Část 1|Genetická variace implikuje plazmatický angiopoetin-2 ve vývoji subfenotypů akutního poškození ledvin

Pavan K. Bhatraju1,2*, Max Cohen1, Ryan J. Nagao3,4, Eric D. Morrell1, Susanna Kosamo1, Xin-Ya Chai1, Robin Nance5, Victoria Dmyterko1, Joseph Delaney5, Jason D. Christie6, Kathleen D. Liu7, Carmen Mikacenic1, Sina A. Gharib1, W. Conrad Liles8, Ying Zheng3,4, David C. Christiani9,10, Jonathan Himmelfarb2 a Mark M. Wurfel1,2

Abstraktní

Pozadí:Dříve jsme identifikovali dvaakutníledvinazranění(AKI) subfenotypy (AKI-SP1 a AKI-SP2) s různým rizikem špatných klinických výsledků a odpovědí na vazopresorickou terapii. Plazmatické biomarkery endoteliální dysfunkce (receptor tumor nekrotizujícího faktoru-1, angiopoetin-1 a 2) diferencovaly subfenotypy AKI.

Není však známo, zda jsou tyto biomarkery jednoduše markery nebo kauzálními mediátory ve vývoji subfenotypů AKI.

Metody:Testovali jsme asociace mezi jednonukleotidovými polymorfismy v rámciAngiopoetin-1, Angiopoetin-2,aReceptor nádorového nekrotického faktoru 1Agenů a AKI-SP2 u 421 kriticky nemocných jedinců evropského původu. Nejvýkonnější jednonukleotidové polymorfismy (FDR < 0.05)="" byly="" testovány="" na="" expresi="" cis-biomarkerů="" a="" na="" to,="" zda="" je="" genetické="" riziko="" pro="" aki-sp2="" zprostředkováno="" prostřednictvím="" cirkulujících="" biomarkerů.="" dokončili="" jsme="" také="" studie="" in="" vitro="" s="" použitím="" mikrovaskulárních="" endoteliálních="" buněk="" lidské="" ledviny.="" nakonec="" jsme="" vypočítali="" renální="" clearance="" plazmatických="" biomarkerů="" pomocí="" 20="" různých="" časovaných="" sběrů="">

Výsledek:Genetická varianta, rs2920656C > T, blízkoANGPT2byla spojena se sníženým rizikem AKI-SP2 (poměr šancí, 0,45; 95procentní CI, 0,31–0,66; upravená FDR=0,003 ) a snížený plazmatický angiopoetin-2 (p = 0.002). Kauzální inferenční analýza ukázala, že pro každou minoritní alelu (T) se riziko rozvoje AKI-SP2 snižuje o 16 procent. Plazmatický angiopoetin-2 zprostředkovával 41,5 procenta rizika souvisejícího s RS2920656 pro AKI-SP2. Mikrovaskulární endoteliální buňky lidské ledviny nesoucí T alelu rs2920656 produkovaly numericky nižší hladiny angiopoetinu-2, i když to nebylo statisticky významné (p = 0.07). Analýzy nakonec ukázaly, že angiopoetin-2 je u kriticky nemocných subjektů skutečně vylučován minimálně.

Závěr:Analýza genetického zprostředkování poskytuje podpůrný důkaz, že angiopoetin-2 hraje kauzální roli v riziku AKI-SP2.

klíčová slova: Akutní poškození ledvin, Genetika, Endotel

Pro více informací prosím kontaktujte:emily.li@wecistanche.com

Cistanche deserticola zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Pozadí

Akutníledvinazranění(AKI) postihuje 40–60 procent pacientů přijatých na jednotku intenzivní péče (JIP) a přispívá ke špatným krátkodobým i dlouhodobým výsledkům. Dosavadní genetické studie se zaměřovaly na asociace mezi genetickými variantami a rizikem pro AKI srovnávající případy (AKI) s kontrolami (bez AKI). Tento rámec však může být omezen, protože případyAkutníledvinazraněníjsou vysoce heterogenní s různými srážecími látkami a biologickými profily. Kombinace takových pacientů s AKI za účelem maximalizace velikosti vzorku může vést k ředění genetických statistických signálů, které mohou být přítomny pouze v jedné patofyziologicky odlišné podskupině populace AKI. Dalším omezením je, že AKI u kriticky nemocných populací je často komplikací vážných inzultů, jako je sepse, operace, šok, zápal plic a trauma. Použití ovládacích prvků bez vývojeAkutníledvinazraněnímůže být problematické. Kontroly nesoucí vysoce rizikovou genetickou variantu nemusí vyvinout AKI, pokud také nezažijí podobné akutní poškození jako případy, a proto by byly klasifikovány jako nepřípady, což by zeslabilo jakýkoli potenciální asociační signál. Použití biologicky odlišných subfenotypů AKI ve studiích genetické asociace překonává předchozí omezení ve fenotypování AKI tím, že se specificky zaměřuje na populaci AKI a srovnává dva biologicky odlišné subfenotypy.

