Část 1|Glykogensyntáza kináza 3b Hyperaktivita v exfoliovaných buňkách moči předpovídá progresi diabetického onemocnění ledvin

Xianhui Liang a kol

1Centrum pro čištění krve, Ústav nefrologie, První přidružená nemocnice univerzity Zhengzhou, Zhengzhou, Čína; 2Department of Medicine, Division of Kidney Disease and Hypertension, Rhode Island Hospital, Brown University School of Medicine, Providence, RhodeIsland, USA; a 3Department of Medicine, Division of Nefrology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio, USA

Pro více informací prosím kontaktujte:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Rostoucí důkazy poukazují na to, že glykogensyntáza kináza (GSK)3b je klíčovým hráčem v různýchonemocnění ledvin. Nicméně, jako klíčový převodník signální dráhy inzulínu, role GSK3b u diabetikůledvina chorobazůstává nejistý. U DB/DB myší byla renální exprese celkového a aktivovaného GSK3b zvýšeně zvýšena. To předcházelo rozvoji diabetikaledvina chorobaa koreluje s progresí příznakůdiabetikledvinaporanění, včetně albuminurie a akumulace extracelulární matrix v glomerulech a tubulointersticiálním. In vitro expozice glomerulárních podocytů, mezangiálních buněk a renálních tubulárních buněk diabetickým prostředím indukované nadměrné expresi a hyperaktivitě GSK3, které se zdají zásadní a dostatečné pro vyvolánídiabetikpoškození buněk v buňkách ledvin, protože cytopatický účinek diabetického prostředí byl zmírněn knockdownem GSK3b, ale byl napodoben ektopickou expresí konstitutivně aktivního GSK3b i v normálním prostředí. Nekonzistentní vzorky biopsie ledvin odebrané od pacientů s různými stádii diabetické nefropatie odhalily zesílenou expresi celkového a aktivovaného GSK3b v glomerulech a renálních tubulech, spojenou se závažností diabetické nefropatie. Navíc v retrospektivních kohortách pacientů s diabetem typu 2, kteří byli sledováni po dobu více než pěti let, relativní aktivita GSK3b v uložených močových exfoliovaných buňkách představovala nezávislý rizikový faktor pro rozvoj nebo progresi poškození ledvin. Kromě toho analýza provozních charakteristik přijímače prokázala, že aktivita GSK3b v močových exfoliovaných buňkách poskytuje mnohem lepší sílu než albuminurie při rozlišování diabetických pacientů s progresivní poruchou ledvin od pacientů se stabilní funkcí ledvin. Renální exprese a aktivita GSK3b jsou tedy zesíleny u experimentální a klinické diabetické nefropatie. GSK3b v močových exfoliovaných buňkách tedy může sloužit jako nový biomarker pro predikci diabetickýchledvinachorobapostup.

Diabetické onemocnění ledvin(DKD) je i nadále hlavní příčinou konečného selhání ledvin ve Spojených státech a dalších rozvinutých zemích.1,2 Ne u každého pacienta s diabetes mellitus se však rozvine diabetická nefropatie (DN), jak dokládá řada dlouhodobých termín epidemiologické následné studie.3 Důvod tohoto heterogenního výsledku není plně objasněn, ale zdánlivě multifaktoriální, zahrnující různé příčinné faktory, včetně genetiky, prostředí, preexistujícíchledvinachorobaa závažnost diabetu.4,5 Špatná glykemická kontrola je dobře známým rizikovým faktorem albuminurie a DN. Přesto u významné části pacientů stále dochází k rozvoji DN i přes přísnou glykemickou kontrolu.6 V klinické praxi je nutné přijmout citlivý a přesný biomarker pro stratifikaci diabetických pacientů s rizikem progrese do renálního poškození. Po léta byla albuminurie považována za zástupný marker diabetických ledvinových komplikací.7,8 Nicméně stále více důkazů naznačuje, že albuminurie nemusí být přesná.9,10 Byl zaznamenán významný nesoulad mezi albuminurií a poruchou funkce ledvin u DN. 11,12 Podle údajů United Kingdom Prospective Diabetes Study13 z těch pacientů, u kterých se rozvinulo poškození ledvin, 61 procent nemělo předem albuminurii a 39 procent nikdy během studie albuminurie nevyvinulo. Stejně tak z těch pacientů, u kterých se rozvinula albuminurie, se během studie následně rozvinulo poškození ledvin pouze u 24 procent. Jinými slovy, u pacientů s mikroalbuminurií nebo makroalbuminurií se u převážné většiny nemusí rozvinout porucha funkce ledvin. Tato data tak zpochybňují klasické paradigma albuminurie, které vždy předcházelo poškození ledvin během progrese DKD. Jako takové je nezbytné identifikovat nové biomarkery.

