Část 1: Protizánětlivé, antioxidační, zvlhčující a antimelanogenetické účinky kvercetinu 3-O- -D-glukuronidu v lidských keratinocytech a melanomových buňkách prostřednictvím aktivace NF-κB a AP-1 drah

Pro více informací kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní: kvercetinBylo hlášeno, že 3-O- -D-glukuronid (Q-3-G), glukuronidový konjugát kvercetinuprotizánětlivévlastnosti v makrofázích stimulovaných lipopolysacharidy, stejně jako protirakovinné a antioxidační vlastnosti. Na rozdíl od kvercetinu, o kterém bylo rozsáhle popsáno, že má širokou škálu farmakologických aktivit včetně ochranných účinků na kůži, farmakologické přínosy a mechanismy Q-3-G v kůži zbývalo objasnit. Tato studie se zaměřila na charakterizaci ochranných vlastností pokožky, včetně protizánětlivých a antioxidačních vlastností, Q-3-proti oxidativnímu stresu vyvolanému UVB nebo H2O2-, hydratační účinky aantimelanogenezeaktivity pomocí lidských keratinocytů (HaCaT) a melanomových (B16F10) buněk. Q-3-G down-reguloval expresi prozánětlivého genu a cytokinu, jako je cyklooxygenáza-2 (COX-2) a tumor nekrotizující faktor (TNF)- v HO nebo UVB- ozářených HaCaT buněk. Prokázali jsme také, že O-3-Gexhibity mají antioxidační účinek pomocí testů pohlcování volných radikálů, průtokové cytometrie a zvýšené exprese nukleárního faktoru erytroidního 2- souvisejícího faktoru 2 (Nrf2). Q-3-G snižoval produkci melaninu v buňkách B16F10 indukovaných -melanocyty stimulujícím hormonem (-MSH). Hydratační účinky a mechanismy Q-3-G byly zkoumány vyhodnocením genů souvisejících se zvlhčujícím faktorem, jako je transglutamináza-1(TGM-1), filagrin (FLG) a syntáza kyseliny hyaluronové (MÁ)-1. Kromě toho Q-3-G zvýšil fosforylaci c-Jun, Jun N-terminální kinázy (JNK), mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) kinázy 4 (MKK4) a TAK1, které se účastní MAPK/AP -1 dráha a fosforylace IkB , IkB kinázy (IKK)-, Akt a Src, které se účastní dráhy NF-kB. Společně jsme prokázali, že Q-3-G má protizánětlivé, antioxidační, zvlhčující a antimelanogenetické vlastnosti v lidských keratinocytech a melanomových buňkách prostřednictvím NF-kB a AP-1 drah.

Klíčová slova: kvercetin 3-O- -D-glukuronid; ochrana proti UV záření; zvlhčující; antimelanogeneze; AP-1; NF-kB

1. Úvod

Kůže, největší orgán těla, nabízí bariéru, která hraje hlavní roli v ochraně těla před vnějším prostředím a škodlivými faktory, jako je ultrafialové záření, infekční mikroby a škodlivé chemikálie. Tato bariéra také reguluje rovnováhu elektrolytů a teplotu těla a zabraňuje ztrátě vlhkosti [1,2]. Lidská kůže se skládá ze tří vrstev: epidermis, dermis s přívěsky a podkoží [3]. Epidermální vrstva hraje důležitou roli při udržování tělesné teploty.

Keratinocyty, hojná složka v kožní epidermis, spolu těsně interagují prostřednictvím desmozomů a těsných spojení, které umožňují účinnou fyzikálně-chemickou bariéru[4]. Přestože kůže funguje jako ochranná bariéra, ultrafialové (UV) záření má významný vliv na většinu buněk, včetně keratinocytů, vnější vrstvy kůže. UV záření může způsobit stárnutí kůže, poškození kůže, vrásky a hyperpigmentaci, která je považována za jeden z nejcenzornějších rizikových faktorů [5]. UV záření se skládá ze tří rozsahů vlnových délek: UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) a UVC (200-280 nm). Kromě peroxidu vodíku (H2O2), o kterém je známo, že přispívá k oxidativnímu stresu, může UVB vést k produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) prostřednictvím aktivace enzymů generujících ROS [6]. Bylo popsáno, že nekontrolovaná akumulace ROS v buňkách včetně keratinocytů způsobuje oxidační modifikace lipidů, proteinů, nukleových kyselin a dalších intracelulárních molekul, které následně vedou k různým typům poškození kůže a procesům souvisejícím se stárnutím, jako je buněčná smrt, oxidační stres, a zánět [7,8]. Kromě toho je známo, že reakce na oxidační stres ovlivňuje poškození různých buněčných komponent [9]. Poškozené kožní buňky mohou také vést k zánětlivým reakcím, což vede k chronicky poškozené kůži [10]. Jedním z typů poškození kůže prostřednictvím biologických procesů zprostředkovaných UVB nebo H2O2-je exprese zánětlivých genů, jako je cyklooxygenáza-2 (COX-2) a prozánětlivé cytokiny [11]. Proto je vývoj bezpečnějších, odolnějších a účinnějších ochranných účinků pokožky nezbytný pro prevenci a blokování onemocnění spojených s poškozením kůže zprostředkovaným UVB nebo H2O2.

