Příznivé účinky echinakosidu na diabetickou kardiomyopatii u diabetických Db/Db myší

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Xiang Zhang a Yarong Hao

Úvod

Diabetická kardiomyopatie (DCM) je hlavní komplikací diabetu s vysokou morbiditou a vysokým rizikem kardiovaskulárních onemocnění a úmrtností u diabetických pacientů.1 Incidence DCM u pacientů s diabetem v anamnéze 5 let nebo větším je více než 44,4 procenta, která se po 8 letech zvýší na 56 procent.2,3 DCM je druh primární kardiomyopatie, která se projevuje jako srdeční strukturální a funkční abnormality způsobené apoptózou buněk myokardiální fibrózy a mikrovaskulárními lézemi u diabetických pacientů bez ischemické nebo hypertenzní choroby srdeční a může vyvolat srdeční arytmii se šokem srdečního původu a náhlou smrtí při srdečním selhání.4 Vzhledem ke složité patogenezi DCM a její diagnóze v pokročilých stádiích neexistuje účinná léčba.5 Hyperglykémie je iniciačním faktorem během patogeneze DCM. Dlouhodobá hyperglykémie má za následek poruchu metabolismu glukózy a lipidů v kardiomyocytech diabetických pacientů, což vede k poškození vaskulárních endoteliálních buněk a dalších tkání, což podporuje patologické změny včetně hypertrofie, nekrózy, apoptózy a intersticiální fibrózy myokardu.6,7 Glukóza a lipidy poruchy metabolismu jsou klíčové pro patologické mechanismy DCM. Účinná kontrola energetického metabolismu v kardiomyocytech proto představuje důležitou terapeutickou strategii pro DCM.

cistanche tubulosa léčitDiabetická kardiomyopatie

Akumulace lipidů v myokardu při DCM zhoršuje progresi srdečního selhání. PPAR- je klíčovým regulátorem různých příbuzných genů v systému oxidace mastných kyselin buněčných peroxidáz, mitochondrií a mikrozomů a hraje klíčovou roli během metabolismu lipidů a regulaci zánětu a imunity.8 PPAR- zlepšuje metabolismus lipidů prostřednictvím mitochondriálních a peroxidáza beta-oxidace mastných kyselin, zprostředkovaná karnitin palmitoyltransferázou-I (CPT-I).9 Oxidace dlouhých a rozvětvených mastných kyselin10 snižuje syntézu a sestavení lipoproteinů a VLDL.11 Nepřímá regulace syntézy žlučových kyselin podporuje vylučování cholesterolu12 a inhibuje expresi genů spojených se zánětem. Exprese PPAR v játrech je významně nižší u pacientů s nealkoholickým ztučněním jater nebo na zvířecích modelech dlouhodobé konzumace vysokých tuků.13,14 Everett et al prokázali, že hladiny volných mastných kyselin spojených s játry významně vzrostly na myších modelech s knockoutem PPAR- v důsledku oslabeného metabolismu lipidů podporujících steatózu jater.15 Tato zjištění naznačují, že PPAR- hraje důležitou roli v patogenezi metabolismu lipidů.

Echinosid (ECH) je přírodní sloučenina izolovaná ze stonkůcistanche tubulosa.Aktivní chemickou látkou ECH je fenylethanoid, který vykazuje antioxidační, protiúnavové, protinádorové a protizánětlivé účinky a může zlepšit paměť, ochranu nervů a jater a posílit imunitní regulaci.16,17 Ve studii o db/db diabetických myší bylo zjištěno, že ECH může zlepšit inzulínovou rezistenci, zvýšit hladinu HDL a snížit hladiny TG, TC a LDL, což naznačuje, že ECH může účinně zlepšit diabetický metabolismus lipidů.18 Kromě toho Shimoda et al prokázali, že echinakosid by mohly ovlivnit metabolismus lipidů regulací mRNA související s transportem hepatobiliárních sterolů