pro predikci DN nebo pro včasnou diagnostiku DN. V posledním desetiletí byla testována řada nových molekul.14–16 Mezi nimi se jako atraktivní kandidát ukázala glykogensyntáza kináza 3 (GSK3). GSK3 je vysoce konzervovaná, všudypřítomně exprimovaná serin/threonin-proteinkináza, která byla původně charakterizována jako klíčový přenašeč inzulinové signalizační kaskády a řídí glykogenezi. Zájem o GSK3 se výrazně zvýšil s uvědoměním si, že také funguje jako konvergenční bod pro mnohočetné buněčné signální dráhy zapojené dozánět, imunomodulace, embryogeneze, poškození tkáně, oprava a regenerace.17–19 GSK3 existuje jako 2 izoformy: GSK3a a GSK3b. V různých orgánových tkáních jsou tyto 2 izoformy exprimovány odlišně. V kůře ledvin je izoforma b převážně exprimována a lokalizována do glomerulů a proximálních tubulárních buněk.20,21 Nadměrná aktivita ledvin GSK3b je spojována s celou řadou onemocnění ledvin, včetně proteinurických Glo-neuropatií a progresivního chronického onemocnění ledvin.22 , jako klíčový přenašeč inzulinové signální dráhy, role GSK3b v patogenezi DN zatím není známa. Zbývá objasnit, zda se na DN podílí dysregulace GSK3b v ledvinách. Aby se tento problém vyřešil, tato studie zkoumala profily exprese celkového a aktivovaného GSK3b ve vzorcích ledvin získaných z dB/dB myších modelů DN nezávislých na inzulínu a ve tkáních biopsie ledvin od pacientů s různými stádii DN 2. typu. Kromě toho v retrospektivních kohortách pacientů s diabetem 2. typu byly hladiny exprese celkového a aktivovaného GSK3b měřeny v močových exfoliovaných buňkách, které byly odebrány jako vzorky tekuté biopsie ledviny na bázi moči. Zkoumali jsme vztah mezi hladinami exprese GSK3b nebo jeho aktivované formy ve výchozích močových exfoliovaných buňkách a rozvojem nebo progresí renálního poškození u diabetických pacientů.

VÝSLEDEK

GSK3b je nadměrně exprimován a hyperaktivní v renálních parenchymálních buňkách u db/db myší, což je spojeno s progresí albuminurie a diabetického poškození ledvin

