Část 1: Stanovení souběžného experimentálního modelu osteoporózy v kombinaci s Alzheimerovou chorobou u potkanů a dvojí účinky echinakosidu a akteosidu z Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSTRAKTNÍ
Etnofarmakologický význam: Cistanche tubulosaje vzácná tradiční čínská medicína, která se široce používá při léčbě osteoporózy aAlzheimerova choroba. Echinakosida akteosid jsou hlavními aktivními složkami v Cistanche tubulosa, které mají farmakologické aktivity s výzkumnou hodnotou. Bylo hlášeno, že echinakosid aakteosidmůže zlepšit schopnost učení a paměti, podporovat proliferaci a diferenciaci osteoblastů. Cíl studie: Echinakosid a akteosid zCistanche tubulosaprokázaly významné účinky proti osteoporóze a proti Alzheimerově chorobě, zatímco tyto účinky nebyly studovány současně na krysím modelu. Cílem této studie bylo vytvořit a ověřit model kombinované osteoporózyAlzheimerova chorobau krys a zkoumat dvojí účinkyechinakosida akteosid na tomto souběžném modelu.
Materiály a metody:Současně byly nastaveny tři modelové skupiny ovariektomie (OVX), falešné operace s D-galaktózou a AlCl3 (D), ovariektomie s D-galaktózou a AlCl3 (OVX plus D). Potkani ve skupinách léčených léky byly odstraněny ovariektomie. Při provádění intraperitoneální injekce D-galaktózy a intragastrického podávání AICI3 u potkanů ve skupinách léčených léčivem byly potkanům podávány perorálněechinakosid(90 mg/kg/den),akteosid(90 mg/kg/den) a pozitivní kontrolní léky estradiolvalerátu (0,6 mg/kg/d), donepezil HCl (0,8 mg/kg/d), v tomto pořadí. Po 8týdenní léčbě drogami byl nejprve proveden test Morris Water Maze (MWM) po dobu 6 dnů. Krysy byly poté usmrceny, aby se odebrala krev, děloha, femora, holenní kosti a mozkové tkáně. Sérum bylo použito pro biochemické testy. Pro histomorfometrii byly použity dělohy. Pravá femora byla použita pro Micro-ČTa histomorfometrie, v daném pořadí. Pro biomechanický test byly použity pravé tibie. Hipokampus shromážděný na lednici byl použit pro biochemické testy. Mozek 41 odebraný perfuzí byl použit pro histomorfometrii.
Výsledek:Ve srovnání se skupinou Sham mohla skupina OVX plus D významně snížit schopnost učení a paměti tím, že způsobuje oxidační poškození, narušuje neurony v hipokampu a ovlivňuje hydrolýzu a syntézu acetylcholinu. Mezitím se aktivity BALP a TRAP ve skupině OVX plus D významně zvýšily (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinakosidaakteosid, typické patologické rysy osteoporózy aAlzheimerova chorobabyly zlepšeny.
Závěry:Model osteoporózy v kombinaci sAlzheimerova chorobau potkanů byla proveditelná a úspěšně zavedená.Echinakosida akteosid také vykazovaly některé významné účinky na tento souběžný model a mohli by být potenciálními 56 kandidátyCistanche tubulosas dvojími účinky pro další studium.
klíčová slova:osteoporóza; Alzheimerova choroba; dvojí efekty; echinakosid; akteosid; Cistanche tubulosa
Cbylinky z Istanche ztracené říše zlepšují Alzheimerovu chorobu
1. Úvod
Osteoporóza je degenerativní onemocnění kostí charakterizované progresivním úbytkem kostní hmoty a destrukcí mikroarchitektury, což může zvýšit riziko křehkých zlomenin (Rachner et al., 2011).Alzheimerova choroba(AD) je běžné neurodegenerativní onemocnění u starších osob, které se v klinické praxi vyznačuje neustálým mentálním úpadkem, kognitivní poruchou a ztrátou schopnosti samostatného života (Reitz 76 et al., 2011). Typickými patologickými rysy AD jsou tvorba senilního plaku indukovaného ukládáním -amyloidu, neurofibrilární klubka způsobená hyperfosforylací tau a neuronální degenerace v mozku (Serrano-Pozo et al., 2011). Povrchově jsou OP a AD zcela nezávislá onemocnění s odlišnou patologií a klinickými rysy. V klinické praxi se však často pozoruje společný výskyt OP a AD (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Prevalence obou onemocnění rostla s věkem, zejména u žen po menopauze (Li et al., 2017; Stern, 2012). Stále více důkazů naznačovalo, že lidé s diagnózou AD mají zvýšené riziko OP (Zhou et al., 2014).
