Část 1 Chronické onemocnění ledvin a stárnutí rozdílně snižují kostní materiál a mikroarchitekturu u myší C57Bl/6

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Chronické onemocnění ledvin a stárnutí rozdílně snižují kostní materiál a mikroarchitekturu u myší C57Bl/6

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Lau5, Ted Bateman4 , Tamara Alliston2,*, Karen B. King11, Virginia L. Ferguson1

1Katedra strojního inženýrství, University of Colorado, Boulder, CO

2Klinika ortopedické chirurgie, University of California, San Francisco, CA

3Katedra strojního inženýrství, University of Utah, Salt Lake City, UT

4Katedra biomedicínského inženýrství, University of North Carolina, Chapel Hill, NC

5Katedra biomedicínského inženýrství, The College of New Jersey, Ewing, NJ

6Pokročilý světelný zdroj, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA

7Katedra materiálových věd a inženýrství, Cornell University, Ithaca, NY

8Katedra bioinženýrství, University of Colorado, Denver, CO

9Katedra strojního inženýrství, University of Colorado, Denver, CO

10Katedra biochemie a molekulární a buněčné biologie, Georgetown University, Washington DC

11Katedra ortopedie, University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO *University of California Berkeley – University of California San Francisco Postgraduate Program in Bioengineering, San Francisco, CA

# Výzkumná divize, Nemocnice pro speciální chirurgii, New York, NY

Cistanche může pomoci při onemocnění ledvin

Abstraktní

Chronické onemocnění ledvin (CKD) je běžné onemocnění stárnutí a zvyšuje riziko zlomenin ve vyšším věku. Stárnutí a CKD různě zhoršují kostní obrat a mineralizaci. Předpokládáme tedy, že ztráta kvality kosti by byla největší při kombinaci pokročilého věku a CKD. Hodnotili jsme kost u mladých dospělých (6 měsíců), středního věku (18 měsíců) a starých (24 měsíců) samců myší C57Bl/6 tři měsíce po 5/6 nefrektomii, aby se vyvolalo CKD, nebo simulované procedury. CKD zhoršilo ztráty kortikální a trabekulární mikroarchitektury spojené se stárnutím. Stárnutí a CKD měly za následek tenčí, poréznější kortexy a méně a tenčí trabekuly. Kvalita kostního materiálu byla také snížena s CKD a tyto změny kostního materiálu byly odlišné od změn způsobených věkem. Stárnutí snížilo pevnost a modul v ohybu celé kosti, nanoindentační modul v mikrometrovém měřítku a napětí tkáně a kolagenu v nanometrovém měřítku (malý úhel rentgenového rozptylu (SAXS)). Naproti tomu CKD redukovalo práci na zlomenině a variace v modulu a složení kostní tkáně (Ramanova spektroskopie) a zvýšilo procento napětí kolagenu. Zvýšená zátěž kolagenovým kmenem byla spojena se ztrátou houževnatosti u CKD. Kromě toho se lakuny osteocytů s věkem u myší Sham zmenšily, řidší a neuspořádanější, ale tyto změny související s věkem nebyly u CKD jasně pozorovány. U CKD však větší mezery pozitivně korelovaly se zvýšenými hladinami fosfátů v séru, což naznačuje, že osteocyty hrají roli v systémové minerální homeostáze. Tato práce ukazuje, že CKD snižuje kvalitu kosti, včetně mikroarchitektury a vlastností kostního materiálu, a že ztráta kvality kosti s věkem je spojena s CKD. Tato zjištění mohou pomoci uvést do souladu, proč kostní hmota konzistentně nepředpovídá zlomeninu v populaci s CKD, a také proč jsou starší jedinci s CKD vystaveni vysokému riziku křehkosti.

