Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaada, Blaise Robin3, Joeille Perez', Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine', Lea Guyonnet', Helene Lazareth', Emmanuel Letavernier, Carole Henique', Pierre-Louis Tharaux' a Olivia Lenoir

'Université de Paris, PARCC, Inserm, Paříž, Francie; a Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Paříž, Francie

Silná prediktivní hodnota proteinurie u chronických glomerulopatií je pevně stanovena stejně jako patogenní úloha angiotensinu II podporovat progresi glomerulárního onemocnění se změněnou glomerulární filtrační bariérou, poškozením podocytů a zjizvením glomerulů. Zde jsme zjistili, že chronická hypertenze indukovaná angiotensinem II inhibovala tok autofagie v myších glomerulech. Delece Atg5 (genu kódujícího protein zapojený do autofagie) specificky v podocytu vedla k akcelerované angiotensinem I indukované podocytopatii, akcentované albuminurii a glomeruloskleróze. To ukazuje, že autofagie je v tomto stavu klíčovým ochranným mechanismem v podocytu. Aktivita calpainu indukovaná angiotensinem-II v podocytech inhibuje tok autofagie. Podocyty z myší s transgenní expresí endogenního inhibitoru calpainu calpastatinu vykazovaly na začátku vyšší autofagii podocytů, která byla rezistentní k inhibici závislé na angiotensinu II. Také trvalá autofagie s kalpastatinem omezila poškození podocytů a albuminurii. Tato zjištění naznačují, že hypertenze má patogenní účinky na glomerulární strukturu a funkci, částečně prostřednictvím aktivace calpainů vedoucí k blokádě autofagie podocytů. Tato zjištění odhalují originální mechanismus, kterým hypertenze zprostředkovaná angiotensinem II inhibuje autofagii prostřednictvím vápníkem indukovaného náboru calpainu s patogenními důsledky v případě nerovnováhy aktivity calpastatinu. Prevence poklesu autofagie zprostředkovaného calpainem tedy může být slibnou novou terapeutickou strategií pro nefropatie spojené s vysokou aktivitou renin-angiotenzinového systému.

Cistanchedeserticola bráníledvinachoroba

Překladové prohlášení

Vzhledem k zásadní roli autofagie ve vývojiledvinanemocíFarmakologická modulace autofagie by mohla být slibnou strategií pro prevenci a léčbu několika onemocnění ledvin. Současně bylo zjištěno, že nadměrná aktivace aktivity calpainu v podocytech má škodlivé účinky na funkci podocytů, zatímco jeho škodlivé mechanismy účinku nebyly identifikovány. Zde poskytujeme důkaz, že calpain spojuje škodlivé působení angiotensinu II se škodlivou blokádou autofagie v podocytech a navrhujeme, že inhibice calpainu by mohla být slibným terapeutickým cílem pro onemocnění podocytů částečně prostřednictvím udržování autofagie podocytů.

Hypertenze je na druhém místě po diabetu jako hlavní příčina progresechronickýledvinachoroba- a dokonce i mírné zvýšení krevního tlaku je nezávislým rizikovým faktorem pro konečné stadium onemocnění ledvin. Rostoucí počet experimentálních studií zdůraznil význam podocytů při vývojiledvinazranění. Progresivní ztráta podocytů a mikrovaskulární změny se objevují časně s poklesem funkce ledvin u experimentální hypertenzní nefropatie. U pacientů se ukázalo, že vylučování životaschopných podocytů močí je citlivým a specifickým markerem preeklampsie a pacienti s nefrosklerózou měli významně nižší hustotu glomerulárních podocytů než dárci ledvin. Patogenní úloha angiotenzinu II (Angel) podporujícího progresi glomerulárního onemocnění je dále dobře prokázána, a to nejen u hypertenzních stavů, ale také u několika glomerulárních onemocnění.