Je nutné studovat a objasnit vztahy mezi osteoporózou aAlzheimerova chorobain vitro a in vivo. Před provedením studií in vivo je důležité vybrat použitelné zvířecí modely osteoporózy nebo Alzheimerovy choroby. Model osteoporózy by mohl být vytvořen několika druhy metod, jako je intragastrické podávání kyseliny retinové, operace vaječníků a intramuskulární injekce glukokortikoidů (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Zejména model postmenopauzální osteoporózy indukovaný ovariektomií u potkanů byl klasický abyl široce používán ve většině studií (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Sporadická Alzheimerova choroba je hlavním typem Alzheimerovy choroby. Zvířemodely SporadicAlzheimerova chorobalze vyvolat různými metodami, napřinjekce D-galaktózy popř -amyloid, intragastrické podání AlCl3,a tak dále(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). Kromě toho,konjunkční model Alzheimerovy choroby vyvolané dlouhodobou intraperitoneálníinjekce D-galaktózy v kombinaci s ovariektomií byla také hodně studována (Liua kol., 2010; Zhao a kol., 2012). Abychom odhalili závažnost osteoporózy aAlzheimerova choroba, je nutné vytvořit model osteoporózy v kombinacis Alzheimerovou chorobou studovat společné mechanismy lékůosteoporóza aAlzheimerova nemocase.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight je parazitická rostlina, která se vyskytuje hlavně v pouštích v severozápadní Číně. Sušené sukulentní stonkyCistanche tubulosa(CT) se používají jako slavný tonikum nazývaný Cistanches Herba s čínským názvem Roucongrong v čínském lékopisu (2015). V tradiční čínské medicíně je uznáván jako „ženšen pouští“ a je široce používán pro léčbu bolestí pasu a kolen, ženské sterility a zácpy (Jiang a Tu, 2009). Hlavními aktivními složkami CT jsou fenylethanoidové glykosidy (PhGs), echinakosid (ECH) aakteosid(ACT) jsou reprezentativní sloučeniny v PhG (Morikawa et al., 2014). Zejména ECH a ACT jsou typicky vybírány jako markery pro kontrolu kvality u CT kvůli jejich vysokému obsahu a různým farmakologickým aktivitám, jako jsou účinky neuroprotekce, ochrana kostí,
antioxidanty, působí proti stárnutí a zlepšují schopnost učení a paměti (Wang et al.,2012; Li a kol., 2016). Nicméně účinky ECH a ACT na osteoporózuzkombinováno sAlzheimerova chorobanebyly dosud studovány společně na krysím modelu.Účelem této studie tedy bylo vytvořit kombinovaný potkaní model osteoporózys Alzheimerovou chorobou a prozkoumat její účinkyechinakosida akteosid na tosouběžný model, aby poskytl experimentální důkazy pro další studiummolekulární mechanismus echinakosidu nebo akteosidu v následujícím výzkumu.
cistanche pharma specialproINZERÁT
2. Materiály a metody
2.1. Zvířata
Osmdesát 8-týdenních samic potkanů Wistar (číslo certifikátu: SCXK 2018-0006) o hmotnosti 180~200 g bylo získáno od čínsko-britské laboratoře SIPPR/BK. Animal Ltd (Shanghai, Čína) a vyrostl v Experimentálním centru farmaceutických zvířat na Čínské farmaceutické univerzitě.
