Identifikace ACOT13 a PTGER2 jako nových kandidátských genů autozomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin prostřednictvím celého sekvenování Exome

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Na Du¹, Dan Dong³, Luyao Sun¹, Lihe Che¹, Xiaohua Li¹, Yong Liu^2*†a Bin Wang^1*†

Abstraktní

Pozadí:Autosomálně dominantní polycystikaledvinaonemocnění (ADPKD) je nejčastější monogenníledvinaporucha. Polovina pacientů by pomalu progredovala do konečného stádia onemocnění ledvin. Potenciální cíl pro léčbu ADPKD však stále chybí.

Metody:ČtyřiADPKDdo této studie byli zahrnuti pacienti a dva zdraví rodinní příslušníci. Vzorky periferní krve byly získány a testovány celoexomovým sekvenováním (WES). Autozomální mutace u pacientů s ADPKD byly zachovány jako kandidátní místa. Analýza genové ontologie (GO), obohacení Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a interakční sítě protein-protein (PPI) byla provedena pomocí cluster roller R package. Soubor dat obsahující 18 pacientů s ADPKD a tři normální vzorky byl stažen z databáze Gene Expression Omnibus (GEO) a analyzován pomocí balíčku limma R.

Metody:ČtyřiADPKDdo této studie byli zahrnuti pacienti a dva zdraví rodinní příslušníci. Vzorky periferní krve byly získány a testovány celoexomovým sekvenováním (WES). Autozomální mutace u pacientů s ADPKD byly zachovány jako kandidátní místa. Analýza genové ontologie (GO), obohacení Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a interakční sítě protein-protein (PPI) byla provedena pomocí cluster roller R package. Soubor dat obsahující 18 pacientů s ADPKD a tři normální vzorky byl stažen z databáze Gene Expression Omnibus (GEO) a analyzován pomocí balíčku limma R.

Závěry:Prostřednictvím kombinace WES, genové exprese a analýz sítě PPI jsme identifikovali ACOT13 a PTGER2 jako potenciálníADPKD-příbuzné geny.

klíčová slova:Sekvenování celého exomu, genové mutace, polycystickéledvinaonemocnění, ACOT13, PTGER2

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Úvod

Polycystickéledvinaonemocnění (PKD) je skupina monogenních poruch a je častou příčinou konečného stádia onemocnění ledvin. Většina dospělých pacientů je postižena autozomálně dominantní formou (ADPKD), zatímco autozomálně recesivní polycystickáledvinaonemocnění (ARPKD) je vzácnější forma, která se obvykle projevuje perinatálně nebo v raném dětství [1]. Mutace v PKD1 a PKD2, které kódují proteiny polycystin 1 a 2 (PC1 a PC2), jsou nejčastějšími příčinami ADPKD. PC2, kationtový kanál, je členem rodiny iontových kanálů s přechodným receptorovým potenciálem (TRP) [2]. Bylo publikováno, že defekty v PKD2 spouštějí změny v mitochondriálním energetickém metabolismu [3]. role PC1 a PC1PC2 komplexu jsou špatně pochopeny [4]. Ačkoli je PKD zděděna monogenně, je heterogenní ve fenotypu, genu a alele [1] a 7 procentADPKDrodiny jsou geneticky nevyřešené [5]. Navíc molekulární mechanismy, které jsou základemledvinovédysfunkcevyplývající z mutací v genech PKD a fyziologické funkce polycystinových proteinů jsou také stále nejasné [6].

Proteiny 1 a 2 (PC1 a PC2) jsou nejčastějšími příčinami ADPKD. PC2, kationtový kanál, je členem rodiny iontových kanálů s přechodným receptorovým potenciálem (TRP) [2]. Bylo publikováno, že defekty v PKD2 spouštějí změny v mitochondriálním energetickém metabolismu [3]. role PC1 a PC1PC2 komplexu jsou špatně pochopeny [4]. Ačkoli je PKD zděděna monogenně, je heterogenní ve fenotypu, genu a alele [1] a 7 procent rodin ADPKD není geneticky vyřešeno [5]. Kromě toho jsou molekulární mechanismy, které jsou základem renální dysfunkce vyplývající z mutací v genech PKD, a fyziologické funkce polycystinových proteinů také stále nejasné [6].

