Část 1: Cistanosid Of Cistanche Herba zmírňuje hypoxií vyvolané poškození mužské reprodukce prostřednictvím potlačení oxidačního stresu
Mar 26, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Abstraktní:Stále více důkazů ukazuje, že hypoxie je příčinou mužské neplodnosti a hypoxie může souviset s oxidačním stresem (OS). Cistanosid (Cis) je fenylethanoidní glykosidová sloučenina, kterou lze extrahovat z CistanchesHerba a má různé biologické funkce. Cílem této studie bylo prozkoumat ochranné účinky Cis na reprodukční poškození vyvolané hypoxií a prozkoumat specifické základní mechanismy. Byly zkonstruovány experimentální modely buněčné a zvířecí hypoxie a byly hodnoceny ochranné účinky různých podtypů Cis na samčí reprodukční systém in vitro i in vivo. Výsledky ukázaly, že hypoxie významně snížila životaschopnost GC-1 buněk prostřednictvím zástavy buněčného cyklu a aktivace apoptózy, které byly spojeny se zvýšeným OS. Navíc Cis vykazoval silné antioxidační účinky jak in vitro, tak in vivo, čímž významně obnovil aktivity antioxidačních enzymů a snížení hladin reaktivních forem kyslíku (ROS) při současném zvýšení životaschopnosti buněk a snížení apoptózy. Důležité je, že všechny zde studované podtypy Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C a Cis-H) vykazovaly určité antioxidační účinky, z nichž nejvýznamnější byly účinky Cis-B. Tato studie ukazuje, že Cis výrazně zmírňuje škodlivé účinky hypoxií indukovaného OS ovlivněním antioxidačních enzymových aktivit ve varlatech a GC-1buňkách.
Klíčová slova: Cistanosid, hypobarická hypoxie, mužská neplodnost, oxidační stres, ochrana reprodukce
čerstvá rostlina cistanche
Úvod
V současné době je přibližně 48,5 milionu (15 procent) párů v reprodukčním věku na celém světě postiženo neplodností [1], z nichž 40-50 procent případů je připisováno mužské neplodnosti [2], což je stav, který je úzce spojen s životním prostředím a životním stylem. faktory. Důkazy naznačují, že náchylnost savčích varlat k nízkému tlaku kyslíku je kauzálním faktorem některých forem mužské neplodnosti [3]. Jak bylo prokázáno v předchozích studiích, spermatogeneze je narušena a snížena při expozici hypobarické hypoxii [4-7].
Aby se prozkoumal základní mechanismus, studie prokázaly, že expozice hypobarické hypoxii zvyšuje produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) [8, 9]. ROS hraje důležitou roli v mužském reprodukčním systému. V nízkých hladinách jsou potřebné pro kapacitu spermií, akrozomovou reakci a fúzi spermatozoa-oocyt [10]. Nadměrná ROS však může vyvolat poškození spermatukleární/mitochondriální DNA a peroxidativní poškození plazmatické membrány, což jsou zase hlavní etiologické faktory pro zvýšené riziko mužské neplodnosti [11, 12]. Akumulace ROS vyvolaného hypoxií by tedy mohla být jednou z příčin mužské neplodnosti.
Cistanches Herba, vytrvalá parazitická léčivá rostlina, je široce rozšířena v suchých oblastech [13]a široce používána díky svým farmakologickým aktivitám [14-17]. Mezi všemi účinnými obsahy Cistanches Herba byly PhGs považovány za hlavní aktivní složku. Z rostlin Cistanches bylo dosud izolováno 34 PhG [13]. Cistanosid (Cis), anaktivní PhG izolovaný z Cistanches Herba, získal pozornost pro své antioxidační účinky.
Vzhledem k antioxidačním účinkům Cis a úloze ROS v hypoxií indukované mužské neplodnosti je Cis považován za potenciální lékový kandidát pro léčbu hypoxií indukované mužské neplodnosti. Nicméně jen málo zpráv se zabývalo antioxidačními účinky Cis extrahovaného z Cistanches Herba při léčbě hypoxií indukované mužské neplodnosti nebo souvisejících signálních drah. V této studii byly zkonstruovány in vitro a in vivo experimentální modely hypoxie a byly hodnoceny složky účinků různých Cis.
Cistanche má areprodukční produkční efekt.