2.2. Chemikálie a činidla
Chloralhydrát, penicilin G sodný, D-galaktóza, hexahydrát chloridu hlinitého, estradiolvalerát, donepezil HCl byly zakoupeny od Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Čína).Echinakosid(HPLC 94 procent) byl získán od Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Čína).Akteosid(HPLC 98 procent) byl zakoupen od Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Čína). Byly vytvořeny soupravy pro kostně specifickou alkalickou fosfatázu (BALP), kyselou fosfatázu rezistentní na vínan (TRAP), superoxiddismutázu (SOD), malonaldehyd (MDA), acetylcholinesterázu (AChE) a cholinacetyltransferázu (ChAT) enzymový imunosorbentní test (ELISA). zakoupené od Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Univerzální tkáňový fixátor byl získán zChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Čína).
echinakosid
2.3. Zvířecí modely a ošetření
Všechny pokusy na zvířatech byly schváleny a kontrolovány Výborem pro etiku zvířat Čínské farmaceutické univerzity. Krysy byly udržovány s 12hodinovým cyklem světlo/tma v místnosti s řízenou teplotou (22±2 stupně) a krmeny standardním peletovaným krmivem a vodou z vodovodu.
Po adaptaci jednoho týdne byl model osteoporózy dosažen provedením operace ovariektomie (French et al., 2008). Po ukončení operace byl na suturu rány jednou postříkán penicilin G sodný, aby se zabránilo infekci. Krysy pak byly krmeny normálně po dobu tří týdnů. Podle odkazu (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017) je modelAlzheimerova chorobaby mohla být indukována dlouhodobou intraperitoneální injekcí D-galaktózy v kombinaci s ovariektomií nebo dlouhodobým intragastrickým podáváním AlCl3. Ke studiu proveditelnosti modelu osteoporózy v kombinaci s Alzheimerovou chorobou byly použity tři modelové skupiny ovariektomie (skupina OVX), simulovaná operace s intraperitoneální injekcí 150 mg/kg/den D-galaktózy a intragastrickým podáním 30 mg/kg/d AlCl3 (skupina D), ovariektomie s intraperitoneální injekcí 150 mg/kg/den D-galaktózy a intragastrické podávání 30 mg/kg/den AlCl3 (OVX plus skupina D) byly v této studii nastaveny.
Potkani byli proto po 3 týdnech náhodně rozděleni do osmi skupin (n{{0}} pro každou skupinu) a orálně léčeni léky po dobu 8 týdnů: Sham skupina; skupina OVX; D skupina; OVX plus D skupina; skupina léčená estradiolvalerátem (EV skupina, OVX plus D plus 0,6 mg/kg/den estradiolvalerát); léčebná skupina donepezilu HCl (skupina DPZ, OVX plus D plus 0,8 mg/kg/den donepezil HCl);echinakosidléčebná skupina (skupina ECH, OVX plus D plus 90 mg/kg/den echinakosidu);akteosidléčebná skupina (ACT skupina, OVX plus D plus 90 mg/kg/den akteosid). Podle principu konverze ekvivalentní dávky mezi člověkem a potkanem a dávky ze související reference (Li et al., 2013; Gao et al., 2014) byly v této studii přijaty dávky pro skupiny léčené drogami.
Tělesná hmotnost každé krysy byla měřena každý týden. Po celé léčbě léky trvající 8 týdnů byl nejprve proveden test Morris Water Maze (MWM) po dobu 6 dnů. Poté bylo 6 krys z každé skupiny usmrceno za účelem sklizně materiálů. Krysy byly anestetizovány intraperitoneální injekcí 3{4}} ml/kg 10% chloralhydrátu a krev byla odebrána z aorty břišní. Krev byla umístěna při pokojové teplotě, aby se srazila a centrifugována při 3500 ot./min. po dobu 10 minut. Sérum bylo sklizeno v 1,5 ml centrifugační zkumavce (NEST Biotechnology) a skladováno při -80 stupni až do použití pro biochemické testy. Poté byly odebrány dělohy, femora, tibie a mozkové tkáně. Pro histomorfometrii byly použity dělohy. Pravá femora byla použita pro Micro-CT a histomorfometrii. Pro biomechanický test byly použity pravé tibie. Hipokampus shromážděný na lednici byl použit pro biochemické testy. Poté byly dalším třem krysám z každé skupiny promývány srdce ze srdce fyziologickým roztokem a univerzálním tkáňovým fixativem, aby byl odebrán mozek pro histomorfometrii.