Zde jsme provedli WES pomocí krevních vzorků čtyř pacientů s ADPKD a dvou zdravých členů rodiny, abychom analyzovali variace jejich genů. Kromě toho byl z databáze Gene Expression Omnibus (GEO) získán datový soubor genové exprese obsahující 18 pacientů s ADPKD a tři normální vzorky. Prostřednictvím integrovaných analýz genové mutace, genové exprese, obohacení funkce genu a interakce protein-protein (PPI) jsme identifikovali dva geny (ACOT13 a PTGER2), které byly potenciálně spojeny s patogenezí ADPKD.

Materiály a metody

Klinické informace

Tato studie byla schválena místní etickou komisí (číslo schválení: 2019-307). V naší nemocnici byl léčen pacient s ADPKD a do této studie bylo zařazeno pět členů této rodiny. Tento pacient měl v anamnéze polycystikuledvina choroba, polycystické onemocnění jater a ledvinové kameny po dobu 13 let (Dodatečný soubor 1: Tabulka S1). Rodokmen této rodiny je znázorněn na obr. 1A. Te N_2 byl tento proband. Te N_4, N_5 a N{7}} byli všichni pacienti s ADPKD (černí), zatímco N_3 a N_1 byli zdraví lidé (bílí) . V naší studii byli celkem čtyři pacienti s ADPKD a dvě zdravé kontroly. Mezi klinické příznaky tohoto probanda patřila horečka, bolesti zad a hematurie. Vyšetření N_2 počítačovou tomografií (CT) odhalilo mnohočetné cysty v játrech a bilaterální polycystické ledvině. Některé léze byly komplexní cysty se změnami v pravém perirenálním výpotku, které měly rozmazané obrysy a zvýšenou hustotu (obr. 1B).

Celé sekvenování exomu

Genomová DNA byla extrahována ze vzorků periferní krve pomocí soupravy pro extrakci DNA (Tiangen Biotech, Peking, Čína) a exomy byly zachyceny pomocí soupravy Agilent SureSelect Human All Exon V6 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) podle pokynů. ze souprav. Sekvenování celého exomu bylo provedeno pomocí přístrojů Illumina Novaseq6000 se čtením párového sekvenování 150-bp. Čtení surového sekvenování byla předzpracována, aby se odstranily nekvalitní báze a čtení pomocí rychlého [11], ultrarychlého all-in-one preprocesoru FASTQ a byly přijaty výchozí parametry. Sekvence byly porovnány s lidským genomem (Build-UCSC hg19) pomocí softwaru BWA (Burrow–Wheeler Aligner, http://bio-bwa.sourceforge.net/). Pomocí softwaru SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/) bylo identifikováno deset, jednonukleotidový polymorfismus (SNP) a inzerce/delece (Indel). Pomocí softwaru ANNOVAR (http://annovar.openbioinformat ics.org/en/latest/user-guide/download/) byla provedena funkční anotace pro identifikované SNP a Indel, aby bylo možné prozkoumat jejich genomické umístění a informace o variacích (Dodatečný soubor 2 : Tabulka S2).