Klíčová slova: ČKD; stárnutí; kvalita kostí; křehkost kostí; kolagen

1. Úvod

Chronické onemocnění ledvin (CKD) postihuje odhadem 23–36 procent starší populace a je spojeno se zvýšeným rizikem zlomenin a úmrtností související se zlomeninami (1,2). Ačkoli úbytek kostní hmoty (měřený pomocí rentgenové absorbometrie s duální energií) předpovídá budoucí zlomeniny ve všech fázích CKD, starší jedinci s nízkou kostní hmotou a CKD mají větší pravděpodobnost zlomenin ve srovnání s těmi, kteří mají nízkou kostní hmotu a zdravé ledviny. funkce (3). Riziko zlomenin kostí je u CKD obecně vyšší než účinky samotného stárnutí [4,5]. Například v tříleté studii měli jedinci ve věku 40–65 let se středně závažným až konečným stádiem CKD 1,7–5,1násobný nárůst prevalence zlomenin ve srovnání s kontrolami odpovídajícího věku, zatímco u osob ve věku 65 a více let výskyt CKD nadále zvyšoval. fraktury 1,8 – 4,3 násobku kontroly (4).

mikroarchitektura trabekulární kosti (10, 13), zatímco jiní neuvádějí žádné změny ve srovnání s kontrolou (9). Ačkoli se tyto studie liší v druzích a kmenech hlodavců, metodě indukce CKD a měřených výsledcích, tyto předchozí práce poskytují podstatný důkaz, že CKD mění kvalitu kostí.

Zůstává několik klíčových otázek o tom, jak CKD snižuje kvalitu kosti, do jaké míry je snížená kvalita kosti způsobena defekty v minerální vs organické fázi, a také jak změny kvality kosti ovlivňují ztrátu houževnatosti kostní tkáně. Je pozoruhodné, že ačkoli několik studií identifikovalo změny kolagenových příčných vazeb a zralosti tkání (tj. dobu od vzniku kosti) u CKD, není známo, zda jsou interakce kolagenových vláken v nanoměřítku během mechanického zatížení změněny CKD a zda tyto změny v nanomechanice ovlivňují celek. -houževnatost kostí (11, 12). Obecněji řečeno, hodnocení změn kvality a mechaniky kostí v reakci na CKD od nano- až po celou kostní délku dosud nebylo publikováno.

Nejistá je také role osteocytu v ovlivnění kvality kosti u CKD a stárnutí. Tyto buňky se chovají abnormálně podstatným zvýšením exprese FGF23 na počátku progrese CKD (7, 14). Osteocyt je nezbytný pro udržení kvality kostního materiálu a pro regulaci odolnosti proti zlomeninám kosti (15–17). Zdraví osteocytů je částečně indikováno lakunární morfologií. Lakunární morfologie osteocytů se mění, když se osteocyt účastní minerální homeostázy, jako je laktace (18, 19) a hypofosfatemie vázaná na x x (20). Lakunární geometrie se také mohou stát menšími, řidšími a neuspořádanějšími, a to jak stárnutím, tak i nepoužíváním (21–23). Změny lakunární morfologie osteocytů s CKD mají potenciál ovlivnit kmeny kostní tkáně, strukturální integritu a mechanosenzitivitu osteocytů (24). Dosud není známo, zda CKD ovlivňuje lakunární morfologie osteocytů a zda se takový vztah může měnit se stárnutím.

Ačkoli mezi běžnější populace s CKD patří starší dospělí, kombinované účinky stárnutí a CKD na kvalitu kostí musí být ještě prozkoumány. Předchozí práce prokázaly, že stárnutí snižuje modul, pevnost a práci do zlomeniny v ohybu (25), lomovou houževnatost (26), mikroarchitekturu kortikální a trabekulární kosti (27–29) a zvyšuje obsah minerálů a zralost (30, 31). Tyto změny na kosti se stárnutím jsou matoucí a vyskytují se napříč mnoha délkovými stupnicemi, přičemž mechanika celé kosti je ovlivněna změnami materiálu kostní tkáně a také struktury. Změny kostního materiálu a objemu kostí související s věkem jsou částečně ovlivněny sníženým obratem kostní tkáně (tj. vyšší zralostí tkání) a negativní rovnováhou v kostní mnohobuněčné jednotce (30,32). Tyto změny související s věkem kontrastují s abnormálním kostním obratem a mineralizací, které se často vyskytují u CKD. Ztráta mikroarchitektury souvisí s negativní bilancí, která se očekává se stárnutím a může se objevit u CKD (9, 10, 13). Tkáňová zralost se však zvyšuje se stárnutím a klesá v souvislosti s CKD s vysokým obratem. Existují značné mezery v pochopení podstaty křehkosti kostí u CKD a také toho, jak stárnutí a CKD v kombinaci snižují kvalitu kosti a odolnost vůči zlomeninám. Tyto mezery ve znalostech by zaplnilo objasnění kombinovaných účinků stárnutí a CKD na kvalitu kostí.

