny velkým množstvím pojivové tkáně. V léčené skupině však byla detekována normálnější cytoarchitektura a méně pojivové tkáně než v modelové skupině.

H&E barvení

V normální skupině byla pozorována strukturální integrita jaterního lalůčku bez abnormálních portálních oblastí a jaterních sinusoid. Jaterní provazce byly uspořádány uspořádaným způsobem, s jádrem kulatým a průhledným. Jádra jsou umístěna ve středu buňky s bohatou cytoplazmou. Pouze oblast portálu má malé množství vazivové tkáně (obr. 2a). V modelové skupině byla silně poškozena lobulární struktura. Jaterní buňky vykazovaly mírnou vodnatou degeneraci, většinou balonovou degeneraci a/nebo tukovou degeneraci. Byla také pozorována tvorba infiltrace zánětlivých buněk, rozsáhlá hyperplazie vazivové tkáně, tvorba velkého počtu vazivového septa, rozštěpených lalůčků a významná proliferace jaterních buněk. Tato pozorování potvrdila úspěšnost vytvoření zvířecího modelu jaterní fibrózy u potkaního imunitního poškození (obr. 2b). Ve srovnání s modelovou skupinou došlo ke snížení infiltrace zánětlivých buněk u různých CPhG. Také bylo pozorováno méně nekrózy a tukové degenerace jaterních buněk, stejně jako zmírnění fibrózy. CPhG významně zmírnily patologii jaterní fibrózy indukované BSA u potkanů, zmírnily otok jaterních buněk a účinně zabránily nekróze hepatocytů a infiltraci zánětlivých buněk, což naznačuje, že CPhG mají ochranný účinek na jaterní fibrózu potkanů ​​indukovanou BSA. (obr. 2c–f ). Massonovo trichromové barvení V normální skupině byla jaterní tkáň normální. Oblast jaterní brány vykazovala malý počet modrých kolagenových vláken a jaterní tkáň byla normálně strukturovaná (obr. 3a). Ve srovnání s jaterní tkání normální skupiny vláknitá tkáň proliferovala centrálním cípem a expandovala do jaterního parenchymu. Kolagenová vlákna se prodlužují a spojují

obalil celý lalůček a obklopil centrální žílu. Tyto účinky spolu s fibrózou hepatocytů, lobulárním strukturálním poškozením, periportální fibrózou a tvorbou pseudolobulů (obr. 3b) poskytly důkaz, že byl vytvořen model. Ve srovnání s modelovou skupinou byla kolagenová vlákna ve skupině s pozitivním lékem mírně rozšířena směrem ven z periferní portálové oblasti (obr. 3c). Ve srovnání s modelovou skupinou byla kolagenová vlákna ve skupinách s různými dávkami CPhG významně snížena, proliferace vláken byla inhibována a proliferace vláknité tkáně v jaterním parenchymu byla významně snížena. Tyto výsledky naznačují, že CPhG chránily krysy před jaterní fibrózou vyvolanou BSA (obr. 3d–f).

Imunohistochemické barvení

Důležité je, že exprese kolagenu typu I a kolagenu typu III hraje zásadní roli ve vývoji jaterní fibrózy a jejich tvorba a ukládání v jaterní tkáni by mohly sloužit jako důležitý determinant účinnosti proti jaterní fibróze. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 5

Kolagen typu I

Normální skupina exprimovala kolagen typu I hlavně v cévách a portální oblasti. Modelová skupina vysoce exprimovala kolagenovou vaskulární fibrózu typu I v portálních oblastech. V prostoru Disse bylo barvení kolagenem typu I pozorováno jako pruhy nebo jako nerovnoměrná distribuce. Kolagenem obalená vláknitá přepážka za vzniku pseudolobulu. V těchto experimentech se vytvořilo méně vláknitých přepážek pro BJRJ (600 mg/kg) a různé dávkové skupiny CPhGs (125, 250 a 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023, respektive P Col I=0.044]. Semikvantitativní výsledky ukázaly, že exprese jejich kolagenu typu I byla významně nižší ve srovnání s modelovou skupinou (obr. 4).

Kolagen typu III

Kolagen typu III byl v normální skupině slabě exprimován a periferní oblasti obklopující portální a jaterní žíly vykazovaly místo souvislých vláken malé množství jemně žluté (obr. 5a). V modelové skupině kolagenová vlákna vykazovala široké a tlusté provazce, což ukazuje na silnou expresi, lokalizovanou především v oblasti portální a vazivové tkáně (obr. 5b). Kolagenová vlákna BJRJ (600 mg/kg) a různé dávkové skupiny CPhG (125, 250 a 500 mg/kg) byla vláknitá a distribuovaná kolem centrální žíly a portálních oblastí. Ve srovnání s modelovou skupinou byla kolagenová vlákna významně redukována, barvení bylo světlé a tenké a imunohistochemické barvení bylo slabě pozitivní (obr. 5c–f). Tyto semikvantitativní výsledky ukazují, že pozitivně exprimované buňky v pozitivních a různých dávkových skupinách [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010 a P Col III=0.037, v tomto pořadí] byly odlišné od těch v modelové skupině.

TGF- 1

V normálních krysích jaterních buňkách byla exprese TGIF{{0}}} malá. Exprese byla omezena na malý počet intersticiálních buněk (obr. 6a). V modelové skupině byla exprese TGF- 1 široce distribuována v oblasti portálu, fibrózních prostorů, jaterních hvězdicových buňkách, zánětlivých buňkách, sinusoidální stěně a cytoplazmě. Konkrétní oblast portálu vykazovala silně pozitivní expresi s hnědožlutým zbarvením (obr. 6b). Bylo zjištěno malé množství exprese v oblasti portálu a vazivových přepážek BJRJ (600 mg/kg) a různých dávkových skupin CPhG (125, 250 a 500 mg/kg). Rozsah pozitivního zbarvení v těchto skupinách byl významně snížen ve srovnání s modelovou skupinou. Barvení v intersticiálních buňkách ve fibrózních septech a cytoplazmě zánětlivých buněk bylo sníženo (obr. 6c–f). Semikvantitativní výsledky ukázaly, že BJRJ a různé dávkové skupiny CPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0,001,="" p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0" 0,004]="" byly="" významné="" ve="" srovnání="" s="" modelovou="" skupinou.="" jak="" již="" bylo="" v="" článku="" zmíněno,="" tgf-="" 1="" je="" důležitým="" cytokinem="" v="" patofyziologii="">

fibróza, stimulující produkci extracelulární matrix [19]. Ukázali jsme, že hladina TGF- 1 se v modelové skupině zvýšila způsobem konzistentním se závažností jaterní fibrózy. Hladiny exprese TGF- 1 v játrech byly konzistentní se sérovými hladinami TGF- 1. To naznačuje, že CPhG mohou významně snížit jaterní fibrózu způsobenou expresí TGF- 1 tím, že se účastní syntézy a degradace ECM. Exprese kolagenu typu I, kolagenu typu III a TGF- 1 může detekovat patologický proces jaterní fibrózy. Hladiny jejich exprese v léčebných skupinách byly významně sníženy a ukázalo se, že CPhG mohou zlepšit aktivitu kolagenázy, udržovat dynamickou rovnováhu syntézy a degradace ECM v játrech, čímž zpomalují a zabraňují vzniku jaterní fibrózy.