Screening kandidáta SNP/Indel pro ADPKD

Nejprve jsme odstranili mutace s frekvencemi vyššími než 1 procento v alespoň jedné ze čtyř databází (1000g_všechny, esp6500si_všechny, gnomAD_ALL a gnomAD_ EAS). Deset, mutací v exonových nebo sestřihových (10 bp proti směru a po směru od exonu) bylo zachováno. Malé fragmenty (<10 bp)="" non-frameshifting="" indel="" mutations="" in="" the="" repeat="" region="" were="" also="" removed.="" in="" addition,="" mutations="" that="" met="" one="" of="" the="" following="" conditions="" were="" retained:="" (a)="" te="" sites="" that="" were="" considered="" as="" harmful="" by="" at="" least="" half="" of="" the="" four="" software="" sift="" [12],="" polyphen="" [13],="" mutationtaster="" [14],="" and="" cadd="" [15]="" basing="" on="" the="" scores;="" (b)="" mutations="" that="" were="" predicted="" to="" affect="" the="" splicing="" by="" dbscsnv="" [16].="" ten,="" the="" genetic="" mutations="" that="" were="" classified="" into="" pathogenic="" and="" likely="" pathogenic="" ones="" according="" to="" the="" criteria="" and="" guidelines="" for="" grading="" clinical="" significance="" of="" single-gene="" mutations="" of="" american="" college="" of="" medical="" genetics="" and="" genomics="" (acmg,="" https://www.acmg.net/)="" were="" selected="" as="" candidate="" sites.="" for="" the="" screening="" of="" dominant="" genetic="" pattern,="" on="" the="" basis="" of="" mutation="" site="" filtering,="" the="" sites="" showing="" autosomal="" mutations="" in="" adpkd="" patients,="" which,="" however,="" could="" not="" be="" detected="" in="" normal="" controls="" were="" retained="" as="" candidate="">

Funkční obohacení a analýzy PPI

Údaje o profilu exprese mRNA GSE7869 [18] byly staženy z databáze GEO (https://ncbi.nlm. nih.gov/geo), která byla detekována na základě Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array . Soubor dat GSE7869 obsahoval 18 vzorků ADPKD a tři normální vzorky. Údaje o profilu exprese mRNA byly analyzovány pomocí balíčku funkcí limma v R [19]. Diferenciálně exprimované geny (DEG) byly vybrány pomocí prahů absolutní hodnoty diferenciální exprese (|Log2FC|) > 0.5 a P-hodnoty <>

Statistická analýza

Statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru R v3.5.2. P-hodnota < 0.05="" byla="" považována="" za="" statisticky="" významnou="" ve="" všech="" statistických="">

Results

Mutatinaal landscape

Celkový počet SNP v šesti vzorcích byl koncentrován mezi 100,{1}} a 150,000 a byly umístěny hlavně v oblasti intronu, oblasti exonu a intergenové oblasti (obr. 2A). Celkový počet Indelů v šesti vzorcích byl koncentrován mezi 15,{6}} a 20,000 a tyto Indely byly distribuovány hlavně v intronové a intergenové oblasti (obr. 2B). Dále jsme prozkoumali krajinu mutací, které se nacházely v kódující oblasti. V důsledku toho SNP šesti vzorků v kódující oblasti zahrnovaly hlavně anonymní, missense a stop-loss mutace, jejichž kumulativní počet byl téměř 21, 000 (obr. 2C). Části šesti vzorků v oblasti kódování se skládaly hlavně z _vymazání bez posunu a vložení{15}} bez posunu (obr. 2D)

Potenciální mutace a geny pro ADPKD

Šest mutantních genů, včetně AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 a ADAM21, bylo testováno pomocí dominantního genetického vzoru. Byly heterozygotně mutovány ve vzorcích ADPKD, ale nebyly mutovány v normálních vzorcích. U většiny těchto genů nebylo hlášeno, že by souvisely s výskytem ADPKD. Mezitím bylo také vybráno 19 genů podle škodlivosti mutace, včetně MUTYH, USH2A, HBS1L, GLI3, SBDS, SND1, ABCA2, RPS6KA4, FLVCR1, ATIC, SCN11A, ATP6V1A, GLRA1, PRMT4, PKF5, IN a GPR143. Abychom studovali vztah mezi těmito genovými mutacemi a ADPKD, nejprve jsme analyzovali účinky genových mutací na proteiny. V důsledku toho měly všechny tyto geny alespoň jednu mutaci, která by mohla ovlivnit kódování proteinu, což ukazuje na potenciální role těchto mutací (tabulka 1).