Účelem této studie bylo prozkoumat kombinované vlivy stárnutí a CKD na kvalitu kostí, od nano-až po celou délku kostí, na chirurgickém modelu CKD u stárnoucích myší. Předpokládali jsme, že CKD a stárnutí snižují kvalitu kosti, ale že tyto dva faktory by rozdílně a negativně ovlivňovaly vlastnosti materiálu kostní tkáně. Dále jsme předpokládali, že kombinované účinky stáří a CKD nejvíce poškozují kvalitu kostí. Abychom vyhodnotili tyto hypotézy, hodnotili jsme kvalitu kosti, včetně kortikální a trabekulární mikroarchitektury a vlastností kortikálního kostního materiálu, u mladých dospělých přes staré myši s CKD vyvolaným 5/6 nefrektomií (5/6 Nx) nebo falešnými operacemi.

O cistanche

2. Metody

2.1 Zvířecí model a příprava vzorku

Samci myší C57Bl/6 byli získáni z kolonie National Institute on Aging ve věku 3, 15 a 21 měsíců. Myši byly chovány v cyklu 12-h světlo / 12-h tma, umístěny jednotlivě v polykarbonátových klecích se standardní podestýlkou, krmeny Harlan Teklad 2920X potravou a byl jim umožněn volný přístup k vodě. Pro každý ze tří věků byly myši náhodně rozděleny do skupin CKD nebo Sham. Skupina CKD podstoupila dvoufázovou nefrektomii. Tyto postupy byly popsány dříve (33). Stručně řečeno, levá ledvina byla zpřístupněna řezem ve střední linii, dekapsulována, aby se zabránilo poškození močovodu a nadledvin, a poté odstraněna. O týden později byla pravá ledvina dekapsulována a horní a dolní pól byly částečně resekovány, aby se dosáhlo 2/3 zmenšení objemu ledviny. Kontrolní skupině byly ve stejném časovém rámci podány falešné procedury (tj. středová incize bez poškození ledvin). Myši byly během procedur anestetizovány za použití 1,5% isofluranu. Po těchto procedurách a před zotavením byla podávána pooperační dávka buprenorfinu (0,5 mg/kg) a také každých 12 hodin po další dva dny. Myši byly usmrceny po třech měsících pomocí CO2 a cervikální dislokace. Na konci studie bylo myší 6 (mladý dospělý; simulace: n=6, CKD: n=7), 18 (střední věk; simulace: n=8; CKD: n { {25}}) a 24 (starý; Sham: n=8; CKD: n=8) měsíců věku. Všechny zvířecí postupy byly schváleny Institutional Animal Use and Care Committee na University of Colorado Denver.

Levá femur, tibie, humerus, radius a ulna byly vyhrazeny pro analýzy kvality kosti. Levá holenní kost byla konzervována v 70% etanolu při 4 °C. Všechny ostatní kosti byly obaleny fosfátem navlhčenou gázou a skladovány při -20 °C až do analýzy.

2.2 Chemické složení séra a moči

Sérové ​​biochemické analýzy byly provedeny na krvi a moči odebrané na konci studie. Močovina v séru a moči, stejně jako koncentrace fosfátu, vápníku a PTH v séru, byly měřeny podle pokynů výrobce (BioAssays Systems a Immunotropics, v tomto pořadí).