Hydratace pokožky hraje také důležitou roli v udržení její normální funkce. Zejména stratum corneum (SC) má ochranný účinek proti ztrátě vody [12]. Obsah vody ve stratum corneum se podílí na deskvamaci kůže a správném zrání, zatímco nedostatek vody v SC podporuje akumulaci a dysfunkci korneocytů [12,13]. V konečných stádiích diferenciace keratinocytů jejich plazmatická membrána a buněčné organely mizí a pak influx vápníku indukuje transglutaminázu (TGM) pro síťování s jinými proteiny. Nedostatek nebo ztráta TGM-1 vede k defektnímu síťování buněčného obalu. Lamelová ichtyóza je příkladem onemocnění způsobeného ztrátou TGM-1. Kromě toho, filagrin (FLG), vytvořená keratinová matrice, hraje roli při tvorbě SC, protože funguje jako lešení pro vazbu proteinů a lipidů s zrohovatělou obálkou[14] tím, že katalyzuje zesíťovací reakce g-glutamyllysinu, ATGM a membránu. -asociované enzymy, propůjčující integritu SC [15]. Kromě toho je kyselina hyaluronová (HA) typem přirozeného hydratačního faktoru (NMF), který se podílí na zadržování vlhkosti v pokožce a vykazuje zřetelný profil při přirozeném stárnutí kůže, je dodávkou léčiv a je důležitou složkou extracelulární matrice. [16,17]. HA hraje roli při zvyšování vlhkosti pokožky regulací genů syntázy kyseliny hyaluronové (HAS); kromě toho může kyselina retinová (vitamín A) účinně regulovat HA v epidermis [17]. TGM-1, FLG a HAS-12,3 jsou geny spojené s produkcí NMF [18]. Kromě toho se aktivace transkripčních faktorů, jako je aktivátorový protein-1(AP-1) a nukleární faktor (NF)-kB, podílí na produkci prozánětlivých látek, které optimalizují kožní bariéru a hydrataci pokožky. prostřednictvím AP-1 a NF-kB drah[19]. Upstream signalizační enzymy v AP-1 dráze zahrnují mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK), jako je c-Jun N-terminální kináza (JNK), extracelulární signálem regulovaná kináza (ERK) a p38, zatímco Src, Akt, IkB-kináza (IKKo/ ) a KBO(IkBa) patří k NF-KB dráze [20. Kůže také produkuje melanin v epidermální vrstvě, zejména v melanocytech – hlavním zdroji melaninu – které přispívají k určení barvy kůže a melanogeneze [21]. UVB záření a hormon stimulující melanocyty (o-MSH) mohou stimulovat sekreci melaninu, a tím spouštět melanogenezi [22. Během melanogeneze -MSH aktivuje protein kinázu A (PKA), transkripční faktor asociovaný s proteinovou mikroftalmií (MITF) a vazbu na prvek odpovědi na cAMP (CREB)[23]. Za jednu z funkcí melaninu je považována prevence poškození kůže UV zářením, včetně slunečního záření. Nadměrná produkce melaninu nebo absence obsahu melaninu způsobená stárnutím, melanocyty stimulujícím hormonem a UV zářením však podporuje pihy, melasma, senilní lentiginy a další hyper/hypopigmentační poruchy, které by mohly mít negativní dopad na vzhled a pokožku. zdraví [24]. Řízení melanogeneze je tedy také žádoucí pro udržení jak zdraví, tak kosmetického vzhledu lidského těla.