db/db myši s deficitem leptinového receptoru jsou dobře zavedené modely pro diabetes mellitus 2. typu a DN. Již ve věku 10 týdnů se u db/db myší spontánně rozvinou časné příznakyporanění ledvin, vyznačující se progresivní albuminurií a akumulací matrix v glomerulech.23 Naproti tomu věkově odpovídající kontrolní myši (db/m) mají normální glykémii a žádné znatelné známkynemoc ledvin. V experimentu začínajícím ve věku 10 týdnů byla renální exprese celkového (obrázek 1) a aktivovaného (obrázek 2) GSK3b (fosforylovaný na Y216 [p-GSK3B]) u db/db myší proti kontrolním db/m myším progresivně zvýšena ( Obrázek 1b a 2b). To bylo lokalizováno hlavně do podocytů a mezangiálních buněk v glomerulech (obrázek 1a) a do tubulárních epiteliálních buněk v tubulointersticiálním (obrázek 2a), jak ukazuje imunohistochemické barvení. Morfologické nálezy byly potvrzeny imunoblotovou analýzou homogenátů celé ledviny (obrázek 1c a 2c). Regresní analýza prokázala, že intenzita zbarvení celkového (obrázek 1d) a aktivovaného (obrázek 2d) GSK3b v glomerulech pozitivně koreluje s vylučováním albuminurie močí u db/db myší v různém věku. Dokonce i v raném stádiu diabetu u db/db myší, jako ve věku 10 nebo 14 týdnů, byla aktivita GSK3b výrazně zvýšena v ledvinách, jak se odráží ve významné indukci p-GSK3b (obrázek 2). Zdá se, že hyperaktivita GSK3b v ledvinách db/db myší v raném stádiu byla z velké části přisuzována posttranslačním modifikacím, jako je fosforylace na Y216, ale v pozdější fázi byla způsobena hlavně zvýšenou expresí celkového GSK3b.

Progrese DN se vyznačuje rostoucí akumulací extracelulární matrix jak v glomerulech, tak v intersticiální oblasti. Ve skutečnosti, jak ukazuje fluorescenční imunohistochemické barvení FL, ledviny myší db/db prokázaly progresivně zvýšenou expresi fibronektinu jak v glomerulech, tak v intersticiálním prostoru (obrázek 3a). To bylo dále potvrzeno imunoblotovou analýzou homogenátů ledvin na fibronektin a kolagen IV (obrázek 3b a c). Navíc exprese celkového a aktivovaného GSK3b pozitivně korelovala s expresí fibronektinu vledvinové tkáně(Obrázek 3d).

Aby se dále určilo, zda zvýšená aktivace GSK3b předchází vývoji DKD, byly db/db a db/m myši sledovány v samostatném experimentu začínajícím ve věku 4 týdnů během stadia prediabetu. V týdnu 7 vykazovaly myši db/db zjevnou hyperglykémii (doplňkový obrázek S1A), což naznačuje diabetes, ale žádné známky DKD, jak ukazuje normální albuminurie (doplňkový obrázek S1B). Je třeba poznamenat, že i v tak raném stádiu diabetu se renální exprese GSK3b a p-GSK3b, stejně jako relativní aktivita GSK3b vyjádřená jako poměr p-GSK3b/GSK3b, variabilně zvýšila, jak bylo měřeno imunoblotovou analýzou tkání renální biopsie. následuje denzitometrie (doplňkový obrázek S1C a D). Kromě toho lineární regresní analýza prokázala, že renální aktivita GSK3b v týdnu 7 pozitivně koreluje s rozvojem albuminurie a DKD v týdnu 13 (doplňkový obrázek S1E). Analýza křivky provozní charakteristiky přijímače (ROC) navíc prokázala, že renální aktivita GSK3b u db/db myší ve věku 7 týdnů, kdy nebyly žádné známky DKD, poskytla vynikající přesnost a sílu při předpovídání vývoje albuminurie a DKD (doplňkový obrázek S1F).

Vystavení ledvinových buněk diabetickému prostředí způsobuje nadměrnou expresi a hyperaktivitu GSK3b, což vede k diabetickým cytopatickým změnám

Chcete-li zjistit, zda diabetický stav přímo zvyšuje aktivaci GSK3b vledvinové buňkybyly použity in vitro kultury různých buněčných linií ledvin, včetně myších podocytů, mezangiálních buněk a tubulárních epiteliálních buněk, které byly vystaveny diabetickému prostředí, které sestává z vysoké okolní glukózy a transformujícího růstového faktoru (TGF) bl. Vystavení podocytů diabetickému prostředí mělo za následek výrazné poškození podocytů, které se projevilo ztrátou podocytárního markerového proteinu synaptopodinu. To bylo souběžné s výraznou indukcí celkového a aktivovaného GSK3b, jak bylo ukázáno fluorescenčním imunocytochemickým barvením FL (obrázek 4a a b) a potvrzeno imunoblotovou analýzou.