Významně obohacené KEGG dráhy a GO termíny potenciálních genů souvisejících s ADPKD

Výsledky analýz obohacení GO a KEGG 25 potenciálních genů spojených s ADPKD jsou uvedeny na obr. 3A (Biologický proces), na obr. 3B (buněčná složka), na obr. 3C (molekulární funkce) a na obr. 3D (KEGG). . GO analýza ukázala, že těchto 25 genů bylo významně obohaceno v biologických procesech (BP) buněčného procesu jednoho organismu a odpovědi na stimul, buněčných komponentách (CC) plazmatické membrány a buněčné periferie a molekulární funkci (MF) vazby aniontů. Kromě toho analýza KEGG dráhy odhalila, že těchto 25 genů bylo obohaceno hlavně o signální dráhy a dráhy cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP) a dráhy u rakoviny.

ACOT13 a PTGER2 mohou být kandidátní geny spojené s ADPKD

Analýza sítě PPI byla provedena za účelem prozkoumání asociace mezi 25 potenciálními geny souvisejícími s ADPKD. Jak je znázorněno na obr. 3E, většina těchto genů byla v síti nezávislá. ACOT13 měl přímou interakci s SBDS i ATIC; Předpokládalo se, že PTGER2, ADCY4 a INSL3 budou vzájemně interagovat (obr. 3E). A co víc, ACOT13, PTGER2 a ADCY4 byly geny, které mutovaly pouze u pacientů s ADPKD. na základě údajů o expresi stažených z databáze GEO jsme porovnali hladiny exprese ACOT13, PTGER2 a ADCY4 mezi pacienty s ADPKD a normálními kontrolami. Ve srovnání s normálními kontrolami byla hladina exprese ACOT13 významně nižší u pacientů s ADPKD (obr. 4A), zatímco PTGER2 vykazoval vyšší hladinu exprese u pacientů s ADPKD (obr. 4B). ADCY4 nevykazoval významný rozdíl v expresi mezi pacienty s ADPKD a normálními vzorky (obr. 4C). Kombinací informací jsme spekulovali, že ACOT13 a PTGER2 by mohly být kandidátní geny spojené s ADPKD.

Diskuse

ADPKD je způsobena mutací v jednom ze dvou genů-78 procent případů je způsobeno mutací v PKD1 na chromozomu 16 a 15 procent případů je způsobeno mutací v PKD2 na chromozomu 4 [20]. Cystická onemocnění ledvin se také nazývají ciliopatie. Proteiny Te PC1 a PC2, kódované PKD1 a PKD2, jsou oba umístěny na primární řasence a fungují jako průtokové senzory v ledvinách [21]. V této studii byla škodlivá mutace v PKD1, stejně jako dalších 18 známých škodlivých genů, detekována ve vzorcích pacientů s ADPKD. Kromě toho bylo šest mutantů, včetně AGRN, ACOT13, ADCY4, HEATR5A, PTGER2 a ADAM21, testováno pomocí dominantního genetického vzoru a většina z nich nebyla dříve rozpoznána jako patogenní geny související s ADPKD.

