ČÁST 2 Izolace a identifikace fenylethanoidních glykosidů z Aloysia Polystachya a její aktivita jako inhibitorů monoaminoxidázy-A

Jaký je důvod, proč mohou Cistanche Actosidy inhibovat aktivitu enzymů?

Princip antioxidačního účinku Cistanche

Pro více informací prosím kontaktujte:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

Separace a identifikace složek ultravýkonnou kapalinovou chromatografií-hmotnostní spektrometrií

Chromatografické analýzy byly provedeny za použití systému Waters Acquity UPLC H-Class vybaveného detektorem diodového pole (DAD) a tandemovým kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem Waters Xevo TQ-S se zdrojem Z-spray pracujícím v režimu negativních iontů. Zásobní roztoky obsahující 10mg/ml extraktu nebo standardůakteosid, isoacteosid, 6'-acetylakteosida 4',4''',5,5''-tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7–O–C7'']-biflavon v methanolu kvality LC byly připraveny samostatně, v případě potřeby se sonikací po dobu 3{15}}min, a filtrovány přes 0.45μm filtry Millipore (Merck Millipore). Roztoky byly zředěny na 10ug/ml methanolem a alikvoty (5μL) byly nastříknuty na kolonu Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 (1{{30}}}0×4,6 mm vnitřní průměr; velikost částic 2,7 um). Mobilní fáze se skládala z vody obsahující 0,1 procenta kyseliny mravenčí (rozpouštědlo A) a methanolu obsahujícího 0,1 procenta kyseliny mravenčí (rozpouštědlo B) dodávané rychlostí 0,5 ml/min podle elučního profilu: isokratická s 3 procenty B mezi 0 a 4 min, následovaly lineární gradienty od 3 do 60 procent B mezi 4 a 19 min a od 60 do 90 procent B mezi 19 a 23 min a nakonec se vrátily na 3 procenta B mezi 23 a 28 min. Výtok byl monitorován pomocí DAD v rozsahu 210 až 720 nm a pomocí MS s optimalizovaným zdrojem a provozními parametry následovně: kapilární napětí 2,50 kV, teplota zdroje Z-spray 150 stupňů, teplota desolvace (N2) 350 stupňů, průtok desolvačního plynu 600 l/h a hmotnostní rozsah m/z 150 až 600 v režimu plného skenování.

Purifikace identifikovaných složek

Surový hydroethanolický extrakt (10 g) byl rozpuštěn ve vodě: ethanolu (50:50; obj./obj.) a rozdělen postupně mezi hexan, ethylacetát a n-butanol. Butanolová frakce byla zakoncentrována na rotační odparce a 3g vzorek frakcionovaného extraktu byl nanesen na skleněnou kolonu (10 × 3 cm od) naplněnou C-18 RP silikagelem (230-400 mesh; Sigma -Aldrich) a eluován vodou a následně směsmi voda:methanol (90:10, 50:50 a 10:90; v/v). Subfrakce získaná elucí směsí voda:methanol (90:10; obj./obj.) byla dále purifikována pomocí RP-HPLC za použití systému Shimadzu LC-20AP spojeného s detektorem SPD-20A UV/Vis a vybavené kolonou Phenomenex Luna® C-18 (250 × 10 mm vnitřní průměr; velikost částic 5 μm). Mobilní fází byla voda:methanol, počínaje poměrem 90:10 (obj./obj.) a změněným na 30:70 (obj./obj.) během 100 minut, čímž byly získány čtyři známé sloučeniny.akteosid(750 mg), izolovaná strana (430 mg), 6'-acetylakteosid(42 mg) a 4',4''',5,5''-tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimethoxy-[C7–O–C7'']-biflavon ( 13 mg). Průtok mobilní fáze byl 1 ml/min, nástřikový objem byl 500 μl, chromatogram byl zaznamenáván při 340 nm a UV spektra byla získána v rozsahu 240 až 400 nm. Identita purifikovaných složek byla potvrzena z jejich 1H- (500 MHz) a 13C-NMR (125 MHz) spekter zaznamenaných na spektrometru Bruker model DPX 500 a porovnáním údajů s údaji dostupnými v literatuře [18, 19, 41]. Čistoty izolovaných sloučenin byly potvrzeny pomocí UPLC-DAD-MS (▶Obr. 1b–da NMR (▶Obr. S1–S12, podpůrné informace).