Glomerulární hypertenze má za následek natažení glomerulárních kapilár, poškození endotelu a zvýšenou filtraci glomerulárních proteinů způsobující glomerulární kolaps a glomerulosklerózu. Působí také přímo na glomerulární struktury, což způsobuje signalizační regulační reakce zaměřené na kompenzaci. Aktivovaný systémový a lokální renin-angiotenzin-aldosteronový systém (RAAS) podporuje mezangiální hyperplazii a syntézu faktorů vaskulární permeability. Současně podocyty vykazují kalciovou signalizaci a modifikují svůj tvar na receptoru AngLI typu 1 (AT1)-28Tyto adaptivní mechanismy závislé na stimulaci.{5}} se z dlouhodobého hlediska stávají maladaptivními, což nakonec vede ke glomeruloskleróze. AT1 zprostředkovává prominentní zapojení RAAS pro krevní tlak a homeostázu soli a vody. Inhibitory angiotenzin-konvertujícího enzymu a blokátory AT1 se klinicky používají k léčbě hypertenze a srdečního selhání u pacientů. Zajímavé je, že oba blokátory také vykazují ochranný účinek naledvinafunkce.

Bylo prokázáno, že autofagie je nezbytná pro udržení buněčné homeostázy, zejména v postmitotických a zejména v podocytech.{0}} Autofagie je systém degradace cytoplazmatických proteinů a dysfunkčních organel s dlouhou životností spojený s olysozomy55 a zahrnuje sekvestraci proteinů a organel. v autofagosomech. Tvorba autofagozomů je závislá na indukci několika genů včetně Mapllc3a/b, Berlin 1 a Atgs. Existuje stále více důkazů, že dysregulace autofagické dráhy se podílí na patogeneziledvinastárnutí a několikledvinaonemocnění, jako je akutní poškození ledvin, polycystické onemocnění ledvin, stárnutí a diabetická nefropatie.

Regulace autofagie v podocytech, fyziologická a především v patologickém kontextu, není příliš známá. Nedávno jsme prokázali, že autofagie podocytů je nezávislá na mechanistickém cíli regulace rapamycinu (mTOR) ve fyziologických podmínkách, což z tohoto typu buněk činí výjimku. Aktivace AT1 stimuluje syntézu bílkovin a přeměnu bílkovin v buňkách. Usoudili jsme tedy, že aktivace RAAS může také ovlivnit stimulaci obratu proteinů a proteostázu.

V této studii jsme se zaměřili na roli AnglI signalizace v regulaci autofagie podocytů. Identifikovali jsme vápníkem aktivované proteázy calpainy zprostředkovávající chronický blokující účinek AnglI na autofagii podocytů. Dále jsme zjistili, že endogenní inhibitor calpainu calpastatin byl schopen zabránit inhibici autofagie závislé na AngI a poškození podocytů během hypertenze.

Tato zjištění odhalují originální mechanismus, kterým hypertenze zprostředkovaná AngLI inhibuje autofagii prostřednictvím vápníkem indukovaného náboru calpainu s patogenními důsledky v případě nerovnováhy aktivitou calpastatinu.

METODY

Zvířata

Kalpastatinové transgenní (CST18) myši laskavě poskytl Dr. E. Letavernier. Myši s podocytově specifickým narušením Atg5) byly generovány podle dříve popsaného genu (Nphs2.cre Atg5'o křížením myší Nphs2.cre s Ag5lxlomice5 na pozadí C57BL6/J. Myši Nphs2.cre Atg5'oxlox a kontrolní samci ze stejného vrhu , ve věku 10 až 12 týdnů. Hypertenzní model byl indukován sc infuzí AngLI (Sigma-Aldrich, A9525) v dávce 1 ug/kg/min po dobu 4 až 6 týdnů prostřednictvím osmotické minipumpy (Alzet Corp, model 2006). Pumpy byly implantovány do zad mezi lopatky a boky. Myši dostávaly doplněk soli (3 procenta NaCl) v potravě. Atgsloxilox (wild-type [WT]) myši byly použity jako kontroly v všechny studie. V případě soli deoxykortikosteronacetátu (DOCA) s modelem redukce nefronů dospělí samci myší podstoupili jednostrannou levou nefrektomii. Dva týdny po nefrektomii jim byly implantovány pelety DOCA s 21-denním uvolňováním (Innovative Research of America) sc Druhá peleta byla implantována 3 týdny po první implantaci.Všechny myši re dostávali 0,9 procenta NaCl v pitné vodě ad libitum a byli usmrceni po 6 týdnech podávání DOC.6 Pokusy byly prováděny podle francouzských veterinárních směrnic a směrnic formulovaných Evropským společenstvím pro použití na pokusných zvířatech (L358-86/609EEC) a byly schváleny francouzským ministerstvem výzkumu a etickou komisí místního univerzitního výzkumu (APAFIS-7646 a -22373).