Patogenní proteiny v ADPKD jsou zodpovědné především za přenos informací z vnějšího prostředí do buněk [22]. Analyzovali jsme potenciální funkce 25 identifikovaných genů pomocí analýz obohacení GO a KEGG. Výsledky ukázaly, že BP buněčného procesu jednoho organismu, reakce na stimul, stejně jako CC plazmatické membrány a buněčné periferie byly významně obohaceny. Kromě toho mohou buňky ADPKD posunout svůj způsob produkce energie z oxidativní fosforylace na jiné dráhy a tyto změny v buněčném metabolismu se ukázaly jako charakteristický znak ADPKD [6]. Změny v modulaci produkce a využití energie v ADPKD jsou závislé na několika vnitřních buněčných signálních drahách, jako je AMP-aktivovaná proteinkináza (AMPK), kalciová signalizace na membránách asociovaných s mitochondriemi, savčí cíl rapamycinového komplexu 1 (mTORC1), cAMP a transport iontů zprostředkovaný transmembránovým regulátorem vodivosti cystické fibrózy (CFTR) [23, 24]. Zde byla signální dráha cAMP identifikována jako významně obohacená v těchto vzorcích ADPKD. Tyto výsledky podporují spolehlivost mutací, které jsme zkoumali. Mezitím, přestože funkční informace byly částečně odhaleny analýzou obohacení, další podrobnosti o 25 identifikovaných genech si v budoucnu zasloužily další průzkum v ADPKD.

Analýzy PPI a diferenciální exprese ukázaly, že ve srovnání s normálními lidmi byly ACOT13 a PTGER2 mutovány a odlišně exprimovány u pacientů s ADPKD a mohly by být potenciálními geny spojenými s ADPKD. Protein ACOT13 je členem enzymů acyl-CoA thioesteráz (Acts), které katalyzují reakci hydrolýzy mastných acyl-CoA molekul na volné mastné kyseliny plus CoASH. ACOT13 je obohacen o oxidativní tkáně a je spojen s mitochondriemi [25]. Lin a kol. uvedli, že PC1 ovlivnil morfologii a funkci mitochondrií, což může hrát klíčovou roli v regulaci mitochondriální funkce a buněčného metabolismu [26]. Pokud je nám známo, neexistují zprávy o vztahu mezi ACOT13 a ADPKD. Exprese PTGER2 ovlivňuje biologické chování různých typů maligních nádorů [27–29], což by mělo souviset s obohacením cest u rakoviny v KEGG analýze. Jinak úloha prostaglandinu E (2) (PGE2) v cystogenezi u geneticky neortologních modelů ADPKD již byla studována. Liu a kol. zjistili, že PGE2 může aktivovat aberantní signální dráhy v PC-1-deficientním epitelu a zprostředkovat proliferaci a sekreci chloridů v ADPKD cystickém renálním epitelu [30]. Elberg a kol. naznačili roli PTGER2 při zprostředkování účinku PGE2 na indukci tvorby cysty pomocí kombinovaných biochemických, farmakologických a funkčních analýz u ADPKD [31]. To dále potvrzuje spolehlivost našeho přístupu ke screeningu patogenních genů u ADPKD, který může být použitelný u jiných onemocnění. Nepřímo také podporuje spolehlivost ACOT13 jako potenciálního genu souvisejícího s ADPKD. Základní biologická funkce ACOT13 v ADPKD však stále vyžaduje další studie.

Závěry

V této studii jsme identifikovali dva potenciální geny související s ADPKD, včetně ACOT13 a PTGER2, analýzou výsledků WES čtyř pacientů s ADPKD a dvou zdravých členů rodiny v kombinaci s daty genové exprese z databáze GEO. Naše výsledky mohou být užitečné pro další studie základních patologických příčin ADPKD. Vzhledem k malému počtu pacientů v naší studii však zůstává určitá nejistota ohledně potenciální role ACOT13 a PTGER2, což si stále vyžaduje další studie.

Reference

1. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, Horie S, Peters DJM, Torres VE. Polycystické onemocnění ledvin. Nat Rev Dis Primers. 2018;4(1):50. https://doi. org/10.1038/s41572-018-0047-r.

2. Grieben M, Pike AC, Shintre CA, Venturi E, El-Ajouz S, Tessitore A, Shrestha L, Mukhopadhyay S, Mahajan P, Chalk R, et al. Struktura polycystického onemocnění ledvin TRP kanál Polycystin-2 (PC2). Nat Struct Mol Biol. 2017;24(2):114–22.