2,3 microCT

Mikroarchitektura byla hodnocena pro kortikální kost střední části stehenní kosti a trabekulární kost proximální tibie pomocí microCT u všech studovaných myší (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, Švýcarsko). Stehenní kosti byly před skenováním přes noc rozmraženy při 4 °C. Skenování bylo prováděno s velikostí voxelu 10 um, po metodách získávání a analýzy popsaných dříve (10). Kortikální parametry zahrnovaly objem kosti / celkový objem (BV/ TV), plocha kosti / celková plocha (BA/TA), kortikální pórovitost (Ct. Po), tloušťku kůry (Ct. Th), celkovou minerální hustotu (TMD), moment setrvačnosti kolem mediálně-laterální osy (IML), vzdálenost mezi těžištěm a povrchem kosti v předozadním směru (C) a polární moment setrvačnosti (pMOI) (34). Trabekulární parametry zahrnovaly trabekulární počet (Tb.N), trabekulární rozteč (Tb.Sp), tloušťku trabekulární (Tb.Th), kostní objem (BV), celkový objem (TV), kostní objem / celkový objem (BV/TV), objemová hustota kostního minerálu (vBMD) a hustota konektivity (Conn.D). Po mikroCT byly stehenní kosti opět zabaleny do fosfátem navlhčené gázy a skladovány při -20 °C pro následnou mechanickou charakterizaci celé kosti.

2.4 Celokostní mechanické a materiálové vlastnosti

Po microCT se levé stehenní kosti ohýbaly ve třech bodech (Insight II Material Testing System, siloměr 250 N, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). Stehenní kosti byly vyjmuty z fosfátem pufrované gázy navlhčené fyziologickým roztokem a testovány na selhání za použití rychlosti vychýlení 5 mm/min na zakázkové kovadlině s rozpětím 8 mm. Křivky zatížení-posunutí byly analyzovány z hlediska mechanických vlastností včetně tuhosti, maximálního zatížení, posunu při maximálním zatížení, energie při maximálním zatížení, zatížení při kluzu, posunu při kluzu, energie na kluzu, posunu po kluzu, zatížení při lomu, posunu při lomu, a energie při zlomu. Mez kluzu byla definována jako průsečík sečny nakreslené s 10procentním snížením sklonu od počáteční tečné tuhosti a křivky zatížení-posunutí. Pomocí IML a C z µCT jsme odhadli vlastnosti materiálu včetně modulu ohybu, meze kluzu, mezního napětí a houževnatosti z údajů o tříbodovém ohybu za použití standardních rovnic ohybu paprsku, které byly aplikovány na myší femur (35).

2.5 Analýza tuhosti proximální tibie metodou konečných prvků

Ke zkoumání mechanického chování kosti bylo použito výpočetní modelování konečných prvků (FE) k simulaci axiální komprese proximální tibie v každém modelu. Proximální tibie byla vybrána, protože tibie je nosnou strukturou u myší a je běžným místem analýzy vlastností kosti pomocí microCT. Obrazová data MicroCT proximální tibie (kortikální a trabekulární kost) byla exportována jako 16-bitové řezy obrazu DICOM pro další segmentaci a konstrukci modelů konečných prvků specifických pro daný subjekt. Obrazová data DICOM byla importována do Mimics Innovation Suite 18 (Materialise, Leuven Belgie) pro zpracování obrazu a segmentaci za účelem vytvoření odpovídajícího modelu FE pro stejnou oblast proximální tibie kosti analyzované pomocí microCT. Kostní tkáň byla na snímku oddělena od ostatních tkání pomocí prahu segmentace 313 mg/cm3 (36,37). Jakmile byla oblast kosti segmentována, byla exportována síťka FE specifická pro subjekt, která obsahovala jak kortikální, tak trabekulární kompartmenty. Model konečných prvků používal hexaedrickou síť konečných prvků s velikostí izotropního prvku 10 µm.

Sítě konečných prvků exportované z Mimics byly importovány do ABAQUS CAE 6.9 pro přiřazení materiálových vlastností, aplikaci okrajových podmínek a simulaci axiálního mechanického zatížení. Materiálové vlastnosti kosti byly specifikovány jako homogenní, izotropní a lineárně elastické (Youngův modul, E= 10 GPa a Poissonův poměr, v= 0.3). Aby se simulovala axiální komprese, byla na uzliny na spodním povrchu kosti aplikována pevná hraniční podmínka a na uzly na uzlinách byl aplikován posun o 5 μm směrem dolů (0,5 procenta výšky segmentu kosti). horní povrch kosti. Strukturální tuhost kosti byla vypočtena jako reakční síla (N) přes aplikovaný posun.