(Obrázek 4c a d). V kultivovaných mezangiálních buňkách byla exprese celkového (obrázek 5a) a aktivovaného (obrázek 5b) GSK3b podobně zvýšena po vystavení diabetickému prostředí, paralelně se zvýšenou expresí molekul extracelulární matrice, jako je fibronektin (obrázek 5). Podobně kultivované renální tubulární epiteliální buňky nadměrně exprimovaly celkový a aktivovaný GSK3b po léčbě diabetického prostředí, což bylo doprovázeno dysfunkcí tubulárních buněk a dediferenciací, která se vyznačuje sníženou a narušenou expresí epiteliálních těsných junction molekul, jako je zonula occludens{6}} (ZO -1) (obrázek 6a–d). Na rozdíl od toho, jako kontrola osmolality, ošetření všech ledvinových buněk mannitolem vedlo k účinku, který se neliší od toho, který byl přenášen normálním prostředím obsahujícím normální okolní glukózu. Lidský diabetes zahrnuje nejen hyperglykémii, ale také inzulínovou rezistenci. Ačkoli je nemožné úplně oddělit hyperglykémii od inzulínové rezistence na zvířecích modelech nebo u pacientů, byly použity in vitro modely, aby se prozkoumal izolovaný účinek vysoké hladiny glukózy oproti inzulínové rezistenci. K napodobení stavu inzulínové rezistence byla izoforma inzulinového receptoru sražena v kultivovaných podocytech, mezangiálních buňkách a renálních tubulárních buňkách (doplňkový obrázek S2A–C), což zesílilo expresi a aktivitu GSK3b i v normálním prostředí, jak ukazuje imunoblotová analýza a denzitometrie. Tento účinek byl zesílen po vystavení diabetickému prostředí, což znamená synergický účinek inzulínové rezistence a vysoké hladiny glukózy na aktivaci GSK3b.

Hyperaktivita GSK3b je nezbytná a dostatečná pro poškození ledvinových buněk a dysfunkci vyvolanou diabetickým prostředím

Abychom prozkoumali, zda se hyperaktivita GSK3b podílí na cytopatických změnách v buňkách ledvin, aktivita GSK3b vkultivovaná ledvinabuňky byly uměle manipulovány interferencí RNA

(RNAi) nebo nadměrná exprese genu. Jak je znázorněno na obrázku 7a, RNAi využívající scramble malé, interferující RNA stěží ovlivňuje cytopatický účinek diabetického prostředí ve všech ledvinových buňkách. Naproti tomu umlčení GSK3b podstatně zrušilo diabetickým prostředím vyvolanou supresi synaptopodinu v podocytech, indukci fibronektinu v mezangiálních buňkách a narušení ZO-1 v renálních tubulárních buňkách, což naznačuje, že GSK3b je pravděpodobně nezbytný pro spuštění cytopatických změn souvisejících s diabetem ledvinové buňky. Aby se zjistilo, zda nadměrná exprese a hyperaktivita GSK3b jsou dostatečné pro cytopatické účinky vyvolané diabetickým prostředím, byly buňky přechodně transfekovány buď prázdným vektorem nebo vektorem kódujícím konstitutivně aktivní mutant GSK3b (S9A). Ačkoli transfekce prázdným vektorem téměř nevykazovala žádné účinky, ektopická nadměrná exprese S9A měla za následek ztrátu exprese synaptopodinu v podocytech, zvýšenou produkci fibronektinu v mezangiálních buňkách a sníženou expresi ZO-1 v renálních tubulárních buňkách dokonce i v normálním prostředí (obrázek 7b), připomínající cytopatický účinek diabetického prostředí.