2.4. Test Morrisova vodního bludiště (MWM).
Potkani byli podrobeni prostorovému referenčnímu učení a testování paměti v testu MWM po 8 týdnech intervence. Test MWM byl proveden podle metod uvedených dříve (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Stručně řečeno, 5 po sobě jdoucích dnů se čtyřmi pokusy denně byly krysy trénovány tak, aby používaly různé vizuální podněty umístěné na stěně bazénu k nalezení skryté ponořené plošiny (průměr 11 cm, výška 29 cm) v kruhovém bazénu (průměr 130 cm, výška 50 cm) naplněné netoxickou vodou tónovanou uhlíkovým inkoustem. Bazén byl pomyslně rozdělen do čtyř kvadrantů a na průsečíkech kvadrantů se nacházely čtyři startovní pozice. Plošina byla umístěna ve středu jednoho z kvadrantů a poloha byla během pokusů konstantní. V každém pokusu byly krysy umístěny náhodně na vybraná místa čelem ke stěně bazénu. Každý pokus byl ukončen, když krysa dosáhla plošiny nebo po 60 s, a uplynulý čas byl zaznamenán jako úniková latence. Krysa, která nedosáhla na plošinu, byla navedena na plošinu. Po každém pokusu se skrytou plošinou zůstala krysa na plošině po dobu 10 sekund. Průměrná doba latence čtyř pokusů za den byla vypočtena jako výsledky tréninku. V den 6 byly všechny krysy podrobeny testu sondy, ve kterém plavaly po dobu 60 s v bazénu bez plošiny. Jako konečné výsledky byly zaznamenány doby přejezdu v místě nástupiště a doba jízdy v cílovém kvadrantu. Potkani byli monitorováni kamerou namontovanou na stropě přímo nad bazénem a všechny pokusy byly zaznamenány a analyzovány pomocí programu MORRIS MAZE, který dodala společnost Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Peking, Čína).
2.5. Biochemický test metodou ELISA
Podle pokynů výrobce souprav ELISA byla BioTek Synergy testována aktivita alkalické fosfatázy specifické pro kosti (BALP), aktivita kyselé fosfatázy rezistentní na tartrát (TRAP), aktivita superoxiddismutázy (SOD) a obsah malondialdehydu (MDA) v séru. 2 multimódová čtečka mikrodestiček (BioTek, USA). Tkáně hippocampu z každé skupiny byly promyty PBS (0,01 M, pH 7,4), aby se odstranila krev nebo nečistoty zbývající na povrchu tkáně. Tkáně hipokampu na jedné straně byly zváženy a poté rozřezány na co nejmenší kousky. Tkáně hippocampu byly homogenizovány v poměru 1:9 (hmotnost tkáně: objem PBS). Homogenát byl centrifugován při 4 stupních, 3000 ot./min. po dobu 15 minut. Supernatant byl shromážděn a zředěn pro měření koncentrace proteinu metodou BCA. Aktivita acetylcholinesterázy (AChE), aktivita cholinacetyltransferázy (ChAT), aktivita superoxiddismutázy (SOD) a obsah malondialdehydu (MDA) ve tkáni hipokampu byly poté testovány metodami ELISA.
2.6. Histomorfometrie hipokampu
Mozkové tkáně (n=3/skupina) byly fixovány v univerzálním tkáňovém fixativu. Vzorky mozkové tkáně byly poté promyty, dehydratovány gradientem ethanolu, zality parafínovým voskem a nakrájeny na koronální řezy 5 μm. Řezy byly obarveny hematoxylinem a eosinem (HE). Poté byly koronální řezy mozkových tkání vyfotografovány inverzním fluorescenčním mikroskopem (Nikon, Japonsko). Pozorovány byly zejména morfologické změny CA1, CA2, CA3 a DG v hippocampu.
2.7. Histomorfometrie a morfometrie dělohy
Vybrané dělohy (n{0}}/skupina) byly fixovány v univerzálním tkáňovém fixativu. Vzorky děložní tkáně byly poté promyty, dehydratovány gradientem ethanolu, zality parafínovým voskem a nakrájeny na příčné řezy 5 μm. Řezy byly obarveny hematoxylinem a eosinem (HE). Byly pozorovány a fotografovány příčné řezy dělohy. Náhodně bylo vybráno pět zorných polí, průměr příčného řezu dělohy a tloušťka epitelu děložní sliznice pak byla měřena pomocí softwaru Image-Pro Plus 6.0. Byly také spočítány počty děložních žláz v lamina propria.