2.6 Malý úhel rozptylu rentgenového záření

Deformace kolagenových fibril během testování jednoosého napětí kombinovaných loketních kostí a poloměrů byla měřena pomocí synchrotronového maloúhlového rentgenového rozptylu (SAXS) na linii paprsku 7.3.3 na Advanced Light Source (LBNL, Berkeley, CA) (38). Kosti byly zajištěny lepidlem a brusným papírem mezi svorkami na jejich distálním a proximálním konci. Insitutenzní testy byly provedeny s TST350 Tahovým testovacím stupněm (Linkam Scientific Inc.) na hydratovaných vzorcích při rychlosti posunu 2,5 µm/s. Během testování byla kostní diafýza vystavena rentgenovému záření o síle 10 keV po dobu 0,1 s každých 5 sekund. Celková radiace byla omezena na 30 kGy, aby se zmírnily účinky expozice na mechanické vlastnosti (39). Kolagenová d-rozteč, reprezentující opakující se oblasti mezery v kolagenové superstruktuře, se jeví jako výrazný Braggův difrakční pík ve vzoru SAXS. Deformace specifická pro kolagen během tahového testování byla měřena sledováním posunu v polohách Braggových píku při zvyšujícím se zatížení. S využitím vlastního programu LabVIEW byla tato progresivní změna ve vzoru rozptylu převedena na kmen kolagenových fibril normalizací na d-rozteč při nulovém zatížení, jak bylo diskutováno dříve (40). Napětí tkáně bylo vypočítáno ze sil zaznamenaných na testovací fázi děleno měřením plochy příčného řezu testovaných kostí. Součet oblastí průřezu ulny a poloměru byl měřen od středu délky ulny pomocí reflexního zobrazování ve světlém poli (Leica DM, objektiv 20x) a kvantifikován pomocí ImageJ (41). Kmeny celokostní tkáně byly získány pomocí uživatelského balíčku Digital Image Correlation (DIC) MATLAB, který sledoval a měřil vzdálenosti mezi mřížkou bodů překrývajících se na kostním vzorku během testování. Kmeny získané DIC byly kombinovány s napětími na úrovni tkáně, aby se vytvořily standardní křivky napětí-deformace. Z těchto křivek byl extrahován lineární modul pružnosti, stejně jako mez průtažnosti a mez průtažnosti, jak je definováno mez průtažnosti 0,2 procenta. Namáhání tkání bylo časově přizpůsobeno kmenům kolagenu ze SAXS při kluzu a maximálním napětí, aby bylo možné porovnat komponenty přenášející napětí s kostí během deformace.

Řízená analýza kompozitu ulna/radius během tahového testu byla provedena porovnáním kmene na úrovni tkáně ze snímků digitální kamery s kmeny vypočítanými ze vzorů rozptylu rentgenového záření. Digitální videa byla nezávisle zkontrolována dvěma vyškolenými pozorovateli na zlomeninu a sklouznutí tkáně (např. skluz mezi ulnou a radiem). Tyto události byly poté časově přizpůsobeny křivkám deformace a všechna data napětí-deformace byla zkrácena na první zlomeninu. Při analýze byla uvažována pouze data do první zlomeniny. Vzorky byly vyloučeny, pokud došlo ke skluzu mezi tahovými úchyty a kostmi, nebo pokud došlo ke skluzu mezi poloměrem, ke kterému došlo před první zlomeninou. Vzorky byly také vyloučeny, pokud existovala špatná korespondence mezi křivkami namáhání tkání a SAXS, což naznačuje, že bod paprsku byl zaměřen na ulnu, ale většina napětí byla přenesena do radia.