Nedávno jsme identifikovali dva subfenotypy AKI (AKI-SP1 a AKI-SP2) aplikací metodologie analýzy latentních tříd na panel 29 klinických a biomarkerových proměnných ve dvou nezávislých kriticky nemocných populacích AKI. Je pozoruhodné, že AKI-SP2 byl spojen s horšími výsledky v nemocnici (např. mortalita, nová dialýza a 7-denní neobnovení ledvin) ve srovnání s AKI-SP1. Dále jsme identifikovali tyto subfenotypy AKI v dříve dokončené multicentrické randomizované kontrolní studii Infuze vazopresinu versus norepinefrin u pacientů se septickým šokem (VASST). Studie VASST zkoumala, zda volba vazopresorické terapie zlepšila mortalitu u subjektů se septickým šokem. Zatímco populace AKI v klinické studii neměla žádný rozdíl v mortalitě z vasopresorické terapie, AKI-SP1 měla mortalitu s vasopresinem ve srovnání s AKI-SP2 bez rozdílu v mortalitě. Pokud je nám známo, toto je první příklad identifikace podskupin AKI reagujících na léčbu u kriticky nemocných.

Je pozoruhodné, že žádná jednotlivá proměnná nebyla statisticky lepší než ostatní proměnné pro identifikaci AKI-SP2 (tabulka 1). Naproti tomu tříproměnný model využívající plazmatický angiopoetin-2 (ANG-2), angiopoetin-1 (ANG-1) a solubilní receptor tumor nekrotizujícího faktoru{{8 }} (sTNFR-1), měl optimální prediktivní výkon pro rozlišeníAkutníledvinazraněnísubfenotypy (C-statistika 0.93). Nižší ANG-2, nižší sTNFR-1 a vyšší ANG-1 byly spojeny s nižším rizikem AKI-SP2. Studie na zvířecích modelech AKI ukázaly, že tyto plazmatické biomarkery se účastní

patofyziologie a závažnost AKI. Není však známo, zda tyto plazmatické biomarkery hrají kauzální roli ve vývoji klinickýchAkutníledvinazraněnísubfenotypy. Identifikace kauzálních markerů by mohla poskytnout informace o cílech pro vývoj léku, aby bylo možné zabránit nebo léčit vývojAkutníledvinazraněníu kriticky nemocných a mohl by pomoci při stratifikaci rizika pacientů.

Analýza genetické mediace je jedním z několika kauzálních inferenčních přístupů, které mohou identifikovat potenciální mechanismus, kterým nezávislá proměnná (např. genetická varianta) ovlivňuje výsledek (např. subfenotypy AKI) prostřednictvím vysvětlujícího mediátoru (např. biomarker endoteliální dysfunkce) . Tento přístup byl široce používán v klinických datech k pochopení kauzálních mechanismů onemocnění. Předpokládali jsme, že cis-kvantitativní lokusy rysů (QTL) vANGPT1, ANGPT2 a TNFRSF1Ageny ovlivňují vývoj subfenotypů AKI regulací cirkulujících hladin jejich příslušných biomarkerů (ANG-1, ANG-2 nebo sTNFR-1).

