Část 1 Doxorubicin paradoxně zmírňuje nádorem indukovaný zánět u mladých myší

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Ibrahim Y. Abdelgawad a kol

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáteprodukty a Cistanche herba

Abstraktní:

doxorubicin(DOX) je jedním z nejpoužívanějších chemoterapeutik v dětské onkologii. DOX vyvolává zánětlivou reakci v mnoha orgánech, což přispívá k nežádoucím účinkům vyvolaným DOX. Rakovina sama o sobě způsobuje zánět vedoucí k mnoha patologickým stavům. Současná studie zkoumala zánětlivou odpověď na DOX anádorypomocí EL4-lymfomového, imunokompetentního modelu juvenilních myší. Čtyřtýdenní samci myší C57BL/6N dostali subkutánní injekci lymfomových buněk EL4 (5 × 104 buněk/myš) do oblasti boku, zatímconádormyším bylo injikováno vehikulum. Tři dny po implantaci nádoru byly myším bez nádoru i myším s nádorem intraperitoneálně injikovány buď DOX (4 mg/kg/týden) nebo fyziologický roztok po dobu 3 týdnů. Týden po poslední injekci DOX byly myši usmrceny a srdce, játra,ledvinya bylo odebráno sérum. Genová exprese a sérová koncentrace zánětlivých markerů byly kvantifikovány pomocí PCR v reálném čase a ELISA. Léčba DOX výrazně potlačenanádorrůst u myší s nádorem a způsobil významnou srdeční atrofii u myší bez nádoru a myší s nádorem. Nádory EL4 vyvolaly silnou zánětlivou reakci v srdci, játrech aledvina. Překvapivě, léčba DOX zlepšila zánět vyvolaný nádorem paradoxně k účinku DOX u myší bez nádoru, což prokázalo značně odlišný účinek léčby DOX u myší bez nádoru a myší s nádorem.

klíčová slova:doxorubicin; nádor; zánět

1. Úvod

Doxorubicin (DOX), také známý jako Adriamycin, je jedním z nejpoužívanějších chemoterapeutických činidel v dětské klinické onkologii. Navzdory své účinnosti u široké škály rakovin, včetně lymfomu, leukémie a dalších dětských rakovin, je klinická využitelnost DOX omezená kvůli jeho toxicitě pro mnoho orgánů. Kromě výrazné kardiotoxicity [1] bylo prokázáno, že DOX způsobuje nefrotoxicitu [2–5] a hepatotoxicitu [6]. Téměř 50 procent dětských pacientů s rakovinou dostává DOX jako součást svého léčebného protokolu [7]. Díky účinné léčbě rakoviny, včetně DOX, se 5-letá míra přežití dětí s diagnózou rakoviny zvýšila z méně než 60 procent v 70. letech na více než 80 procent nyní [8,9]. To vede k velké populaci pacientů, kteří přežili rakovinu v dětství (CCS), odhaduje se na přibližně 400,000. Bohužel jsou CCS vystaveny vysokému riziku vzniku dlouhodobých nežádoucích účinků v důsledku léčby rakoviny a/nebo rakoviny samotné.

Bylo prokázáno, že DOX spouští systémový zánět [10–12] a zánětlivou odpověď v mnoha orgánech včetně srdce [13],ledvina[14] a játra [15]. Bylo prokázáno, že tato zánětlivá reakce podporuje nežádoucí účinky vyvolané DOX [16,17]. Většina těchto studií uvádějících zánět vyvolaný DOX byla provedena vnádor-bez zvířecích modelů, které nenapodobují klinický scénář, ve kterém dětští pacienti s rakovinou dostávají léčbu DOX po diagnóze rakoviny. Ukázalo se také, že rakovina sama o sobě způsobuje zánět přispívající k četným patologickým stavům, které mohou zhoršit toxicitu vyvolanou DOX [18,19]. Proto existuje kritická potřeba vytvořit klinicky relevantní zvířecí modely pro zkoumání mechanismů DOX-indukované mnohočetné orgánové toxicity u mláďat,nádor-nesoucí myši, aby studovaly souhru mezi léčbou DOX a samotnou rakovinou, která způsobuje takovou toxicitu.