2.7 Posouzení složení a modulu kostní tkáně v mikroměřítku

Po tříbodovém ohnutí byly stehenní kosti histologicky dehydratovány v odstupňované sérii ethanolu, vyčištěny v acetonu a uloženy v PMMA. Zapuštěné kosti byly nařezány ve středním hřídeli stehenní kosti pomocí nízkorychlostní diamantové pily (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Vzorky byly rozemlety pomocí vlhkého papíru z karbidu křemíku (60{{10}} a zrnitostí 1200) a poté vyleštěny pastami z oxidu hlinitého (9, 5, 3, 1, 0,1, 0,05 µm) a jemné oděvy Rayon (South Bay Technologies, San Clemente, CA) s konečnou povrchovou úpravou 0,05 µm. Mezi každým krokem leštění byly vzorky sonikovány.

Ramanova spektroskopie byla provedena na mapách pokrývajících tloušťku kortikální kůry pomocí vlastního systému: konfokálního mikroskopického systému Renishaw inVia (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, Spojené království) s použitím laserového světla o vlnové délce 785 nm, které bylo vedeno kabely z optických vláken do 5{ {4}}x objektiv (NA 0,75) namontovaný na nanoindentorovém Z-stolici (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). Pro každé místo bylo shromážděno 10 nahromadění 10-sekundových expozic. Řady tří vrubů vzdálených od sebe 15 µm se rozprostíraly každých 10 µm skrz tloušťku kortikální kůry.

Fluorescenční základní čára byla odečtena pomocí polynomu 11. řádu a kosmické záření bylo odstraněno pomocí softwaru Renishaw WIRE. Referenční spektrum PMMA bylo odečteno od každého bodu pomocí vlastního kódu MATLAB. Tato korigovaná spektra byla poté analyzována na prolin (855 cm-1), v1 fosfát (961 cm-1) a v1 uhličitan (1071 cm-1). Poté byly vypočteny plošné poměry pro minerál: matrice (fosfát: prolin),

uhličitan: fosfát a krystalinita (převrácená poloviční šířce v plné maximální výšce píku fosfátu v1).

Nanoindentace byla poté provedena v místech odpovídajících místům hodnoceným pomocí Ramanovy spektroskopie. 5 um kulovitý hrot vtiskl kost rychlostí 30 nm/s, dokud nebylo dosaženo maximální hloubky 500 nm. Tato hloubka byla udržována po dobu 120 s, aby se umožnila disipace viskoelastické energie. Snížený modul (Er) byl vypočítán pomocí Oliver-Pharrovy analýzy s uvážením prvních 45 procent křivky odlehčení (42,43).

2.8 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Z humeru byla vypreparována veškerá měkká tkáň a kostní dřeň byla odebrána vodou. Humeri byly C, a pak centrifugovány, aby se odpařil přebytek HCl. Filtrované vzorky byly zředěny v poměru 1:5 v 10procentním acetonitrilu a 0.05procentní kyselině heptafluormáselné (HFBA), nanesené na reverzní fázi Gemini-NX C{{7} } kolona (Phenomenex, Torrance, CA) a analyzována na zesítění hydroxylysylpyridinolinu (HP), lysylpyridinolinu (LP) a pentosidinu v souladu s metodami popsanými Bank et al (44). Podrobnosti o systému HPLC (model 126, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) jsou podrobně popsány v Oren et al (45). Separace kolagenových příčných vazeb zahrnovala následující protokol: 15 min. rozpouštědla obsahujícího 24 procent methanolu a 0,15 procent HFBA, 10 min. rozpouštědla obsahujícího 40 procent methanolu a 0,05 procent HFBA a 10 min. rozpouštědla obsahujícího 75 procent acetonitrilu a 0,1 procenta HFBA. Kolona byla ekvilibrována ve 24 procentech methanolu a 0,15 procentech HFBA po dobu alespoň 10 minut. mezi běhy vzorků. Píky zesíťování kolagenu byly měřeny fluorescenčním detektorem (FP1520, JASCO; Easton, ML). Vlnové délky excitace a emise byly 295 nm a 400 nm pro HP a LP. Pentosidin byl detekován excitací 328 nm a emisí 378 nm. Kalibrační křivky byly vytvořeny z naměřených intenzit pěti ředění kalibrátoru obsahujícího purifikovaný HP a LP (Quidel Corporation) a pentosidin (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH).