Kvantifikaceakteosiddetektorem HPLC s diodovým polem

Vzorek (1 mg) vysušeného hydroethanolového extraktu byl znovu rozpuštěn v 1 ml směsi (80:20; v/v) methanolu (JT Baker HPLC grade) a Milli-Q Ultračistá voda (Merck Millipore), sonikovaná po dobu 30 min a přefiltrovaná přes 0.45-μm filtr Millipore. Alikvoty (20 ul) tohoto roztoku byly analyzovány na systému Shimadzu LC-10APvp připojeném k SPD-M10Avp DAD a opatřenému kolonou Phenomenex Luna C18 (250 × 4,6 mm id, 5 um) chráněnou Phenomenex C18 předkolona (4,0 x 3,0 mm vnitřní průměr, 5 um). Separace byly prováděny při teplotě místnosti (22 ± 1 stupeň) za použití mobilní fáze obsahující 0,1% kyselinu octovou ve vodě (rozpouštědlo A) a methanol (rozpouštědlo B;

JT Baker HPLC grade) dodávaný při konstantním průtoku 1.0 ml/min podle programu: lineární gradient od 10 do 70 procent B mezi 0 a 32 min, od 70 do 10 procenta B mezi 32 a 35 minutami a konečnou izokratickou eluci s 10 procenty B mezi 35 a 40 minutami. Detekční vlnová délka byla nastavena na 330 nm.

Obsahakteosidv extraktu byl odhadnut pomocíakteosid(Sigma-Aldrich; CAS č. 61276-17-3) jako externí standard. Byly připraveny roztoky obsahující 500, 250, 125, 62,5, 31,2 a 15,6 ug/ml referenčního standardu a byly sestrojeny kalibrační křivky podrobením každého roztoku HPLC analýze v triplikátech [42]. Poměr plochy píku standarduakteosidna odpovídající koncentraci analytu byla stanovena lineární regresí standardních křivek (▶Obr. S13, podpůrné informace). Analytická data byla validována s ohledem na linearitu, přesnost a správnost podle pokynů vydaných Agência Nacional de Vigilância Sanitária [42]. Meze detekce (LoD) a kvantifikace (LoQ).akteosidbyly {{0}},30 a 0,92 µg/ml, v daném pořadí.

Testy inhibice monoaminooxidázy-A

Rekombinantní lidský MAO-A, tyramin, klorgylin, kyselina vanilová, 4-aminoantipyrin a křenová peroxidáza byly zakoupeny od Sigma-Aldrich. Testy inhibice MAO-A byly provedeny pomocí 96-jamkových destiček podle modifikované verze metody popsané v López et al. [43]. Každá jamka byla naplněna 50 μl chromogenního roztoku (0,8 mM kyseliny vanilové, 2,5 mM 4-amino antipyrinu a 4 U/ml křenové peroxidázy ve fosfátovém pufru při pH 7,6), 100 μl 3 mM tyraminu a 50-μl alikvotu surového hydroethanolického extraktu nebo jednoho z přečištěných fenylethanoidů rozpuštěných v methanolu. Nakonec byly do každé z jamek přidány 50 ul alikvoty 8 U/ml MAO-A a destička byla inkubována při 37 stupních po dobu 30 minut, během této doby byly každých 5 minut zaznamenávány absorbance pomocí čtečky mikrodestiček. Clorgylin (Větší nebo rovný 97 procentům GC; Sigma-Aldrich) a methanol byly zahrnuty jako pozitivní a negativní kontroly na každé testovací destičce.

Statistická analýza

Byla provedena tři nezávislá hodnocení inhibičních aktivit MAO-A a získaná data byla analyzována pomocí softwaru Graph-Pad Prism. IC₅₀hodnoty hydroethanolového extraktu, purifikovaných fenylethanoidů a pozitivní kontroly byly vypočteny nelineární regresí, simulující grafy log (koncentrace inhibitoru) versus normalizované procento inhibice.