Progrese lidské DN se shoduje s nadměrnou expresí GSK3b a hyperaktivitou v renálních glomerulech a tubulech

Pro další ověření, zda jsou výše uvedená zjištění na zvířecích a buněčných kultivačních modelech také použitelná pro klinickou DN, byly archivované tkáně ledvinové biopsie od normálních subjektů a pacientů s různými stádii DN zpracovány pro peroxidázové imunohistochemické barvení na GSK3b a p-GSK3b. Charakteristiky kontrolních subjektů a pacientů jsou shrnuty v doplňkové tabulce S1. Jak je znázorněno na obrázku 8a, renální

exprese celkového a aktivovaného GSK3b se stále více zvyšovala spolu s progresí DN, jak je odstupňováno podle patologické klasifikace založené na barvení kyselinou jodovou – Schiff. To je v souladu s údaji Nephroseq, které také prokazují významně zvýšenou expresi GSK3b v tkáních biopsie ledvin od pacientů s DN (doplňkový obrázek S3). Zvýšená exprese celkového a aktivovaného GSK3b byla převážně lokalizována do podocytů a mezangiálních buněk v glomerulech a do renálních tubulárních epiteliálních buněk v tubulointersticiálním (obrázek 8a), v souladu s nálezy u db/db myší. Morfologické výsledky byly dále potvrzeny počítačovou morfometrickou analýzou, která odhalila pozitivní souvislost mezi úrovněmi exprese celkového (obrázek 8b) nebo aktivovaného (obrázek 8c) GSK3b a závažností DN.

GSK3b je hyperaktivní v močových exfoliovaných buňkách odebraných od diabetických pacientů a předpovídá progresi renálního poškození Za fyziologických i chorobných podmínek dochází neustále k obratu a uvolňování renálních epiteliálních buněk, jako jsou glomerulární podocyty a tubulární epiteliální buňky, což vede k nepřetržité exkreci renálních parenchymálních buněk do moči. Močové exfoliované buňky byly úspěšně využity jako močová neinvazivní tekutá biopsie ledvin pro výzkumné a diagnostické účely.24,25 Za předpokladu výše uvedených zjištění, že exprese celkového a aktivovaného GSK3b je zvýšená v renálních parenchymálních buňkách u pacientů s DN a DB/DB u myší dokonce v raném stadiu před manifestací albuminurie nás zajímalo, zda lze měření GSK3b v močových exfoliovaných buňkách využít k předpovědi

vývoj nebo progrese lidské DKD. Za tímto účelem jsme využili biobanku diabetu a provedli retrospektivní kohortovou studii. Celkem bylo pro zařazení do této studie vyšetřeno 127 pacientů s diabetes mellitus 2. typu, kteří byli od roku 2010 sledováni v First Affiliated Hospital of Zhengzhou University s uloženými vzorky frakcionované moči. Z těchto pacientů bylo 67 vyloučeno, přičemž 10 bylo ztraceno ve sledování, 52 mělo dysfunkci ledvin nebo zjevnou proteinurii na začátku onemocnění a 5 později diagnostikováno jako jiné onemocnění ledvin biopsií ledvin nebo zobrazením. Nakonec bylo do této retrospektivní kohortové studie zařazeno 60 pacientů (obrázek 9). Demografické a klinické charakteristiky těchto pacientů na začátku studie jsou shrnuty v tabulce 1. Žádný z pacientů neměl na začátku onemocnění ledvin dysfunkci nebo zjevnou proteinurii a žádný nezačal dialyzační léčbu během období sledování. Podle velikosti albuminurie byli pacienti rozděleni do 2 podskupin: skupiny normoalbuminurie a mikroalbuminurie. S výjimkou hladin vylučování albuminu močí (UAE) se tyto 2 podskupiny pacientů statisticky nelišily na začátku ve všech ostatních klinických, biochemických a fyziologických parametrech, včetně trvání diabetu, hladiny glykovaného hemoglobinu, funkce ledvin, krevního tlaku a předepsané léčby. . Po 5 letech sledování prokázalo 29 ze 60 pacientů progresi renálního poškození, která byla definována buď jako $25% snížení odhadované glomerulární filtrace (eGFR) nebo progrese stavu albuminurie, jak je indikováno eskalací závažnosti albuminurie podél různých klinických stadií DN, tj. normoalbuminurie, mikroalbuminurie, mikroalbuminurie nebo zjevná proteinurie. Naproti tomu zbývajících 31 pacientů nevykazovalo žádné známky progrese onemocnění ledvin (obrázek 9). Výchozí údaje pacientů byly stratifikovány podle stavu progrese poškození ledvin po 5 letech sledování (tabulka 2). Pacienti s progresí poškození ledvin ve srovnání s pacienty bez progrese vykazovali významné snížení eGFR a výrazné zvýšení UAE. Ke stanovení, zda byl GSK3b nadměrně exprimován nebo nadměrně aktivován v renálních buňkách a