Koncentrace příčných vazeb byly poté normalizovány na koncentraci kolagenu. Kolagen byl odhadnut z koncentrace hydroxyprolinu ve vzorku analyzovaném na příčné vazby. Alikvot vzorku analyzovaného na zesítění byl zředěn 1:50 a derivatizován 9-fluornylmethylchlorformiátem (46). Pro protokol aminokyselin byly použity následující roztoky (1) 20 mM kyselina citrónová, 5 mM tetramethylamoniumchlorid a 0,01 procenta azidu sodného, ​​pH 2,85; (2) 20 mM octan sodný, 5 mM tetramethylamoniumchlorid a 0,01 procenta azidu sodného, ​​pH 4,5, a (3) 100 procent acetonitril. Gradientní eluční profil je následující: od 0–11,5 min. gradient 75 procent (1) / 25 procent (3) až 60 procent (1) / 40 procent (3), po 13 minutách. přepnout na 64 procent (2) / 36 procent (1), od 13,1 −18 min. gradient 64 procent (2) / 36 procent (3) až 62 procent (2) / 38 procent (3), poté po 18 minutách. přechod na 25 procent (2) / 75 procent (3) až do konce cyklu ve 23 minutách. Kolona byla ekvilibrována v 75 procentech (1) / 25 procentech (3) po dobu alespoň 10 minut. mezi běhy vzorků. Aminokyselinové píky byly monitorovány při 254 nm excitaci a 630 nm emisi. Kalibrační křivka byla vytvořena z pěti ředění standardu aminokyselin připraveného z hydrolyzátu kolagenu (Sigma-Aldrich #A9531, St. Louis, Missouri). Kolagen má konstantní koncentraci hydroxyprolinu, takže koncentrace hydroxyprolinu byla převedena na koncentraci kolagenu (285 mol hydroxyprolinu na mol kolagenu).

2.9 Měření fluorescenčních AGEs

Fluorescenční AGEs v každém vzorku byly stanoveny fluorometrickým testem, který porovnává objem endogenní fluorescence kostní tkáně s chininovým standardem. Alikvot hydrolyzované kosti resuspendovaný s vnitřním standardem pro HPLC byl zředěn DI vodou na koncentraci 1,6 ug kosti/ml roztoku. Fluorescence zředěného hydrolyzátu a sériově zředěného zásobního roztoku chininu (zásobní roztok: 10 ug chininu/ml 0,1 N H2SO4) byla měřena v 96-jamkové destičce (produkt #3370, Corning) pomocí multimódová čtečka mikrodestiček (Synergy H1, BioTek) při excitaci 360 nm a emisi 460 nm.

Objemové fluorescenční AGE byly normalizovány na obsah kolagenu v kostní tkáni pomocí kolorimetrického testu hydroxyprolinu. Ve stručnosti, hydrolyzát byl dále zředěn na accm/ed zásobní roztok hydroxyprolinu (20}0 ug L-hydroxyprolinu/ml 0,001 N HCl). Ke zředěnému hydrolyzátu byl přidán chloramin-T pro zahájení reakce a roztoky byly inkubovány po dobu 20 minut. pokojová teplota. Reakce byla zastavena přidáním 3,15 M kyseliny chloristé a po 5-min. inkubační době při teplotě místnosti byl přidán p-dimethylaminobenzaldehyd. Dále byl roztok inkubován v 60stupňové vodní lázni po dobu 20 minut, poté ochlazen ve studené vodě ve tmě na teplotu místnosti. Absorbance vzorků a standardů byla měřena při vlnové délce 570 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Fluorescenční AGE jsou uváděny v jednotkách ng chininové fluorescence/mg kolagenu.

2.10 3D lakunární geometrie osteocytů

Levá tibie byla histologicky dehydratována v odstupňované sérii etanolu a obarvena 1% bazickým fuchsinem (47). Tibie pak byly očištěny acetonem a uloženy v poly(methyl)methakrylátu (PMMA). Zapuštěné vzorky byly příčně rozřezány 1 mm proximálně od spojení tibia-fibula pomocí nízkorychlostní pily (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Z distální části byl připraven broušený řez s cílovou tloušťkou 200 um (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Oklahoma City, OK).