3. Chumley P, Zhou J, Mrug S, Chacko B, Parent JM, Challa AK, Wilson LS, Berryhill TF, Barnes S, Kesterson RA, et al. Zkrácení PKHD1 a

PKD2 mutace mění energetický metabolismus. Am J Physiol Renální Physiol. 2019;316(3): F414–25.

4. Kim DY, Park JH. Genetické mechanismy ADPKD. Adv Exp Med Biol. 2016;933:13–22.

5. Cornec-Le GE, Olson RJ, Besse W, Heyer CM, Gainullin VG, Smith JM, Audrezet MP, Hopp K, Porath B, Shi B a kol. Monoalelické mutace DNAJB11 způsobují atypické autosomálně dominantní polycystické onemocnění ledvin. Am J Hum Genet. 2018;102(5):832–44.

6. Padovano V, Podrini C, Boletta A, Caplan MJ. Metabolismus a mitochondrie ve výzkumu a terapii polycystických ledvin. Nat Rev Nephrol. 2018;14(11):678–87. https://doi.org/10.1038/s41581-018-0051-1.

7. Bergmann C. Nedávné pokroky v molekulární diagnostice polycystických ledvin. Expert Rev Mol Diagn. 2017;17(12):1037–54. https://doi. org/10.1080/14737159.2017.1386099.

8. Yang Y, Muzny DM, Xia F, Niu Z, Osoba R, Ding Y, Ward P, Braxton A, Wang M, Buhay C a kol. Molekulární nálezy mezi pacienty odeslanými ke klinickému sekvenování celého exomu. JAMA. 2014;312(18):1870–9.

9. Mallawaarachchi AC, Hort Y, Cowley MJ, McCabe MJ, Minoche A, Dinger ME, Shine J, Furlong TJ. Sekvenování celého genomu překonává pseudogenovou homologii pro diagnostiku autozomálně dominantního polycystického onemocnění ledvin. Eur J Hum Genet. 2016;24(11):1584–90. https://doi.org/10.1038/ ejhg.2016.48.

10. Braun DA, Schueler M, Halbritter J, Gee HY, Porath JD, Lawson JA, Airik R, Shril S, Allen SJ, Stein D, et al. Sekvenování celého exomu identifikuje kauzativní mutace ve většině konsangvinických nebo rodinných případů se zvýšenou renální echogenitou začínající v dětství. Kidney Int. 2016;89(2):468–75.

11. Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. rychlý: ultrarychlý all-in-one FASTQ preprocesor. Bioinformatika. 2018;34(17):i884–90.

12. Kumar P, Henikof S, Ng PC. Predikce účinků kódování nesynonymních variant na funkci proteinů pomocí algoritmu SIFT. Nat Protoc. 2009;4(7):1073–81.

13. Flanagan SE, Patch AM, Ellard S. Použití SIFT a PolyPhen k predikci mutací ztráty funkce a zisku funkce. Biomarkery Genet Test Mol. 2010;14(4):533–7.

14. Schwarz JM, Rodelsperger C, Schuelke M, Seelow D. MutationTaster hodnotí potenciál sekvenčních změn způsobujících onemocnění. Metody Nat. 2010;7(8):575–6.

15. Itan Y, Shang L, Boisson B, Ciancanelli MJ, Markle JG, Martinez-Barricarte R, Scott E, Shah I, Stenson PD, Gleeson J, et al. Mezní význam mutace: prahové hodnoty na úrovni genů pro variantní predikce. Metody Nat. 2016;13(2):109–10.

16. Liu X, Wu C, Li C, Boerwinkle E. dbNSFP v3.0: komplexní databáze funkčních předpovědí a anotací pro lidské nesynonymní a sestřihové SNV. Hum Mutat. 2016;37(3):235–41.