Podpůrné informace

H- a 13C-NMR spektraakteosid, isoakteosid, 6'-acetylakteosid a 4,4,5,5-tetrahydroxy-6,6,3 trimethoxy-[C7–O– C7'']-biflavon a korelační analýzy HSQC/HMBC pro tři fenylethanoidy jsou k dispozici jako podpůrné informace.

Reference

[1] Světová zdravotnická organizace. Deprese a jiné běžné duševní poruchy

Poruchy: Globální odhady zdraví. Ženeva: WHO; 2017

[2] Ferguson JM. Antidepresivní léky SSRI: Nežádoucí účinky a snášenlivost. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2001; 3: 22–27

[3] van der Watt G, Laugharne J, Janca A. Doplňková a alternativní medicína v léčbě úzkosti a deprese. Curr Opin Psychiatry 2008; 21: 37–42

[4] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Rostlinné léky na úzkostné poruchy, část 1: Přehled preklinických studií. CNS Léčiva 2013; 27: 207–219

[5] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Rostlinné léky na úzkostné poruchy, část 2: Přehled klinických studií s podpůrnými preklinickými důkazy. CNS Léčiva 2013; 27: 301–319

[6] Del Vitto LA, Petenatti EM, Petenatti ME. Recursos herbolarios de San Luis (República Argentina). Základní část: Plantas Nativas. Multequina 1997; 6: 49–66

[7] González Y, Arrúa RD, Rojas GD, García MG. Etnofarmacobotánica foliar de "burrito",Aloysia polystachya (Griseb.) Moldenke (Verben- aceae), cultivado en Paraguay. Rojasiana 2014; 13: 31–41

[8] Mora S, Díaz-Véliz G, Millán R, Lungenstrass H, Quirós S, Coto-Morales T, Hellión-Ibarrola MC. Anxiolytické a antidepresivní účinky hydroalkoholového extraktu zAloysia polystachyau krys. Pharmacol Biochem Behav 2005; 82: 373-378

[9] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Tortoriello J, Fernández S, Wasowski C, Marder M, De Lima TCM, Mora S. Anxiolytické účinkyAloysiapolystachya(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) u myší. J Ethnopharmacol- col 2006; 105: 400–408

[10] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Ferro EA, Alvarenga N, Tortoriello J,

De Lima TCM, Mora S. Účinky podobné antidepresivuAloysiapolystachya(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) u myší. Fytomedicína 2008; 15: 478–483

[11] Herraiz T, González D, Ancín-Azpilicueta C, Arán VJ, Guillén H.

-Karbolinové alkaloidy v Peganum harmala a inhibice lidské monoaminooxidázy (MAO). Food Chem Toxicol 2010; 48: 839-845

[12] Herraiz T, Guillén H, Arán VJ, Salgado A. Identifikace, výskyt a aktivita chinazolinových alkaloidů v Peganum harmala. Food Chem Toxicol 2017; 103: 261–269

[13] Herraiz T, Guillén H. Inhibice monoaminooxidázy-A a související antioxidační aktivita v rostlinných extraktech s potenciálními antidepresivními účinky. Bio-Med Res Int 2018; 1018: 4810394

[14] Carradori S, D'Ascenzio M, Chimenti P, Secci D, Bolasco A. Selektivní inhibitory MAO-B: Poučení z přírodních produktů. Mol Divers 2014; 18: 219–243

[15] Fajemiroye JO, Silva DM, Oliveira DR, Costa EA. Léčba úzkosti a deprese: Léčivé rostliny v retrospektivě. Fundam Clin Pharmacol 2016; 30: 198–215

[16] Fišar Z. Léky souvisí s aktivitou monoaminooxidázy. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2016; 69: 112–124

[17] Naoi M, Maruyama W, Shamoto-Nagai M. Monoaminooxidáza typu A a serotonin se koordinovaně podílejí na depresivních poruchách: Od nerovnováhy neurotransmiterů po narušenou neurogenezi. J Neural Transm 2017; 125: 53–66