Primární experiment s kultivací podocytů

Diferencované primární podocyty byly kultivovány, jak bylo popsáno dříve./ Stručně řečeno, čerstvě izolovaná ledvinová kůra byla smíchána a štěpena kolagenázou I (Gibco, {{0}}) v Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies,{{2 }}). Tkáně pak prošly přes 70 μm a 40 μm buněčná síta (BD Falcon, 352340 a 352350). Glomeruli, které ulpívají na 40 um buněčném sítku, byly odstraněny fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS; Life Technologies, 10010023) plus 0,5 procenta hovězího sérového albuminu (Eurobio, HALALB07-65) injikovaným pod tlakem a poté byly dvakrát promyty v PBS. Čerstvě izolované glomeruly byly umístěny do 6-jamkových misek v Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) doplněné 10 procenty fetálního telecího séra a 1 procentem penicilinu/streptomycinu (Life Technologies, 15140122), aby podocyty mohly opustit glomeruly a růst. Obohacení podocytů bylo ověřeno analýzou Western blot jako dříve (doplňkový obrázek S1). Podocyty byly kultivovány v nepřítomnosti nebo přítomnosti bafilomycinu AI (100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) po dobu 4 hodin. Pro imunofluorescenční experimenty byly primární podocyty naneseny na 4 štítky misek (Dutcher, 055071). Podocyty byly poté fixovány v paraformaldehydu 4 procenta po dobu 10 minut a zpracovány pro imunofluorescenci.

Test aktivity calpainu

Intracelulární aktivita kalpainu byla stanovena v primárních podocytech, jak bylo popsáno dříve. Celkem 100000 buněk bylo kultivováno v 24-jamkových tkáňových kultivačních miskách v Roswell Park Memorial Institute 1640 doplněných 10 procenty fetálního telecího séra a 1 procentem penicilinu/streptomycinu. Po uvedené kultivační periodě bylo médium nahrazeno roztokem Krebs-Ringer HEPES bikarbonátu (KRH) (pH 7,4) obsahujícím 4 mM CaCl2, s nebo bez 10 uM inhibitoru calpainu-1 a inkubováno po dobu 10 minut před přidáním 50 mM calpainového substrátu N-sukcinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-methykumarinu (Sigma-Aldrich, S6510). Po 90-minutové inkubační době byla aktivita cal-pain stanovena jako rozdíl mezi fluorescencí (měřenou při 360 nm excitaci a 430 nm emisi) s a bez inhibitoru calpainu-1.

Western blot

Primární podocyty byly poškrábány 8 0 ul radioimunoprecipitačního testovacího pufru obsahujícího fosfatázu a inhibitor proteázy. Koncentrace proteinu byla měřena pomocí soupravy BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Dvacet mikrogramů proteinů bylo podrobeno elektroforéze na prefabrikovaném gelu Criterion XT (12 procent Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Proteiny byly přeneseny na polyvinylidendifluoridovou membránu (Thermo Fischer Scientific, 88518). Po zablokování v 5% mléce v Tris Buffer Saline 0,1% Tween (TBS-T) byly membrány inkubovány s králičím polyklonálním anti-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), králičím polyklonálním anti-ATG5 (1:2000,Cell Signaling Technology,2630),morčecí polyklonální anti-sekvestozom 1 (SQSTM1)/P62(1:10 000, PROGEN,GP62), králičí polyklonální anti-calpain 1 doména IV (1:1000, Abcam,ab39170 ), králičí polyklonální anti-calpain 2 amino-terminální konec domény I (1:1000, Abcam, ab39165), myší monoklonální IgG1 anti-calpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325),králík anti-podocin (1:1000, Abcam, ab50339), morčecí anti-nefrin (1:500, PROGEN, GP-N2) a potkaní monoklonální anti-tubulin (1:5000, Abcam, ab6160). Po promytí byly membrány inkubovány s protilátkou spojenou s křenovou peroxidázou (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Detekce specifických signálů byla provedena pomocí ECL Chemiluminescent Kit (Bio-Rad, 170-5070) na zařízení LAS 4000 (Fuji). Pro kvantifikaci byla použita denzitometrická analýza pomocí softwaru ImageJ (National Institutes of Health).