Metody

Studijní populace

Již dříve jsme informovali o identifikaci subfenotypů AKI pomocí prospektivně shromážděné kohorty na JIP: identifikace jednonukleotidových polymorfismů (SNP) predisponujících ke změněnému riziku akutního poškození plic (iSPAAR). Populace iSPAAR je celogenomová případová-kontrolní studie rizika syndromu akutní respirační tísně (ARDS), která zahrnovala pacienty s ARDS i bez ARDS. Populace iSPAAR zahrnovala subjekty z dříve dokončených randomizovaných kontrolních studií a z prospektivně zařazené kohorty na JIP. Podrobnosti návrhu studie pro každou populaci zařazenou do iSPAAR byly popsány dříve; Albuterol pro léčbu akutního poškození plic (ALTA), zkouška tekutinou a katétrem (FACTT), enterální omega{3}} mastná kyselina, kyselina gama-linolenová a antioxidační suplementace při akutním poškození plic (OMEGA)

a Molekulární epidemiologie akutní respirační tísně (MEA) ve Všeobecné nemocnici v Massachusetts. V rámci iSPAAR došlo k zařazení do studie 48 hodin po přijetí na JIP. Při zařazení do studie byly odebrány DNA a plazma pro genotypizaci a analýzu biomarkerů a následněAkutníledvinazraněnízjištění. AKI byla definována jako zvýšení sérového kreatininu (SCr) větší nebo rovné 0,3 mg/dl nebo 50 procent od "základní" SCr. Výchozí SCr byl definován jako nejnižší hodnota před zařazením do studie. AKI byla také definována pomocí modifikovaných kritérií pro výdej moči (denní výdej místo každých 6 hodin).

Abychom určili renální clearance plazmatických biomarkerů, zařadili jsme prospektivní kohortu na harborviewské lékařské a chirurgické jednotky intenzivní péče, Critical IllnessAkutníledvinazraněníkohorta (CIA). Subjekty byly způsobilé pro zařazení, pokud splnily 2 ze 4 kritérií syndromu systémové zánětlivé odpovědi, měly klinicky podezření na infekci a měly zavedený močový katétr. Byl dokončen časovaný sběr moči, který trval alespoň 2–4 hodiny, a vzorky plazmy EDTA byly odebrány na začátku a na konci časovaného sběru moči. Clearance byla vypočtena pomocí vzorce Clearance(X) = U(X) * V/ P(X), kdeU(X) představuje koncentraci rozpuštěné látky v močiX, V udává objem moči za období sběru 2–4-h aP (X) představuje průměrné plazmatické koncentrace rozpuštěné látkyX z počátečních a konečných odběrů krve.

Genotypizační strategie

Genotypizace byla provedena u 421 pacientů evropského původu pomocí platformy Illumina 660 (Illumina, San Diego, CA). Genotypizovaná data byla kvalitativně kontrolována pomocí vzorového filtru četnosti volání > 0,97, frekvence vedlejších alel (MAF) > 0,01 a frekvence volání SNP > 0,95. Po kontrole kvality bylo 238 SNP ±50 kilobázíANGPT1, ANGPT2,aTNFRSF1Abyly nalezeny. Po navázání nerovnováhy (LD) prořezávání r²z {{0}}.8 bylo odstraněno 48 SNP, což vedlo k celkem 190 SNP použitým v asociačních testech. Imputace byla provedena pomocí referenčního panelu projektu 1000 Genomes pomocí IMPUTE2 v2.3.0.

Stanovení plazmatických bílkovin

Plazmatické a močové biomarkery byly měřeny pomocí elektrochemiluminiscenčních imunotestů (Meso Scale Discovery (MSD), Rockville, MD), jak bylo popsáno dříve. Krev byla odebrána do sterilních zkumavek ošetřených EDTA, moč byla shromážděna do sterilních nádob a obě byly okamžitě odstředěny. Plazma a moč byly poté rozděleny na alikvoty a zmraženy na -80 stupňů. Vzorky byly skladovány po různou dobu, ale byly rozmraženy v jediné dávce a pouze jednou pro provedení měření biomarkerů pro tuto studii. Všechna měření biomarkerů byla provedena v duplikátech v Harborview Pulmonary Research Laboratories.

In Silico analýzy

Abychom otestovali SNP na expresi QTL efektů, dotazovali jsme se na portál Genotype-Tissue Expression (GTEx).