Materiály a metody
Buněčná kultura a činidlo
Buněčná linie myších spermatogonií GC-1spg(GC-1) byla zakoupena od American TypeCulture Collection (ATCC) a kultivována v DMEM (Invitrogen, USA) doplněném 10 procenty fetálního hovězího séra, 1 procentem L- glutamin (100 mM), penicilin (100 U/ml) a streptomycin (100 ug/ml) při 37 stupních ve zvlhčeném inkubátoru s 5 procenty CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) byl zakoupen od Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Čína).
Test životaschopnosti buněk
Životaschopnost buněk byla testována pomocí {{0}}testu sady pro počítání buněk (CCK-8). Stručně řečeno, GC-1 buňky byly nasazeny do 96-jamkových destiček v množství 1,5×103 na jamku a kultivovány při 37 stupních po dobu 24 hodin. Poté byly buňky ošetřeny různými koncentracemi (20 procent, 15 procent, 10 procent, 5 procent) kyslíku nebo různými koncentracemi (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C , Cis-H) na požadovanou dobu. Poté byl supernatant odstraněn a pomocí soupravy CCK-8 (DojindoJapan) byla detekována životaschopnost buněk. Absorbance každé jamky byla měřena při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček (BioRad USA). Nakonec byla životaschopnost buněk vypočtena podle následujícího vzorce:
Životaschopnost buněk=(ODexperimentální skupina - ODblank skupina)/(ODkontrolní skupina - ODblank skupina) × 100 procent .
Western blot analýza
Sklizené buňky nebo tkáně byly homogenizovány v RIPA pufru pro extrakci proteinů (RIPA BeyotimeČína; Koktejl Roche Švýcarsko). Supernatanty byly shromážděny a koncentrace proteinů byla testována metodou BCA (Beyotime). Přibližně 40 ug extrahovaných proteinů z každého vzorku bylo separováno pomocí SDS-PAGE a elektrotransferováno na nitrocelulózovou (NC) filtrační membránu (BeyotimeChina). Membrány NC filtru byly blokovány 5% odtučněným mlékem po dobu 1,5 hodiny a inkubovány se specifickými protilátkami (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000, všechny protilátky byly zakoupeny od Cell Signaling Technology, USA) přes noc při 4 stupních. Poté byly všechny NC membrány inkubovány s odpovídající sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou po dobu 1,5 hodiny při pokojové teplotě a zobrazeny zobrazovacím systémem (Tannon, Čína).
práškové doplňky s extraktem z cistanche
Detekce buněčného cyklu
Pro analýzu buněčného cyklu byl proveden průtokový cytometrický test (FCM). Buňky byly ošetřeny za různých podmínek po dobu 72 hodin a sklizeny. Buňky byly poté promyty PBS, fixovány v 75% ethanolu a obarveny propidiumjodidem (PI). Pro každý vzorek bylo odebráno 1 x 104 buněk a analyzováno průtokovou cytometrií (FACSCalibur, BD Biosciences). Poté byl vypočítán podíl buněk fáze G1/S/G2 a index proliferace [Fáze(S plus G2)/Fáze (G1 plus S plus G2) × 100 procent].
Ki-67 barvení
Buňky byly kultivovány v konfokální misce a ošetřeny hypoxií nebo různými podtypy Cis po dobu 72 hodin. Po fixaci všech buněk 4% paraformaldehydem byly inkubovány s anti-Ki-67 protilátkou (1:200, Cell Signaling Technology). Poté byly všechny buňky inkubovány s odpovídající CY-3-konjugovanou anti-králičí IgG protilátkou (1:200, Boster, Čína) a roztokem DAPI (1,0 ug/ml, Beyotime). Fluorescence byla pozorována pomocí konfokálního mikroskopu Fluoview FV1000 (Olympus, Japonsko).
Detekce ROS
FCM byl zaveden pro měření intracelulárních hladin ROS pomocí DCFH-DA. Suspendované buňky byly vysety do 6-jamkových destiček a podrobeny různým úpravám. Po 72 hodinách léčby byly buňky suspendovány v DMEM bez séra s 10 uM DCFH-DA (Beyotime). Obsah ROS byl poté stanoven fluorescenčně aktivovaným tříděním buněk na Beckman Coulter Flow CytometrySystem s excitační vlnovou délkou 488 nm a emisní vlnovou délkou 525 nm [18].