Měření krevního tlaku a fyziologická vyšetření

Systolický krevní tlak myší byl zaznamenáván pomocí metody manžety na ocasu (Visitech Systems Inc., BP-2000). Bylo provedeno deset měření od každé myši a poté byla stanovena střední hodnota. Systolický krevní tlak byl měřen na začátku (12 týdnů věku) a poté jednou týdně až do konce léčebného období. Všechny myši byly umístěny do metabolických klecí s volným přístupem k vodě na 6-hodinový sběr moči. Koncentrace kreatininu v moči a plazmatické močoviny byly analyzovány spektrofotometricky pomocí kolorimetrické metody (Olympus, AU400). Vylučování albuminu močí bylo měřeno pomocí specifického enzymového imunosorbentního testu pro kvantitativní stanovení albuminu v moči myší (Crystal Chem, 80630).

Histologie

Ledviny byly odebrány a fixovány ve 4% PBS-pufrovaném formalínu. Řezy zalité v parafínu (tloušťka 3-um) byly obarveny Massonovým trichromem pro hodnocení morfologie ledvin. Abnormality v ledvinách byly odstupňovány na základě přítomnosti a závažnosti dílčích abnormalit, včetně glomerulosklerózy, mezangiální expanze, tubulární atrofie nebo odlitků a fibrózy. Podíl sklerotických glomerulů byl hodnocen slepým vyšetřením alespoň 50 glomerulů na řez ledviny.

Imunofluorescenční barvení řezů ledvin a primárních podocytů

Fixované primární podocyty byly blokovány v TBS-T 3% bovinním sérovém albuminu a inkubovány přes noc při 4 stupních s primárními protilátkami morčete anti-SQSTM1/P62(1:1000, PROGEN, GP-62C) a králičí anti-zelené fluorescenční protein (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Po propláchnutí TBS-T sekundární protilátky konjugované s fluoroforem oslí anti-morčecí IgG AF594-konjugovaná protilátka (Jackson ImmunoResearch,706-585-148) a oslí anti-králičí IgG AF488-konjugovaná protilátka( Invitrogen, A21206). Snímky byly pořízeny pomocí fluorescenčního mikroskopu Zeiss 2, kamery AxioCam HRc a softwaru Axiovision 4.3.

U ledvin fixovaných ve formalínu zalitých v parafínu (FFPE) byly řezy (3 um) zbaveny parafinu a hydratovány a získání antigenu bylo provedeno v zahřátém citrátovém pufru (pH 6). Řezy byly poté permeabilizovány Tritonem 0,1 procenta (Euromedex) a blokovány v TBS-T3 procentním hovězím sérovém albuminu před inkubací přes noc při 4 stupních. Použili jsme kozí anti-nefrin (1:100, PROGEN, GP-N2), morčecí anti-SQSTM1/P62 (1:1000,PROGEN, GP-62C), králičí anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), kozí anti-Podocalyxin (PODXL; 1:1000, Bio-Techne, AF-1556) a králičí anti-Wilm's Tumor 1(WT1;1:100, Abcam, ab192) protilátka. Sekundárními protilátkami byly Alexa 488- a Alexa 568-konjugované protilátky od Invitrogen. Jádra byla obarvena modře pomocí Hoechst. Sklíčka byla upevněna pomocí fluorescenčního montážního média (Dako, S3023). Mikrofotografie byly pořízeny fotomikroskopem Zeiss Axiophot a softwarem Axiovision. Poloautomatické kvantifikace na Fidži byly použity pro kvantifikaci nefrin-pozitivních a PODXL plus ploch na glomerulární řez na alespoň 30 glomerulech na myš. Počet podocytů byl počítán jako počet WT1 plus jader na glomerulární řez na alespoň 30 glomerulech na myš.