2.8. Micro-CT
Vybraná pravá femora (n{0}}/skupina) byla naskenována v poloze se vzdáleností objektu od zdroje 121 mm a vzdáleností kamery od zdroje 171 mm pomocí SkyScan 1176 micro X- paprsková počítačová tomografie (mikro-ČT) skener (Bruker, Německo). Jako referenční povrch byla vybrána distální růstová ploténka. Ve vzdálenosti 1 mm pod referenčním povrchem byla vybrána oblast o tloušťce 1,8 mm jako sledovaný objem (VOI, 100 vrstev). Výsledné snímky ve stupních šedi měly velikost pixelu 17,76 μm z rekonstrukce kosti (65 kV, 385 μA). K výběru trámců z kortikální kosti byla použita poloautomatická metoda tvarování. Metody přímého 3D měření byly použity k posouzení procenta objemu kosti (BV/TV), hustoty povrchu kosti (BS/TV), trabekulární separace (Tb. Sp), trabekulárního čísla (Tb. N), tloušťky trabekulární (Tb. Th) , index strukturního modelu (SMI), faktor trabekulárního vzoru (Tb. Pd) a střední kostní minerální hustota (průměrná BMD) pro stejnou VOI pomocíČTProgram analyzátoru (Bruker, Německo). 3D vizualizace VOI pomocí adaptivního vykreslovacího algoritmu byla provedena pomocí softwaru CTvol (Bruker, Německo).
rostlinný extrakt cistanche
2.9. Histomorfometrie kostí
Vybrané pravé femory (n=3/skupina) byly fixovány v univerzálním tkáňovém fixativu a poté dekalcifikovány v roztoku 10% EDTA-2Na po dobu 3 týdnů. Odvápněné vzorky byly promyty, dehydratovány gradientovým ethanolem, zality parafínovým voskem a nakrájeny na podélné řezy o šířce 5 μm. Řezy byly obarveny hematoxylinem a eosinem (HE). Byly vyfotografovány podélné řezy femorou. Byly pozorovány struktury kostní tkáně každé skupiny, zejména struktury trabekulární kosti.
2.10. Biomechanický test
Náhodně vybrané pravé tibie (n{0}}/skupina) byly hodnoceny pro tříbodový ohybový test pomocí univerzálního testovacího stroje (SHIMADZU, Japonsko). Průměry těchto vzorků byly měřeny noniem v rozsahu 2.16-2,38 mm (d). Vzorek byl poté umístěn na dvě nosné příčky se vzdáleností 25 mm (L) mezi dvěma kolejnicemi a fyziologické zakřivení vzorku bylo směrem nahoru. Zatěžovací tyč zátěže byla umístěna ve středu vzorku a klesala konstantní rychlostí 1,5 mm/min, dokud se vzorek nerozbil. Údaje o síle (F) a posunutí byly automaticky zaznamenány do počítače, který byl připojen k testovacímu stroji, a současně byla vynesena křivka zatížení-deformace. Hodnoty maximálního zatížení (N) a absorpce energie (mJ) byly současně zaznamenávány materiálovým testovacím softwarem TRAPEZIUM X. Hodnoty maximálního napětí (MPa) byly vypočteny podle následujícího vzorce: Napětí (σ)=ohybový moment (M) / součinitel průřezu (Z)=(8×L×F) / ( π×d3)
2.11. Statistická analýza
Výsledky modelových skupin byly porovnány se skupinou Sham a výsledky skupin léčených léky byly porovnány se skupinou OVX plus D. Data byla analyzována pomocí jednocestné ANOVA a následně Bonferroniho vícenásobného srovnávacího testu pomocí softwaru Graph Pad Prism 5.0. Data byla vyjádřena jako průměr ± SD a hodnoty P menší než 0,05 byly považovány za statisticky významné.
myricetinacistanche