a metabolismus.19 Předchozí studie ukázaly, že ECH reguluje expresi TGF- a jeho downstream genů za účelem zlepšení renální fibrózy u db/db myší.20 V této studii, abychom lépe porozuměli ochranným účinkům ECH na poškození myokardiálních buněk u DCM a abychom prozkoumali její potenciální molekulární mechanismy, použili jsme db/db myši jako model onemocnění DCM a prozkoumali jsme regulační mechanismus(y) ECH na proteinech, které kontrolují poruchy metabolismu glukózy a lipidů, oxidační stres a apoptózu v kardiomyocytech. Naším cílem bylo poskytnout teoretický základ pro efektivní léčbu DCM.

cistanche tubulosa

Materiály a metody

Chemikálie a činidla

Prášek ECH (94procentní čistota detekovaná pomocí HPLC, šarže č. 190906) (doplňkový obrázek 1) byl získán od Shanghai Medical Science Company, Ltd. (Shanghai, Čína). ECH byl rozpuštěn ve vodě na 2 mg/ml a skladován při 4 stupních v temnu. ECH byla podávána v dávce 100–500 mg/kg·d a byla významně snížena

glukózy v krvi a zlepšených hladin krevních lipidů.18 ECH vykazovala na dávce závislé hypoglykemické a antihyperlipidemické účinky.

Pokusná zvířata a léčba

Pokusy na zvířatech byly prováděny v souladu s pokyny National Institutes of Health (NIH Pub. č. 85-23, revidováno 1996). Protokoly byly schváleny etickou komisí experimentálních zvířat a Střediskem pro krmení zvířat Renminské nemocnice univerzity Wuhan (Wuhan, Čína, č. 20190517). Dospělí samci myší C57BLKS/J db/db a myši db/m (třída SPF) byli zakoupeni od Nanjing University–Nanjing Biomedical Research Institute (Nanjing, Čínská lidová republika, číslo: SCXK (Sue) 2018-0001). Zvířata byla umístěna do klecí ve Animal Center of Renmin Hospital (Wuhan, Čínská lidová republika) při pokojové teplotě (20 stupňů), relativní vlhkosti 50 procent -60 procent a vystavena 12-hodinovému světlu/ temný cyklus. Adaptivní krmení bylo prováděno po dobu 1 hodiny a nebyla podávána žádná hypoglykemická léčiva.

Po karanténě byly myši db/db náhodně rozděleny do modelové skupiny diabetu (skupina db/db, n{{0}}), skupiny léčené ECH (skupina db/db plus ECH, n=11 ) nebo kontrolní skupina db/m (db/m, n=9). V 8 týdnech bylo myším ve skupinách db/db a db/m podáváno perorálně 0,05 ml/10 g fyziologického roztoku o tělesné hmotnosti po dobu 10 týdnů, zatímco myším ve skupině db/db plus ECH bylo podáváno perorálně 300 mg/(kg/d)

ECH podle tělesné hmotnosti po dobu 10 týdnů. Tělesná hmotnost tří skupin myší byla sledována týdně a bylo hodnoceno krmení, pití a aktivita. Jakmile myši hladověly po dobu 8 hodin, byly každé 2 týdny odebírány vzorky krve (~ 50 ul) z konce ocasu pomocí glukometru a testovacího papírku (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA) pro stanovení hladiny glukózy v krvi. . Po 10 týdnech intervence byly myši anestetizovány intraperitoneální injekcí 2% pentobarbitalu sodného (Shanghai Harvest company, Shanghai, People's Republic of China) (100 mg/kg). Krev byla odebrána po zavedení kapilární jehly a sérum bylo rychle odděleno a skladováno při -80 stupních pro analýzu. Po srdeční perfuzi studeným PBS k odstranění krve byl volný PBS odstraněn filtračním papírem. Srdeční tkáň byla oddělena a zvážena a byla změřena suchá hmotnost srdce. Břicho myší bylo oholeno, břicho bylo otevřeno po alkoholové (70procentní) dezinfekci a podkožní tuková tkáň břicha byla rychle odstraněna a zvážena za vlhka. Holenní kost myší byla izolována a změřena. Srdeční hypertrofie byla hodnocena prostřednictvím poměru hmotnosti srdce k délce tibie (HW/TL) (mg/mm). Srdeční tkáně byly fixovány 4% paraformaldehydem (biotechnologie Google, Wuhan, Čínská lidová republika) a byly provedeny biopsie ke sledování morfologie myokardiální tkáně. Zbývající srdeční tkáň byla umístěna do kapalného dusíku na 1 hodinu a skladována při -80 stupních před RT-PCR a analýzou Western blot.