Postup transmisní elektronové mikroskopie

Malé kousky ledvinové kůry (1 mm) byly fixovány ve 3% glutaraldehydu EM grade (Electron Microscopy Sciences) po dobu 1 až 3 0 dnů a třikrát promyty v PBS. Vzorky byly postfixovány v 1 procentu oxidu osmičelého 0,1 M (Electron Microscopy Science) v 0,1 M PBS (pH 7,4) a promyty vodou. Vzorky byly dehydratovány v alkoholech a 100% propylenoxidu (Electron Microscopy Science). Infiltrace pryskyřice byla provedena následovně: míchat Epikote 812 a propylenoxid v poměru 1:1 po dobu 30 minut a následně míchat Epikote 812 a propylenoxid v poměru 1:2 pro pokojovou teplotu přes noc. Vzorky byly zality do 4mm želatinových kapslí ve 100% Epikote 812 a polymerovány v peci zahřáté na 60 °C. Ultratenké řezy byly nařezány ultramikrotomem UFC7 (Leica Microsystems GmbH) a umístěny na Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). Byly kontrastně obarveny acetátem uranylu 7 procent (LFG Distribution) a Reynoldovým citrátem olovnatým (LFG). Vzorky byly zkoumány v transmisním elektronovém mikroskopu JEM1011 (JEOL) s CCD kamerou Orius SC1000 (Gatan), provozovanou se softwarem Digi-talMicrograph (Gatan) pro získání.

Pole kvantitativní polymerázové řetězové reakce

Čerstvě izolované glomeruly byly zmrazeny v reagentu QIAzol Lysis (Qiagen) na -80 stupeň. Celková extrakce RNA metodou na bázi fenolu byla zpracována podle doporučení výrobce. cDNA byly syntetizovány pomocí soupravy RT²First Strand Kit (Qiagen, 330401) a polymerázová řetězová reakce (PCR) v reálném čase byla provedena pomocí Custom RT²Profiler PCR Array（ Qiagen, CLAM36771C) s RT'SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502). Kvantitativní PCR destičky byly spuštěny na cykléru Applied Bio-systems StepOnePlus. Každé pole obsahuje kontrolu kvality pro účinnost reverzní transkripce a kontaminaci genomové DNA. Kvantitativní PCR analýza byla provedena pomocí 2-△△CT metody s pomocí GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) a vyjádřeno jako log2 násobná změna v genové expresi.

In silico proteomická analýza

In silico predikce místa štěpení calpainu byla provedena pomocí DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) a CaMPDB (http:// calpain.org/) online nástroje. Aminokyselinová sekvence myšího proteinu byla získána od Uniprot (https://www.uniprot.org). Výsledky jsou shrnuty v doplňkových tabulkách S1 a S2.

Statistické analýzy

Všechny grafy představují jednotlivé hodnoty a průměr ± SEM. Statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru GraphPad Prism, verze 9. Srovnání mezi 2 skupinami bylo provedeno pomocí parametrického Studentova t-testu, když vzorky prošly Anderson-Darlingovým a D'Agostinovým testem normality a F testem na rovnost rozptylu. Jinak byl použit neparametrický Mann-Whitney test. Srovnání mezi více skupinami bylo provedeno pomocí 1-way nebo 2-way analýzy rozptylu, po které následoval test vícenásobného srovnání se Sidakovou korekcí. Hodnoty P<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Obrázek 1| Hypertenze indukovaná angiotensinem I (Angel) plus dietou s vysokým obsahem soli (HSD) inhibuje glomerulární autofagii. (ac)