V této studii jsme zkoumali zánětlivou odpověď na DOX a nádor na klinicky relevantním syngenním EL4-lymfomu, imunokompetentním, juvenilním myším modelu. Tento model je dobře zaveden ve výzkumu rakoviny [20] a je klinicky relevantní pro dětské pacienty s rakovinou, protože lymfom je jedním z nejčastějších typů rakoviny u dětí [21]. Použití syngenních myší je kritické pro studium zánětlivé reakce na DOX i na nádor vzhledem ke kritické úloze imunitního systému v patogenezi zánětu [22]. Věk myší po podání DOX byl 5 týdnů, což odpovídá věku dospívání 10–12 let u lidí [23]. Kromě toho jsou podané dávky DOX klinicky relevantní k dávkám, které dostávají pediatričtí pacienti s rakovinou [24]. Nejprve jsme určili účinky DOX na srdeční funkci u myší bez nádoru a myší s nádorem, protože kardiotoxicita vyvolaná DOX je považována za klinicky nejrelevantnější nepříznivý účinek DOX, mezi jinými toxicitami pro více orgánů. Poté jsme stanovili účinek DOX, nádoru a jejich kombinace na několik zánětlivých markerů v srdci, játrech aledvinakromě sérových markerů systémového zánětu. Zjistili jsme, že přítomnost nádoru EL4 vyvolala silnou zánětlivou reakci ve více orgánech. Léčba DOX překvapivě zlepšila zánět vyvolaný nádorem, což je paradoxní vzhledem k dříve uváděnému účinku DOX u myší bez nádoru.

2. Výsledky

2.1. Účinky DOX na tělesnou hmotnost a růst nádoru

Současná studie byla založena na juvenilních myších, aby napodobila klinický scénář u pediatrických pacientů s rakovinou, jak je popsáno na obrázku 1A. Po expozici DOX (4 mg/kg/týden po dobu 3 týdnů) nebyla pozorována žádná významná morbidita ani mortalita ani u myší bez tumoru, ani u myší s tumorem, což je v souladu s naší předchozí studií používající stejnou dávku [25]. Avšak expozice juvenilních jedinců DOX vedla k významně sníženému přírůstku tělesné hmotnosti ve srovnání s myšmi léčenými fyziologickým roztokem (obrázek 1B). Pro posouzení protirakovinného účinku DOX v tomto modelu lymfomu EL4 jsme měřili hmotnosti nádorů po pitvě myší. Chronické podávání DOX myším s nádorem významně inhibovalo růst nádoru EL4, což prokázalo protirakovinný účinek tohoto dávkovacího režimu DOX (obrázek 1C).

2.2. Vliv podávání DOX na srdeční funkci a morfometrii u myší bez nádorů a myší nesoucích nádor

DOX způsobil srdeční atrofii, jak bylo prokázáno významným snížením hmotnosti srdce na délku tibie (HW/TL) (obrázek 1D). Je pozoruhodné, že srdeční atrofie způsobená DOX byla rozšířena u myší s nádorem (obrázek 1D). Účinky DOX, nádoru a kombinace obou na srdeční funkci a morfologii byly hodnoceny pomocí transtorakální echokardiografie. Reprezentativní snímky M-Mode z každé skupiny jsou zobrazeny na obrázku 2A. DOX ani nádor nezpůsobily významné změny ejekční frakce (obrázek 2B), srdečního výdeje (obrázek 2C), frakčního zkrácení (obrázek 2D), hmoty levé komory (LV) (obrázek 2E), tloušťky zadní stěny levé komory v diastole (LVPW' d) (obrázek 2F) nebo tloušťka zadní stěny levé komory v systole (LVPW's) (obrázek 2G).