měřeno za účelem vyhodnocení citlivosti a specificity aktivity GSK3b v močových exfoliovaných buňkách vzhledem k výchozí albuminurii pro predikci progrese poškození ledvin. Jak je znázorněno na obrázku 11, relativní aktivita GSK3b v močových exfoliovaných buňkách, vyjádřená jako poměr p-GSK3b/GSK3b, prokázala vynikající přesnost a sílu při rozlišování pacientů s progresivní poruchou ledvin od pacientů se stabilní funkcí ledvin, s oblastí pod ROC křivka je 0,844 (95procentní interval spolehlivosti, 0,747–0,941; P ¼ 0.001 ), která byla mnohem lepší než plocha pod křivkou ROC pro základní linii Ln(UAE) ({{20}},750; 95procentní interval spolehlivosti, 0,626–0,874). Hraniční hodnota, která maximalizovala Youdenův index, byla 1,24 pro poměr p-GSK3b/GSK3b a 76 mg/24 h pro SAE. Při těchto hraničních hodnotách byla senzitivita a specificita 69 procent a 87,1 procent pro poměr p-GSK3b/GSK3b a 69 procent a 77,4 procent pro Ln (UAE). Kromě toho kombinace poměru p-GSK3b/GSK3b s celkovou hladinou GSK3b v močových exfoliovaných buňkách výrazně zlepšila rozlišovací schopnost, přičemž plocha pod křivkou ROC byla 0,971 (95procentní interval spolehlivosti, 0,931–1.{48} }). Tyto výsledky naznačují, že měření aktivity GSK3b v močových exfoliovaných buňkách může poskytnout mnohem lepší přesnost než UAE v predikci progrese renálního poškození u diabetických pacientů.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 mg/24 h). Močové exfoliované buňky uložené na základní linii byly získány a vyšetřeny imunoblotovou analýzou na GSK3b a p-GSK3b (doplňkový obrázek S4A a B). Aktivita GSK3b byla odhadnuta pomocí denzitometrických poměrů p-GSK3b k celkovému GSK3b pro každý vzorek vzhledem k hodnotě kontrolních vzorků (doplňkový obrázek S4C).

Mezi různými klinickými/biochemickými proměnnými bylo zaznamenáno, že aktivita GSK3b (poměr p-GSK3b/GSK3b) ve výchozích močových exfoliovaných buňkách byla významně vyšší u pacientů, u kterých se vyvinula DKD, než u těch, u kterých se nevyskytla (doplňková tabulka S3). Analýza ROC křivky navíc naznačuje, že relativní aktivita GSK3b (poměr p-GSK3b/GSK3b) v močových exfoliovaných buňkách poskytla vynikající přesnost a sílu při předpovídání vývoje DKD u pacientů s diabetem v raném stádiu (doplňkový obrázek S4D).