Imunofluorescence Podokalyxinu (PODXL; červená) a P62 (zelená) v glomerulech (a, a') od myší divokého typu (WT), (b, B) od myší WT po 6 týdnech Angel plus HSD a (c) z myší Nphs2.cre Atgsl/ox ukazující akumulaci P62 v podocytech během hypertenze a u podocytově specifických ATG5-deficientních myší. Šipky označují P62 plus tečky ve WT v (a'). Jádra byla kontrastně obarvena Hoechst (modrá). Dílčí části obrázku s prvočíslem označují vyšší zvětšení. Pruhy =50 μm. （d）Související kvantifikace P62 plus je vyjádřena jako procento glomerulární oblasti.n =4 WT myší a n=5 WT s Angel plus HSD a Nphs2.cre Atgsoxlo myší. Hodnoty jsou uvedeny jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Mann-Whitney test:*P= 0.0159.

Hypertenze vyvolaná Angel plus dietou s vysokým obsahem soli inhibovala autofagii podocytů

Podocyty představují vysokou úroveň autofagie in vivo, jak ukazuje silná exprese GFP u transgenních myší s fúzí GFP s LC3 (myši GFP-LC3), klíčovým markerem autofagie (doplňkový obrázek S2A). Autofagie je dynamický proces s neustálou tvorbou autofagozomů a degradací autofagolyzozomů. Blokování autofagozomální degradace chlorochinem vedlo k akumulaci GFP plus teček, což naznačuje vysoký autofagický tok v podocytech (doplňkové obrázky S2A a B). Potvrzení, že GFP plus tečky byly autofagozomy, bylo prokázáno dvojitou imunofluorescencí pro GFP a SQSTM1/P62, chaperonový protein degradovaný autofagií (doplňkový obrázek S2C a D). Opět, léčba chlorochinem indukovala akumulaci GFP plus P62 plus tečky, což prokázalo důležitý autofagický tok v podocytech. Nakonec byl in vitro konzervován vysoký autofagický tok, jak ukazuje exprese GFP a P62 v primárních podocytech izolovaných z myší GFP-LC3 a silná akumulace teček GFP plus a P62 plus při léčbě bafilomycinem Al, dalším blokátorem autofagozomální degradace (doplňkový obrázek S2E- H).

Schopnost hypertenze modulovat autofagické reakce podocytů byla poté hodnocena u myší infuzí AngII s dietou s vysokým obsahem soli (HSD) po dobu 6 týdnů a u nehypertenzních kontrol. Jak je znázorněno na obrázku 1, AngLI plus HSD indukovaly akumulaci P62 v glomerulech se silnou akumulací v podocytech, což naznačuje, že Angl plus HSD byl zodpovědný za blokádu autofagie podocytů (obrázek land). Je zajímavé, že akumulace P62 v podocytech byla podobná té, která byla pozorována u myší s deficitem autofagie podocytů (myši Nphs2.cre Atg5'olox). V jiném modelu hypertenze, modelu DOCA-salt, jsme také pozorovali progresivní akumulaci P62 v podocytech podél časový průběh onemocnění (doplňkový obrázek S3).

Delece Atg5 specificky v podocytech má za následek zvýšenou albuminurii, ztrátu podocytů a glomerulární poškození v modelu Angel plus HSD