2.3. Vliv podávání DOX na genovou expresi zánětlivých markerů v srdci myší nesoucích nádor a myší bez nádorů

Srdce byla odebrána z juvenilních myší C57BL/6N bez nádoru a lymfomu EL4 s nádorem jeden týden po podávání 4 mg/kg/týden DOX nebo ekvivalentního objemu sterilního fyziologického roztoku po dobu 3 týdnů (n=8 na skupina). Po extrakci celkové RNA exprese srdeční mRNA zánětlivých markerů interleukin-1 alfa (IL-1 ), interleukin-1 beta (IL-1 ), interleukin{{12} } (IL-6), tumor nekrotizující faktor-alfa (TNF- ), zánětlivé chemokiny, monocytový chemoatraktant protein-1 (Mcp-1) a chemokiny s motivem CX C (Cxcl1, Cxcl9 a Cxcl10) byly stanoveny pomocí PCR v reálném čase. Genová exprese více zánětlivých markerů v srdci byla významně upregulována u myší s nádorem ve srovnání s myšmi bez nádoru, včetně prozánětlivých cytokinů IL-1 (obrázek 3A), IL-1 ( Obrázek 3B), IL-6 (obrázek 3C) a TNF- (obrázek 3D) a zánětlivé chemokiny Mcp-1 (obrázek 3E), Cxcl1 (obrázek 3F) a Cxcl10 (obrázek 3H). Zatímco podávání DOX u myší bez nádoru nevedlo k významným změnám v expresi zánětlivých markerů v srdci, podávání DOX významně zrušilo nádorem indukovanou upregulaci IL-1 (obrázek 3B), Mcp{{44} } (obrázek 3E), Cxcl9 (obrázek 3G) a Cxcl10 (obrázek 3H). Důležité je, že dvoucestná ANOVA prokázala významný interakční účinek u všech markerů kromě Cxcl1, Cxcl9 a Cxcl10, což prokazuje rozdílné účinky, které má DOX na srdeční zánětlivé markery u nádorů nesoucích ve srovnání s myšmi bez nádoru.

2.4. Vliv podávání DOX na genovou expresi zánětlivých markerů v játrech myší bez nádorů a myší nesoucích nádor

Játra byla odebrána z juvenilních myší C57BL/6N bez nádoru i lymfomu EL4 s nádorem C57BL/6N myší jeden týden po podávání 4 mg/kg/týden DOX nebo ekvivalentního objemu sterilního fyziologického roztoku po dobu 3 týdnů (n=8 na skupina). Po extrakci celkové RNA došlo k expresi hepatické mRNA zánětlivých markerů IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 a Cxcl10 byly stanoveny pomocí PCR v reálném čase. Myši nesoucí nádor měly významně zvýšenou jaterní expresi prozánětlivých cytokinů IL-1 (obrázek 4A), IL-1 (obrázek 4B), TNF- (obrázek 4D), Cxcl9 (obrázek 4G), a Cxcl10 (obrázek 4H) ve srovnání s myšmi bez nádoru. I když je to méně pozoruhodné, dvoucestná ANOVA demonstruje významný účinek nádoru na jaterní genovou expresi IL-6 (obrázek 4C). Dvoucestná ANOVA prokázala významný interakční účinek mezi nádorem a DOX v Cxcl10 (obrázek 4H). Podávání DOX snížilo nádorem indukovanou upregulaci IL-1 a TNF- (obrázek 4B, D). DOX ani nádor neměly významný vliv na jaterní expresi zánětlivých chemokinů Mcp-1 a Cxcl1 (obrázek 4E, F).