Buněčná kultura

Lidské ledvinové mikrovaskulární endoteliální buňky (HKME Cs) byly purifikovány z fetálních ledvin po dobrovolném přerušení těhotenství mezi 100 a 135 dny po početí. Od pacientek byl získán informovaný souhlas s použitím fetálních tkání. Poté jsme náhodně vybrali 9 různých dárců HKMEC, rozmrazili a umístili půl milionu buněk do lahví T25 potažených 0,2% želatinou a udržovaných v EBM-2 bazálním médiu obsahujícím 1% antibiotika-antimykotika (Life Technologies), 10% FBS, 100 ug/ml ECGS, 50 ug/ml heparinu a 20 ng/ml VEGF (R&D), po dobu 48 hodin do konfluence. Po 48 hodinách jsme purifikovali genomovou DNA z HKMEC a shromáždily se buněčné supernatanty. Úspěšně jsme genotypovali buňky od 8 dárců.

Statistická analýza

Demografické proměnné pacientů jsou uváděny buď jako průměr plus /- standardní odchylka nebo jako medián a kvartily. Nejprve jsme použili logistickou regresi k testování asociace mezi 190 SNP a vývojem AKI-SP2 ve srovnání s AKI-SP1 pomocí aditivního genetického modelu (Golden Helix, MT). Náš model byl použit pro následující kovariáty: věk, pohlaví, sepsi a prvních pět hlavních složek. K výpočtu hlavních složek byla použita metoda Eigenstrat v4.2 a prvních pět bylo zahrnuto jako kovariáty. Poměry šancí (OR) jsou hlášeny s 95procentním intervalem spolehlivosti. Pro analýzu mezi genetickými variantami a subfenotypy AKI jsme provedli korekci na vícenásobná srovnání pomocí Benjaminiho-Hochbergova prahu falešného objevu (FDR) < 0,10,="" který="" odhaduje,="" že="" méně="" než="" 10="" procent="" asociací="" s="" hodnotou="" fdr="" na="" nebo="" nižší="" tato="" hladina="" je="" falešně="" pozitivní="" [31].="" v="" analýze="" citlivosti="" byl="" imputovaný="" genotyp="" použit="" k="" identifikaci="" dalších="" snp="" spojených="" s="">

Za druhé jsme použili lineární regresní úpravu podle věku, pohlaví a sepse, abychom určili asociace mezi nejvýkonnějšími SNP a log₂transformované koncentrace biomarkerů. Za třetí jsme dokončili kauzální inferenční analýzu, abychom otestovali asociaci mezi genetickými variantami a AKI-SP2 a potenciální zprostředkování asociace koncentracemi plazmatických biomarkerů. Mediační analýza byla provedena pomocí nelineární implementace modelování strukturních rovnic implementovaného v mediačním balíčku pro STATA [32, 33]. Další podrobnosti o kauzální inferenční analýze jsou uvedeny v online příloze. Za čtvrté, určili jsme asociace mezi genetickými variantami a závažností AKI, měřenou maximálním sérovým kreatininem, pomocí logistické regrese. Další podrobnosti o materiálech a metodách jsou uvedeny v online příloze. V analýze jsme hodnotili 190 SNP a použili jsme konzervativníp-hodnotaz 0,05/190 =2,6 × 10^{− 4}. Vzhledem k tomu, že přibližně u 40 procent pacientů na JIP se rozvine AKI a poměr očekávané kontroly (AKI-SP1) k případu (AKI-SP2) je 1,5, očekávaná velikost vzorku 421 a MAF alespoň { {16}}.30, budeme mít 81% schopnost detekovat relativní riziko 1,5 nebo vyšší [34]. Analýzy byly dokončeny pomocí STATA (verze 15) a Goldenhelix (verze 4.0). Všechny studie byly schváleny Human Subjects Division na University of Washington. Od všech zapsaných subjektů byl získán písemný informovaný souhlas.

Výsledek

Charakteristika populací Ze 425 pacientů z validační kohorty v naší předchozí práci mělo 421 k dispozici genotypizační údaje. Demografie a základní klinické charakteristiky jsou popsány v tabulce 1. Všichni jedinci byli evropského původu. Celkem 267 (63 procent) bylo klasifikováno jako AKI-SP1 a 154 (37 procent) jako AKI-SP2. Subjekty, u kterých se vyvinul AKI-SP2, měly při prezentaci vyšší závažnost onemocnění (průměrné skóre akutní fyziologie a chronického zdravotního stavu (APACHE) III, 111 ± 26 vs. 74 ± 24), měli vyšší pravděpodobnost sepse (84 procent vs. 66 procent) a byli častěji léčeni vazopresory (79 procent oproti 42 procentům) ve srovnání s AKI-SP1.