Stanovení peroxidace lipidů (LPO)
Pro detekci LPO byl proveden test na reaktivní látky s thiobarbiturovou kyselinou (TBARS). Všechny operační kroky byly provedeny v souladu s instrukcemi (Sigma USA). Koncentrace byly vypočteny pomocí molárního extinkčního koeficientu 1,56 x 105/(M·cm), který byl získán za použití malondialdehydu jako standardu. Výsledky jsou vyjádřeny jako nmol ekvivalentů MDA/mg proteinu.
Stanovení enzymových aktivit
Enzymové aktivity byly testovány pomocí testovacích souprav zahrnujících glutathionreduktázu (GR), glutathionperoxidázu (GPx) a superoxiddismutázu (SOD). Všechny provozní kroky byly provedeny v souladu s dodanými pokyny (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China).
Zvířata a experimentální protokol
Dospělí krysí samci Wistar (180-220 g, 8 w staří) byli získáni ze zvířecího centra Čtvrté vojenské lékařské univerzity, Xi'an, Čína. Povolení k použití zvířat bylo získáno od Etického výboru univerzity (referenční číslo : 20190506). Experiment na zvířatech byl proveden podle univerzitních směrnic pro péči a použití laboratorních zvířat.
Všechny krysy se nechaly adaptovat přibližně jeden týden před zahájením experimentu. Po aklimatizaci byly krysy náhodně rozděleny do 6 skupin s 5 zvířaty v každé skupině. Krysy v kontrolní skupině byly chovány za normálního tlaku (PO2: 20 procent; tlak vzduchu: 101,3 kPa), zatímco krysy v modelové a cistreované skupině byly chovány v nízkotlaké kyslíkové komoře (vnitřní tlak 61,6 kPa, ekvivalentní výška 4000 metrů nad mořem; PO2: 14,55 procenta) pro simulaci hypoxického prostředí ve vysoké nadmořské výšce. Všechny krysy měly volný přístup k potravě a vodě v plastových klecích při teplotě 22 ± 2 stupně a vlhkosti s automatickým 12-hodinovým cyklem světlo/tma. Krysy v modelové skupině a skupině léčené Cis zůstaly v hypobarických podmínkách, ale byly každých 96 hodin přeneseny do normálních podmínek, přičemž jim byla poskytnuta potrava a voda a klece byly vyčištěny. Doba přechodu z hypobarického do hypobarického byla přibližně 2 hodiny. Všechny léčebné skupiny byly léčeny odpovídajícím Cis (8 mg/kg/d) orální sondou po dobu 8 týdnů, zatímco kontrolní a modelové krysy byly léčeny stejným objemem vody.
Po 8 týdnech byly krysy usmrceny v anestezii. Varlata, nadvarlata a semenné váčky byly odděleny a zváženy a orgánový index byl vypočten podle následujícího vzorce: (hmotnost orgánu/hmotnosti zvířete) x 100 procent. Následně byly odebrány spermie z nadvarlete a byla testována jejich pohyblivost a aktivita akrozomenzymu. Podobně byly odebrány testikulární tkáně pro histopatologické studie a detekci ROS, LPO a antioxidační enzymatické aktivity.
Hodnocení počtu živých spermií
Epididymis bylo naříznuto chirurgickými nůžkami a suspenze spermií byla připravena v normálním fyziologickém roztoku. Pro vyhodnocení rychlosti živých spermií bylo 5 μl suspenze spermií opatrně smícháno se stejným objemem barviva eosin-Y. Spermie byly poté počítány pod světelným mikroskopem. Míra živých spermií byla hodnocena výpočtem jak obarvených (mrtvé spermie), tak nebarvených spermií (živé spermie).
Cistanche tubulosa prášekzvyšujepočet živých spermií.
Pro více informací klikněte sem.
Stanovení enzymatické aktivity akrozomu spermií
K hodnocení akrozomových akrozomů ve spermatu byl použit test spermatických akrozomových enzymů [19]. Výsledky v každé skupině byly vypočteny pomocí následujícího vzorce: Aktivita akrozomového enzymu (μIU)=(ODExperimentgroup – skupina ODBlank)/(247,5×10) × 106.
Statistická analýza
Všechna kvantitativní data jsou vyjádřena jako průměr ± SD a byla analyzována pomocí softwaru SPSS 22.0. K porovnání dat mezi dvěma skupinami byl použit nezávislý Studentův t-test. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