Poté jsme zkoumali, zda autofagická blokáda pouze u podocytů (myši Nphs2.cre Atg5laxlox) ovlivňuje glomerulární poškození v modelu AngLI plus HSD. Nejprve jsme potvrdili, že Nphs2. Myši cre Atg5 měly normální krevní tlak, normální funkci ledvin a žádné glomerulární histologické léze do 10 měsíců věku, jak bylo dříve hlášeno (doplňkový lox (WT) a Nphs2.cre Atgslox obrázek S4).2 Poté byly myši Atg5'cl infuzí AngII s HSD po dobu 6 týdnů. Důležité je, že systolický krevní tlak byl podobný ve 2 skupinách po infuzi AngLI v průběhu studie (obrázek 2a), ačkoli metoda manžety na ocasu použitá k měření krevního tlaku nemusela mít schopnost vyřešit malé rozdíly v krevním tlaku. Infuze Angl s HSD výrazně zvýšila poměr albuminu ke kreatininu v moči u WT myší a tento účinek byl dále významně zvýšen u myší (obrázek 2b). Hypertenzní myši Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre Atgsoxlox myši také vykazovaly významně zvýšenou glomerulární sklerózu ve srovnání s WT sourozenci (obrázek 2c-e). V souladu s naměřenou proteinurií byly proteinové odlitky a tubulární dilatace významně častější u myší s deficitem podocytů v ATG5 (obrázek 2f-h).

Počet podocytů na glomerulus byl významně snížen u Nphs2.cre Atg5loxlox (obrázek 2i-k). Poškození podocytů u myší Nphs2.cre Atgsoxlo s infuzí AngII plus HSD dokonce progredovalo do fokální a segmentální glomerulosklerózy, jak ukazuje exprese parietálních epiteliálních buněk (PEC ) aktivační marker CD44 v glomerulech (obrázek 2l a m). Analýza elektronovou mikroskopií identifikovala významné změny spojené s nedostatkem ATG5 po chronické infuzi AngII s HSD, včetně vymazání chodidel u… myší. Naproti tomu málo ultrahypertenzních Nphs2. cre Atg5'oxlx strukturální defekty byly nalezeny v podocytech od WT myší dokonce po 10 týdnech AngII infuze s HSD (obrázek 2n a o), což ukazuje, že autofagická aktivita podocytů je nutná pro jejich odolnost vůči Angel plus HSD-indukovanému poškození. Celkově naše výsledky ukázaly, že v modelu AnglIl plus HSD inhibice autofagie zhoršuje poškození a ztrátu podocytů a indukuje následnou fokální a segmentální glomerulosklerózu.

Obrázek 2|Delece Atg5 specificky v podocytech vede k významnému zvýšení albuminurie, poškození ledvin a ztrátě podocytů po 6 týdnech infuze angiotensinu II (Angel) plus diety s vysokým obsahem soli (HSD). (a) Systolický krevní tlak u myší Atgslo/ba Nphs2.cre Ataslo během 36 dnů u myší Angel plus HSD.n =9 na genotyp. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SEM. Dvoucestná analýza rozptylu (ANOVA): ns. V (bm) n =10 myší na genotyp. V(b,g,h,k) jsou hodnoty prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM.(b) Angel plus HSD (pokračování

Obrázek 3| Exprese a aktivita calpainu v podocytech.(a) Western blot analýza exprese calpainu-1.calpain-2 a calpainu-4 v primárních podocytech. Exprese tubulinu slouží jako normalizace. (b) Aktivita calpainu byla měřena na primárních podocytech ošetřených nebo neošetřených angiotensinem II (Angel; 100 nM) po dobu 24 hodin s nebo bez kalpeptinu (10 uM), n =5 nezávislých experimentů. Hodnoty jsou uvedeny jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA): léčba, P=0.0035.Sidakův vícenásobný srovnávací test:*P=0.0128 pro Angll versus výchozí hodnota,“ P=0.0056 pro Angll plus kalpeptin versus Angll.(c) Aktivita calpainu byla měřena na primárních podocytech od myší divokého typu (WT) nebo myší transgenních pro kalpastatin (CST') léčených nebo neléčených Angelem (100 nM) po dobu 24 hodin. n {{18} } nezávislé experimenty. Hodnoty jsou uvedeny jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Dvoucestná ANOVA spárovaná pro genotyp léčby. P= 0.0483. Sidakův vícenásobný srovnávací test:**P=0.0009 pro WT Angll versus výchozí hodnota,*P=0,0420 pro CST'9 Angll versus výchozí hodnota, *P=0,0424 pro WT versus CST9 Angll.

Pls klikněte sem pro část 2