Echokardiografie

Pro echokardiografická měření na konci experimentu byl proveden ultrazvuk (VisualSonics, Toronto, ON, Kanada). Myši byly anestetizovány intraperitoneální injekcí 4% chloralhydrátu v dávce 30 mg/kg po dobu půl hodiny,21 oholeny, aby se obnažila oblast hrudníku, a fixovány na plochou desku. Byl stanoven systolický průměr levé komory (DVD), diastolický průměr levé komory (LVD), ejekční frakce levé komory (EF) a frakční zkrácení levé komory (FS).

Metabolické a biochemické parametry

Ve věku 18 týdnů byly vzorky krve centrifugovány při 4 stupních po dobu 20 minut pro odběr séra. Celkový automatický biochemický analyzátor (ADVID2400, Tokio, Japonsko) byl použit k detekci celkového cholesterolu (TC), triglyceridů (TG), volných mastných kyselin (FFA), lipoprotein-cholesterolu s vysokou hustotou (HDL-c) a nízké hustoty. lipoprotein-cholesterol (LDL-c) v séru.

Antioxidace: cistanche tubulosa

Oxidační index a hladiny antioxidantů

Byly získány čerstvé tkáně myokardu levé komory (50 mg) každé skupiny. Hladiny SOD, GSH-px a MDA v buňkách myokardu byly stanoveny pomocí komerčních souprav (Nanjing Jiangcheng Bioengineering Institute, Čína).

Barvení trichromem, Tunel a Sudan II Oblast levé komory myokardiální tkáně každé skupiny myší byla fixována ve 4% paraformaldehydu po dobu 24 hodin, zalita do parafinu, nařezána a obarvena HE. Patologické a morfologické změny myokardiálních vláken každé skupiny myší byly pozorovány pod světelnou mikroskopií (JEOL, Tokio, Japonsko). Apoptóza srdečních myocytů byla detekována testy Tunel (číslo 11684817910, Roche, USA). Srdeční tkáň byla předem ošetřena paraformaldehydem, zalita a nakrájena. Řezy byly promyty xylenem I (Shanghai, Čínská lidová republika) (20 min) -xylenem II (20 min) -bezvodým ethanolem I (10 min) -bezvodým ethanolem II (10 min) -95% alkoholem (5 min){{ 14}} procent alkoholu (5 minut)-80 procent alkoholu (5 minut) −70 procent alkoholu (5 minut) a destilovaná voda. Řezy byly vysušeny třepáním a byly použity histochemické kartáčové kroužky, aby se zabránilo ztrátě kapaliny. Proteáza K byla přidána do kroužků pro pokrytí tkáně. Po inkubaci při 37 stupních po dobu 15 minut byla sklíčka umístěna do PBS (pH 7,4) a promyta v odbarvovací třepačce (třikrát po 5 minut). Reagencie 1 (TdT) a 2 (dUTP) byly smíchány v poměru 1:9 a přidány do vnitřního obalu tkáně. Směsi byly inkubovány ve vodní lázni při 37 stupních po dobu 60 minut. Pro udržení vlhkosti bylo přidáno malé množství vody. Sklíčka byla opláchnuta v PBS a barvena DAPI (Aspen biologické, Wuhan, Čínská lidová republika) ve tmě po dobu 5 minut. Sklíčka byla opláchnuta v PBS a upevněna pomocí antifluorescenčního zhášecího činidla. Řezy byly vizualizovány fluorescenční mikroskopií a zobrazeny. Barvení Sudan II bylo použito k pozorování akumulace lipidů v srdečních myocytech. Tkáně levé komory byly fixovány v 10% paraformaldehydu po dobu 30 minut, obarveny sudánskou červení II (Gefen, Shanghai, Čínská lidová republika) při pokojové teplotě po dobu 10 minut, odbarveny 75% alkoholem a znovu barveny v PBS po dobu 15 minut . Poměr fibrózy myokardu k celkové ploše v Massonově obarvených trichromových řezech byl stanoven pomocí kvantitativního softwaru Image-Pro Plus. Sklíčka byla upevněna pomocí glycerinové želatiny a zobrazena pomocí mikroskopie.