Genetická variace poblíž ANGPT2, rs2920656, je spojena s AKI-SP2

Z 190 SNP ±50 kilobází genů bylo 72 blízko ANGPT1, 100 bylo blízko ANGPT2 a 18 bylo blízko genu TNFRSF1A. Identifikovali jsme jeden SNP splňující FDR < 0,05,="" který="" byl="" spojen="" s="" aki-sp2="" ve="" srovnání="" s="" aki-sp1="" (tabulka="" 2="" a="" obr.="" 1).="" nebyly="" pozorovány="" žádné="" významné="" asociace="" s="" snp="" v="" nebo="" v="" blízkosti="" angpt1="" nebo="" tnfrsf1a="" (tabulka="" s2="" a="" s3).="" snp="" prokazující="" nejsilnější="" souvislost="" s="" rizikem="" pro="" aki-sp2="" byl="" rs2920656="" (or,="" 0,45;="" 95%="" ci,="" 0,31–0,66;="" p="">< 1,4="" ×="" 10-5;="" fdr="0,003)." tento="" intronický="" snp="" je="" ≈="" 30="" kb="" downstream="" k="" 3′="" pozici="" angp="" t2="" a="" vysvětluje="" přibližně="" 3="" procenta="" rozptylu="">

vývoj AKI-SP2 (R2). Protože pouze malý počet subjektů byl homozygotní rs2920656 (n=26), testovali jsme také asociace mezi rs2920656 a AKI-SP2 v dominantním genetickém modelu, který poskytl konzistentní výsledky (OR, 0,42; 95procentní CI, 0,28–0,64; p < 1,4="" ×="" 10–6).="" také="" jsme="" testovali="" další,="" potenciálně="" silnější,="" asociace="" v="" lokusu="" angpt2="" pomocí="" imputovaných="" genotypů,="" ale="" nenašli="" jsme="" žádné="" asociace="" silnější="" než="" asociace="" pozorované="" u="" rs2920656="" (tabulka="" s4).="" v="" analýze="" citlivosti="" jsme="" testovali,="" zda="" zařazení="" kriticky="" nemocných="" pacientů="">Akutníledvinazraněníovlivní genetickou asociaci. Seskupili jsme pacienty bez AKI a AKI-SP1 dohromady a určili jsme, zda rs2920656 stále silně souvisí se sníženým rizikem AKI-SP2. V této analýze 839 pacientů nemělo buď žádnou AKI, nebo AKI-SP1 a 154 mělo AKI-SP2. Riziko opětovného rozvoje AKI-SP2 bylo významně sníženo s alespoň jednou T alelou pro rs2920656 (OR 0.31; 95% CI, 0.19–0.52; p < 0,001)="" (tabulka="" s5).="" v="" další="" analýze="" citlivosti="" jsme="" testovali,="" zda="" byl="" rs2920656="" spojen="" se="" sníženým="" rizikem="" aki-sp2="" v="" každé="" ze="" čtyř="" různých="" studií,="" které="" byly="" zahrnuty="" do="" ispaar.="" v="" každé="" ze="" tří="" randomizovaných="" kontrolních="" studií="" (alta,="" factt="" a="" omega)="" a="" prospektivní="" kohorty="" na="" jip="" (mea)="" byl="" bodový="" odhad="" v="" souladu="" s="" minoritní="" alelou="" rs2920656,="" což="" prokazuje="" snížené="" riziko="" rozvoje="" aki-sp2="" (tabulka="" s6="" ).="" proto="" byl="" rs2920656="" dále="" analyzován,="" aby="" se="" určila="" souvislost="" s="" koncentracemi="" biomarkerů="" v="">

Alela T rs2920656 je spojena se sníženým plazmatickým ANG-2

Dále jsme analyzovali souvislost mezi rs2920656 a plazmatickými koncentracemi ANG-2. Po úpravě podle věku, pohlaví a sepse byla každá kopie T alely rs2920656 spojena se sníženými log2 plazmatickými koncentracemi ANG-2 (= − 0,09; 95% CI {{9} },15, − 0,04; P=0,002). Subjekty homozygotní pro alelu C vykazovaly nejvyšší koncentrace plazmatického ANG-2 (40 683 pg/ml; interkvartilní rozsah (IQR) 19,374-73,205), zatímco subjekty homozygotní pro alelu T vykazovaly nejnižší plazmatické koncentrace ANG-2 (28 308 pg/ml (IQR 14,340-42, 944). Navíc ze 100 testovaných SNP poblíž oblasti genu ANGP T2 byl rs29206565 nejsilněji spojen s plazmatickým ANG -2 koncentrace (obr. 2).