Zobrazování pozemních řezů bylo prováděno v transmisi konfokálním laserovým skenovacím mikroskopem Zeiss LSM 710 s excitací 555 nm, pásmovým filtrem 568–1{8}}00 nm a objektivem s olejovou imerzí 40x. Rozlišení ve směrech x, y a z bylo 0,447 a 0,493 um. Vertikální z-stacks byly získány prostřednictvím viditelného rozsahu lakun osteocytů (50–100 µm hloubky zobrazení). 3D obrazy lakun osteocytů byly zkonstruovány a analyzovány na lakunární geometrie pomocí open-source programu 3D Osteocyte Lacunae Analysis a MATLAB v17 (21 ). Stručně řečeno, každý 2D obraz v rámci sady z byl automaticky segmentován, aby se definovaly mezery, které byly poté rekonstruovány ve 3D. Na základě nejlépe padnoucích elipsoidů byly lakuny analyzovány na objem, povrch, nejbližší těžiště, kulovitost (poměr nejmenšího k největšímu lakunárnímu poloměru, kde 1=koule), rozpětí theta (absolutní hodnota rozdílu 3D vektor popisující směr hlavní osy od průměrného směru všech lakun, zploštělost (−1=dokonale prolatovaná, 1=dokonale zploštělá) a hustotu lakunárního počtu (počet osteocytů/objem obrazu).

2.11 Analýza dat

Data jsou prezentována jako průměr ± standardní chyba průměru. Pro každé pole z Ramanovy spektroskopie a nanoindentace byly zprůměrovány tak, že každá kost měla jednu hodnotu pro každé měření v mikroměřítku. Podobně byla vypočtena standardní odchylka pro každé pole pro odhad prostorové variability kostní tkáně v mikroměřítku. Účinky stárnutí a CKD, stejně jako jejich interakce, byly testovány pomocí dvoucestné ANOVA pro všechny parametry. Závislé proměnné byly v případě potřeby transformovány, aby byly splněny předpoklady zbytkové normality a homoskedasticity. Význam pro hlavní efekty byl apriori nastaven na p < 0.05.="" v="" případě="" významné="" interakce="" mezi="" věkem="" a="" ckd="" bylo="" provedeno="" post-hoc="" testování="" k="" testování="" účinku="" ckd="" v="" každém="" věku.="" u="" těchto="" post-hoc="" analýz="" byla="" pomocí="" bonferroniho="" upraveného="" alfa="" testována="" rodinná="" chyba,="" což="" vedlo="" ke="" kritickému="" alfa="" 0.05="" 3="0.017." výsledky,="" kde="" srovnání="" jednoduchých="" účinků="" měla="" p-hodnoty="" mezi="" 0,017="" a="" 0,05,="" byly="" interpretovány="" jako="">

Lineární regrese byla provedena za účelem testování, zda měření kvality kosti v nano-mikroměřítku predikují mechanickou houževnatost celé kosti. Protože mechanické vlastnosti celé kosti vykazují silnou závislost na věku, tato lineární regrese zahrnovala věk jako kovariát. Spearmanovy korelace byly také hodnoceny pro lakunární geometrie osteocytů a měření z chemického složení séra a moči a pro PTH a měření kvality kosti v mikroměřítku. Významnost pro lineární regrese a korelace byla stanovena na p < 0,05.="" pro="" všechny="" analýzy="" byl="" použit="" minitab="">

Odlehlé hodnoty byly identifikovány pomocí Grubbsova testu (úroveň významnosti=0,05). Několik odlehlých hodnot bylo vyloučeno z analýz sérového vápníku a močoviny. U všech analýz kortikální a trabekulární mikroarchitektury a také analýzy FEA byla vyloučena odlehlá hodnota za 24-měsíc Sham a CKD. Jedna odlehlá hodnota byla vyloučena ze 24-měsíční skupiny CKD pro analýzu LP a jedna odlehlá hodnota byla vyloučena pro 24-měsíční skupinu Sham kvůli houževnatosti, práci do zlomu a posunu po výtěžku. Jedna samostatná 24-měsíční Sham odlehlá hodnota byla nalezena pro standardní odchylku nanoindentačního modulu a standardní odchylku krystalinity.