Výsledek

Účinky ECH na myši Db/Db

Myši ve skupinách db/db vykazovaly zjevnou polyfágii a polyurii. Velikosti těla byly také významně větší než u db/m myší. Tělesná hmotnost ve skupině db/db významně vzrostla ve srovnání se skupinou db/m (obrázek 1A; **p<0.01). body="" weights="" of="" the="" db/db="" +="" ech="" group="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" of="" the="" db/="" db="" group="" after="" 10="" weeks="" of="" ech="" treatment="" (figure="" 1a;=""><0.05). at="" week="" 15,="" the="" difference="" in="" body="" weight="" of="" each="" group="" gradually="" appeared="" after="" ech="" intervention.="" the="" abdominal="" fat="" thickness="" of="" mice="" in="" the="" db/db="" group="" was="" higher="" than="" those="" in="" the="" db/m="" group="" (figure="" 2b;=""><0.01). ech,="" therefore,="" improves="" obesity="" in="" db/db="" mice,="" the="" specific="" mechanisms="" of="" which="" require="" further="">

Hladiny glukózy v krvi nalačno byly hodnoceny každý týden. Jak je znázorněno na obrázku 1B, ve srovnání s db/m myšmi se hladiny glukózy v krvi nalačno u db/db myší významně zvyšovaly s věkem a vykazovaly zjevnou hyperglykémii (obrázek 1B; *p<0.01). over="" a="" 10="" week="" period,="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/db="" and="" db/db="" +="" ech="" group="" increased,="" whilst="" glucose="" levels="" in="" the="" db/m="" group="" remained="" stable.="" fasting="" blood="" glucose="" levels="" in="" the="" db/="" db="" +="" ech="" group="" were="" slower="" than="" those="" of="" the="" db/db="" group="" (figure="" 1b;=""><0.01), suggesting="" that="" ech="" markedly="" improved="" hyperglycemia="" in="" db/db="" diabetic="" mice.="" we="" speculated="" that="" ech="" could="" promote="" the="" synthesis="" of="" liver="" glycogen="" and="" inhibited="" the="" activity="" of="" α-glucosidase="" to="" suppressed="" glucose="" transport="" in="" the="" small="" intestine,="" significantly="" contributing="" to="">