2.5. Vliv podávání DOX na genovou expresi zánětlivých markerů v ledvině myší bez nádorů a myší nesoucích nádor

Ledviny byly odebrány juvenilním myším C57BL/6N bez nádoru a lymfomu EL4 s nádorem jeden týden po podávání 4 mg/kg/týden DOX nebo ekvivalentního objemu sterilního fyziologického roztoku po dobu 3 týdnů (n=8 na skupina). Po extrakci celkové RNA, renální mRNA exprese zánětlivých markerů IL-1, IL-1, IL-6, TNF-, Mcp-1, Cxcl1, Cxcl9 a Cxcl10 byly stanoveny pomocí PCR v reálném čase. V souladu s pozorovanými změnami v srdci a játrech měly myši s nádorem významně zvýšenou renální expresi prozánětlivých cytokinů IL-1 (obrázek 5A), IL-1 (obrázek 5B), TNF- (obrázek 5D) a Mcp-1 (obrázek 5E) ve srovnání s myšmi bez tumoru. Kromě toho dvoucestná ANOVA demonstruje významný účinek nádoru na renální genovou expresi Cxcl1 (obrázek 5F), Cxcl9 (obrázek 5G) a Cxcl10 (obrázek 5H). Podávání DOX myším s nádorem významně zlepšilo nádorem indukovanou upregulaci IL-1 (obrázek 5B), IL-6 (obrázek 5C), TNF- (obrázek 5D) a Mcp{{43} } (obrázek 5E). V rámci těchto markerů dvoucestná ANOVA také prokázala významnou interakci mezi DOX a nádorem, což prokazuje různé účinky, které má DOX na renální zánětlivé markery u myší s nádorem ve srovnání s myšmi bez nádoru.

2.6. Vliv podávání DOX na histopatologické rysy v srdci, játrech a ledvinách myší bez nádorů a myší nesoucích nádor

Srdce, játra a ledviny byly odebrány z jedné kohorty juvenilních myší C57BL/6N bez nádoru a lymfomu EL4 s nádorem jeden týden po podávání 4 mg/kg/týden DOX nebo ekvivalentního objemu sterilního fyziologického roztoku po dobu 3 týdnů ( n=4 na skupinu). Histopatologické hodnocení neprokázalo žádné velké patologické změny v srdci (obrázek 6A). Pouze minimální infiltrace zánětlivých buněk, prokázaná jako vzácná ložiska minimálně buněčně smíšeného (mononukleárního a neutrofilního) zánětu, byla pozorována v jaterních tkáních odebraných z DOX léčených bez tumoru (tři ze čtyř myší), fyziologickým roztokem léčených tumor-nesoucích ( dvě ze čtyř myší) a myši s nádorem ošetřené DOX (tři ze čtyř myší) (obrázek 6B). Histopatologické vyšetření ledvin neprokázalo žádné velké patologické změny ve všech skupinách kromě myší s nádorem léčených DOX (obrázek 6C), přičemž dvě ze čtyř myší v této skupině vykazovaly oblasti plné tubulární regenerace, fibrózy a mírné intersticiální zánět postihující přibližně 5 procent celkové plochy tkáně.

2.7. Divergentní účinky DOX na sérové ​​zánětlivé cytokiny u myší bez nádorů versus u myší nesoucích nádor

Již dříve jsme uvedli, že akutní podávání DOX vyvolalo systémovou zánětlivou odpověď u dospělých myší C57BL/6N [11]. Zde jsme stanovili účinek chronického podávání DOX na sérové ​​hladiny zánětlivých markerů IL-6 a TNF- u juvenilních myší bez nádoru a myší s nádorem. Myši s nádorem ošetřené fyziologickým roztokem vykazovaly výrazné, i když statisticky nevýznamné zvýšení sérového IL-6 (obrázek 7A) a TNF- (obrázek 7B) ve srovnání s myšmi bez tumoru. Důležité je, že dvoucestná ANOVA prokázala významnou interakci mezi podáváním DOX a nádorem na sérových hladinách IL-6 a TNF-. Podání DOX skutečně normalizovalo nádorem indukovanou upregulaci IL-6 na podobnou úroveň jako u kontrolních myší bez nádoru (obrázek 7A).