kvercetinje převládající alokovaný flavonoid flavonolového typu přítomný v zelenině, ovoci, nápojích a léčivých rostlinách [25]. V důsledku toho byl kvercetin rozsáhle studován, aby měl farmakologické výhody včetně protizánětlivých, antiaterosklerotických,antioxidant, protirakovinné a kožní ochranné vlastnosti a souvisí s melanogenezí [24,26-29]. Několik prací využívajících citlivé a spolehlivé metody však prokázalo, že kvercetin nebyl detekován v plazmě [30-33] a v mozku se téměř nenachází [34,35]. Kvercetin, který se obecně vyskytuje ve formě glykosidu, se dobře vstřebává a většinou hydrolyzuje a metabolizuje v tenkém střevě, tlustém střevě, játrech a ledvinách na konjugované metabolity [30,36-38]. V cirkulující krvi jsou detekovány pouze konjugované metabolity, jako je glukuronid nebo sulfát (methylovaný nebo nemethylovaný), spíše než kvercetin aglykon nebo jeho glykosidy. 3/-methyl-kvercetin-3-glukuronid, kvercetin-3-glukuronid a kvercetin-3'-sulfát byly identifikovány jako hlavní metabolity v plazmě po 1,5 hodině po konzumaci smažené cibule[30, 32]. Tyto metabolity kvercetinu se tvoří v tenkém střevě a játrech biotransformačními enzymy včetně UDP-glukuronyltransferáz jako výsledek metabolismu fáze II [29,39,40]. Bylo také hlášeno, že konjugované metabolity kvercetinu se hromadí v lidské plazmě v koncentračním rozmezí 10-' až 10- stupně M po pravidelném požívání cibule s jídlem po dobu 1 týdne[41]. Poločas metabolitů kvercetinu je poměrně vysoký, přibližně 11 až 28 hodin [29]. Vzhledem k tomu, že tyto sloučeniny byly pozorovány jako hlavní formy konjugovaných metabolitů kvercetinu, byly by nezbytné studie zaměřené na biologickou aktivitu flavonolů pomocí těchto konjugovaných metabolitů, což nás přimělo ke studiu biologické aktivity jednoho z konjugovaných metabolitů kvercetinu. Jedním z nejhojnějších glukuronidových metabolitů vyskytujících se hlavně v plazmě a tkáních včetně jater, ledvin a mozku je kvercetin 3-O- -D-glukuronid (Q-3-G) (obrázek 1) [31,35,40,42,43], které mohou generovat podobné, silnější nebo slabší aktivity ve srovnání s mateřskými sloučeninami v různých modelech. Q-3-G je transportován do cílových tkání prostřednictvím plazmy, aby uplatnil svou biologickou aktivitu [39]. O-3-G bylo také prokázáno, že je účinným metabolitem v plazmě potkanů ​​po perorálním podání kvercetinu [43]. V jiných studiích bylo zjištěno, že se metabolit obsahující Q-3-G nahromadil v aortě po podání potravy bohaté na kvercetin a byl identifikován jako účinná látka detekovaná v lidské krvi v rozmezí od 0.{{48} } μM【44】. Kromě toho lze Q-3-G nalézt ve víně [45] a v léčivých rostlinách, jako je Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis a zelené fazole [46-49].Q-3-G byl popsán jako protizánětlivá složka za podmínek stimulovaných LPS a vykazoval antioxidační vlastnosti v krevní plazmě [50-52]. Ve srovnání s dlouhou historií aplikace a rozsáhlým studiem kvercetinu však studium Q-3-G zbývá prozkoumat. Proto byl Q-3-G vybrán jako zástupce metabolitů kvercetinu jako aktivní hráč kvercetinu in vivo. Role Q-3-G na ochranné účinky pokožky navíc ještě nebyla zcela objasněna. V této studii jsme pomocí různých hodnocení in vitro zkoumali ochranné účinky Q-3-G na pokožku proti oxidativnímu stresu a zánětu vyvolanému UVBor H2O2-, hydrataci pokožky pomocí HaCaT (buněčná linie lidských keratinocytů) a antimelanogenetická aktivita v buňkách B16F10 (buněčná linie myšího melanomu).