Diskuse

Diabetická kardiomyopatie se obecně dělí do čtyř fází. V první fázi se zvětšila hmota levé komory, diastolická dysfunkce a ejekční frakce (EF) normální. I klinicky asymptomatická fibróza myokardu se zvýšila, časné diastolické plnění se snížilo a enddiastolický tlak levé komory se zvýšil.22 Druhé stadium je charakterizováno zvýšením hmoty levé komory, zesílenými stěnami komory, systolickou a diastolickou dysfunkcí (EF<50%), mild="" cardiac="" dilatation.="" in="" the="" third="" stage,="" diastolic="" dysfunction="" and="" arterial="" hypertension="" contribute="" to="" systolic="" dysfunction="" and="" microangiopathy.="" stage="" iv,="" moderate-severe="" systolic="" dysfunction,="" cardiac="" dilatation,="" fibrosis,="" and="" microvascular="" and="" macrovascular="" lesions="" cause="" severe="" and="" irreversible="" changes="" in="" heart="" tissue="" ultimately.26="" myocardial="" cell="" apoptosis,="" necrosis,="" hypertrophy,="" and="" fibrosis="" increase="" leading="" to="" disorders="" of="" diastolic="" and="" systolic="" functioning.6,27="" this="" eventually="" develops="" into="" ischemic="" heart="" disease="" and="" heart="" failure.28="" in="" this="" study,="" blood="" glucose="" and="" serum="" lipid="" levels="" of="" db/db="" mice="" significantly="" increased="" in="" the="" db/db="" group.="" symptoms="" of="" obesity="" were="" also="" observed,="" including="" body="" weight="" changes="" and="" increases="" in="" the="" rate="" of="" hw/tl="" compared="" to="" the="" db/m="" group.="" he="" staining="" and="" masson's="" trichrome="" staining="" of="" the="" heart="" showed="" obvious="" pathological="" changes="" in="" the="" cardiac="" myocytes="" of="" the="" db/db="" group,="" including="" hypertrophy="" and="" necrosis,="" disordered="" cardiac="" myocytes,="" and="" high="" levels="" of="" extracellular="" matrix="" deposition.="" these="" data="" indicate="" that="" db/db="" mice="" exhibit="" early="" dcm="" under="" long-term="">

ATP je základním zdrojem energie pro srdce. Srdeční energie je poskytována oxidací a rozkladem MK, které tvoří ~70 procent dodávky srdeční energie.29 Zbytek zajišťují sacharidy, jako je glukóza a kyselina mléčná.30 Diabetická srdce podléhají zvýšené spotřebě energie a nerovnováze v kapacita myokardu, představující hlavní příčinu metabolických poruch myokardu, včetně sníženého metabolismu glukózy a zvýšeného metabolismu FA. To vede ke zvýšenému vychytávání a oxidaci FA vedoucí k hromadění tuku a tvorbě toxických tukových látek, což přímo vede k lézím DCM.31

Závěry

U db/db myší s diabetickým myokardem je metabolismus glukózy a lipidů dysregulován, což vede ke zvýšeným hladinám oxidačního stresu a apoptóze. Tato studie potvrdila, že ECH může významně snížit dlouhodobou hyperglykémii u db/db myší prostřednictvím signalizace PPAR/M-CPT-1/GLUT-4. Mezitím ECH zlepšil oxidační stres a inhiboval apoptózu myokardu u db/db DCM myší, což může souviset se zlepšeným energetickým metabolismem. Zatímco základní mechanismy řídící tyto účinky nebyly objeveny, tato zjištění poskytují nový směr pro léčbu DCM a ochrannou roli ECH při zlepšování poškození myokardu.

Reference

1. Bauters C, Lamblin N, Mc Fadden EP, Van Belle E, Millaire A, de

Groote P. Vliv diabetes mellitus na riziko a výsledek srdečního selhání. Kardiovaskulární Diabetol. 2003;1(8):1–2. doi:10.1186/1475- 2840-2-1

2. Tate M, Grieve DJ, Ritchie RH. Jsou na obzoru cílené terapie diabetické kardiomyopatie? Clin Sci. 2017;131(10):897–915. doi:10.1042/CS20160491

3. Khan H, Anker SD, Januzzi JJ a kol. Epidemiologie srdečního selhání u pacientů s diabetes mellitus bez ischemické choroby srdeční. Selhání karty J. 2019;25(2):78–86. doi:10.1016/j.cardfail.2018.10.015

4. Sheila K, Patel B. Polymorfismus genu CTGF −945 G/C není spojen se srdečními nebo ledvinovými komplikacemi u subjektů s diabetem 2. typu. Kardiovaskulární Diabetol. 2012;1(11):42.