Analýza mediace naznačuje, že ANG-2 je kauzální ve vývoji AKI-SP2

Testovali jsme důkaz, že souvislost mezi rs2920656 a rizikem pro AKI-SP2 je zprostředkována plazmatickými koncentracemi ANG-2 (obr. 3). Celkový účinek rs2920656 na AKI-SP2 byl celkem=− 0,16 na alelu (95 procent CI -0,24, − 0 .10, p=1.0 × 10− 4), což naznačuje, že pro každou vedlejší alelu (alelu T) genetické varianty se riziko rozvoje AKI-SP2 snižuje o 16 procent. Analýza kauzálního zprostředkování detekovala významný nepřímý účinek pro rs2920656 na AKI-SP2, který byl zprostředkován prostřednictvím plazmatických koncentrací ANG-2 (nepřímý, − 0,07 na alelu; 95% CI -0,11, − 0,03; p { {34}}.001), což znamená, že podíl účinku mezi rs2920656 a AKI-SP2, který je zprostředkován koncentracemi ANG-2, je 41,5 procenta.

Alela T rs2920656 je spojena se sníženou závažností AKI po 7 dnech

Dále jsme testovali spojení rs2920656 s tradičními kritérii závažnosti AKI, jako je maximální sérový kreatinin a zvýšení sérového kreatininu do 7 dnů po zařazení do studie. V dominantním genetickém modelu byla alela T rs2920656 spojena s poklesem sérového kreatininu o − 0,44 mg/dl (95 procent CI, − 0,77 , − 0.10), p=0.01) po úpravě podle věku, pohlaví, indexu tělesné hmotnosti a stavu sepse. Menší alela rs2920656 byla také spojena s poklesem vzestupu sérového kreatininu mezi výchozí hodnotou a dnem 7 (= − 0,25, 95 procent CI, − 0,46, − 0,03; p=0,03)

Alela T rs2920656 je spojena s nižším ANG-2 v buněčné kultuře

Provedli jsme in vitro experimenty a in silico analýzy, abychom určili funkční význam rs2920656. Z 8 různých lidských plodůledvinatkáňvzorky, 2 byly CC, 5 bylo CT a 1 byl TT pro rs2920656. V dominantním genetickém modelu byly koncentrace ANG-2 numericky nejvyšší v endoteliálních buňkách od dárců homozygotních pro alelu C a nižší u nositelů alely T, p=0,07 (obr. 4). V databázi projektu GTEx nebyl rs2920656 spojen s expresí genu ANGPT2. Nicméně dva další SNP (rs41311412 a rs2515591), které jsou ve střední LD (r2=0.23 a D'=0.86) s rs2920656, byly spojeny se sníženou expresí genu ANGPT2 (p=4.1 × 10− 5 ) v tibiální tepně, tkáni, která je vysoce obohacena o endoteliální buňky (tabulka S7).

Plazma ANG-2 je minimálně vylučována ledvinami, aby se zjistilo, zda rozdíly vledvinafunkcemohl ovlivnit plazmatické koncentrace ANG{{0}}}, měřili jsme renální clearance ANG-2 u kriticky nemocných subjektů s a bez AKI. U 20 různých časovaných odběrů vzorků moči se zaknihovanými vzorky plazmy byl medián sérového kreatininu 0.86 mg/dl s interkvartilním rozsahem (IQR) 0,69 až 1,45 mg/dl. Střední plazmatická koncentrace ANG-2 byla 10 261 pg/ml (IQR 6210–19 115 pg/ml). Naproti tomu koncentrace ANG-2 v moči byly 50-krát nižší s mediánem 206 pg/ml (IQR 11–839 pg/ml). Vypočtená renální clearance ANG-2 byla < 1="" ml/min="" pro="" všechny="" časované="" sběry="" moči,="" což="" naznačuje,="" že="" plazmatické="" koncentrace="" ang-2="" se="" nezvyšují="" jednoduše="" jako="" funkce="" zhoršení="" aki="" (tabulka="">