2. Výsledek

2.1. Protizánětlivé a antioxidační účinky Q-3-G proti UVB nebo H2O2-stimulovaným buňkám HaCaT

Kožní tkáň může být poškozena UV zářením. UV záření aktivuje několik škodlivých faktorů, včetně oxidačního stresu, apoptotické buněčné smrti, zánětu a stárnutí kůže. Abychom určili UV ochranné aktivity Q-3-G, nejprve jsme hodnotili, zda Q-3-G má nějaké účinky na buněčnou životaschopnost lidských keratinocytů. Pomocí testu 3-(4-5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-243 tetrazoliumbromidu (MTT) jsme zkoumali cytotoxické účinky O-3-G v buňkách HaCa. Jak je znázorněno na obrázku 2a, nedošlo k žádné významné interferenci na životaschopnosti buněk při koncentraci 2.5-20 uM pomocí Q-3-G, což naznačuje, že O-3-G nevykazoval žádnou cytotoxicitu až do 20 μM a nepoškodil keratinocyty, povrchovou vrstvu kožních buněk. Dále jsme hodnotili ochranné účinky Q-3-G na pokožku v buňkách HaCaT vystavených UVB. Po ozáření UVB při 30 mJ/cm² Q-3-G významně chránil HaCaT buňky před UVB-indukovanou buněčnou smrtí v závislosti na koncentraci (obrázek 2b). V souladu s testem MTT, pomocí kamery připojené k mikroskopu pro zachycení morfologie HaCaT buněk, Q-3-G chránil před buněčnou smrtí v důsledku UVB ozářených HaCaT buněk až do koncentrace 10 μM（obrázek 2c） . Počet buněk HaCaT za každé podmínky byl 482 pro neošetřenou skupinu, 91 pro skupinu UVB 30 mJ/cm, 276 pro skupinu s UVB 30 mJ/cm² plus 5 μM O-3-G a 320 pro skupinu UVB 30 mJ/cm² plus 10μM skupina Q-3-G (obrázek 2d). Tyto výsledky potvrdily, že Q-3-G inhibuje poškození HaCaT vyvolané UVB a zachraňuje ochranný účinek pokožky před UVB zářením.

Výskyt a exacerbace zánětu v těle příležitostně aktivují makrofágy a uvolňují některé cytokiny. Zánět je charakteristickým znakem oxidačního stresu. Zkoumali jsme protizánětlivý účinek Q-3-G proti zánětu vyvolanému UVB nebo HO2-. Je dobře známo, že UVB může podporovat poškození DNA a zánět v kožních buňkách 【10】. Buňky HaCaT jsme ozářili UVB 30 mJ/cm² a buňky HaCaT jsme inkubovali s H2O2 (500 uM). Použili jsme test PCR v reálném čase ke kontrole exprese mRNA zánětlivého enzymu COX-2 a prozánětlivého cytokinu TNF-. Jak ukazují výsledky na obrázku 2e,f, 10 μM koncentrace O-3-G významně inhibovala expresi mRNA COX-2 a TNF-. V důsledku toho Q-3-G potlačoval zánětlivé reakce indukované v HaCaT buňkách po vystavení UVB záření nebo H2O2.

Použili jsme testy 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonové kyseliny) (ABTS) a 2,2-difenyl-lpikrylhydrazyl(DPPH) radikálů zachycující testy – široce používané modelové systémy zkoumat vychytávací aktivity přírodních sloučenin in vitro – posoudit antioxidační vlastnosti Q-3-G při různých koncentracích. Buňky HaCaT byly ošetřeny Q-3-G způsobem závislým na koncentraci od 2,{14}} μM v přítomnosti DPPH a výsledek ukázal významnou vychytávací aktivitu při více než 2,5 uM (obrázek 2g) . Test ABTS také významně prokázal účinky Q-3-G na vychytávání volných radikálů způsobem závislým na koncentraci s hodnotou IC50 1,75 μM (obrázek 2h). Kyselina askorbová (AA) jako pozitivní kontrola vykazovala největší antioxidační účinky v testech DPPH i ABTS. Nukleární faktor erytroidního 2-faktoru 2 (Nrf2), jednoho z genů závislých na prvku antioxidační odezvy (ARE), uvádí, že reguluje ochranné oxidoreduktázy a jejich nukleofilní substráty, čímž podporuje antioxidační enzymy k odstranění poškození a opravy systémy [53]. Dále jsme zkoumali hladinu exprese Nrf2 v buňkách HaCaT ozářených UVB. Posílení výše uvedených zjištění O-3-G významně zvýšilo hladinu exprese Nrf2 po ozáření UVB ve srovnání s kontrolou v závislosti na koncentraci, až do 10 uM (obrázek 2i), což naznačuje, že Q-3- G má antioxidační účinek jak chemicky, tak i biologicky s vlastností zachycující volné radikály a zvyšuje ochranný účinek signalizace ARE závislé na Nrf2-, resp. Dále jsme také provedli ROS průtokovou cytometrii s použitím dichlordihydrofluorescein diacetátu (DCFDA) v UV podmínkách. Je všeobecně známo, že antioxidant potlačuje buněčné stresory inhibicí produkce ROS [54]. Výsledek ukázal, že ošetření Q-3-G v koncentracích 5 a 10 μM snížilo hladinu ROS indukovaného UVB (obrázek 2j). Dohromady tyto údaje naznačují, že Q-3-Ge má ochranné vlastnosti pokožky, jako jsou protizánětlivé a antioxidační účinky proti H2O nebo oxidační stres a zánět vyvolaný UVB v buňkách HaCaT.

2.2. Antitimelanogenezní účinek u B16F10 a zvlhčující účinek v HaCaT buňkách Q-3-G

Aby se prozkoumaly účinky O-3-G na melanogenezi, byly melanomové buňky ošetřeny -MSH po dobu 48 hodin, aby došlo k sekreci melaninu v buňkách B16F10. Použitím testů MTT jsme nejprve potvrdili, že Q-3-G neměl žádnou cytotoxicitu v buňkách B16F10 při koncentracích až 20 μM po dobu 48 hodin (obrázek 3a). Tento výsledek pro další hodnocení ukázal, že účinky O-3-G v B16F10 nebyly způsobeny buněčnou smrtí. Dále jsme hodnotili B16F10 pomocí Q-3-Gand -MSH po dobu 48 hodin, abychom určili účinky Q-3-G na melanogenezi. Jak je znázorněno na obrázku 3b, Q-3-G významně inhiboval sekreci melaninu. Pozitivní kontrola arbutin také významně snížila sekreci melaninu.

Molekula související s vlhkostí pokožky je kyselina hyaluronová (HA). Jak již bylo zmíněno, HA, distribuovaná v epidermis a dermis, je NMF, který zvyšuje hydrataci kůže [55]. Použili jsme test reverzní transkripce PCR (RT-PCR) ke zkoumání úrovně transkripce HAS-1 po 12 hodinách s koncentrací Q-3-G až 30 uM. HAS podporuje akumulaci středně velké HA v keratinocytech [12]. Jak ukazuje obrázek 3c, exprese HAS-1 byla zvýšena působením Q-3-G až na 10 μM. Kromě zvlhčujícího faktoru jsme také zkoumali expresi FLG a TGM{{ 13}}. Jako pozitivní kontrolní skupinu jsme použili retinol. Hladiny transkripce FLG a TGM-1 se výrazně zvýšily po léčbě Q-3-G v koncentracích až 10 μM (obrázek 3d). Tato zjištění naznačují, že Q-3-G má zvlhčující účinek na pokožku v buňkách HaCaT. Kromě toho jsme pomocí SB203580 (inhibitor p38), SP600125 (inhibitor JNK), UO126 (inhibitor ERK) a Bay11-7082 (inhibitor NF-kB) zkoumali zapojení signálních drah MAPK a NF-kB do zvlhčování faktorem Q-3-G-ošetřených HaCaT buněk. Na základě exprese genu indukované O-3-G byly hladiny TGM-1 i FLG sníženy ošetřením SP600125, inhibitorem JNK (obrázek 3e), což naznačuje, že ke zvýšení exprese je zapotřebí JNK TGM-1 a FLG z hlediska hydratačního účinku O-3-G. Kromě toho byla exprese FLG také snížena Bay11-7082, inhibitorem IKK a IkB , což naznačuje, že farmaceutický mechanismus Q-3-G by také mohl patřit k signální dráze NF-kB.

2.3. Signální dráhy Q-3-G související se zvlhčováním prostřednictvím aktivace AP-1 a NF-kB

Na základě předchozích výsledků mRNA jsme předpokládali, že účast signalizace AP-1 a NF-kB na hydratačním účinku Q-3-G se může také objevit v hladinách proteinů. Pomocí testu Western blot jsme zkoumali fosforylaci upstream molekul AP-1 a NF-kB. Za prvé, v dráze AP-1 byla fosforylace c-Jun zvýšena po inkubaci buněk HaCaT s Q-3-G po dobu 24 hodin (obrázek 4a). Hladina p-INK byla také zvýšena po léčbě Q-3-G v koncentracích 2,5, 5 a 10 μM. Celková forma JNK zůstala nezměněna (obrázek 4b). Dále jsme zkoumali fosforylaci MKK4 a TAK-1, což jsou upstream regulátory JNK. Jak je znázorněno na obrázku 3c, po ošetření buněk HaCaT pomocí O-3-G byly hladiny proteinu p-MKK4 a p-TAK1 také zvýšeny.

Kromě signalizace NF-kB zvýšil Q-3-G fosforylaci p50 a p65, podjednotky NF-kB (obrázek 4c). Kromě toho jsme hodnotili aktivaci IKK a IkBa, které byly také zvýšeny o Q-3-G až na 10 uM ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 4d). Nakonec jsme určili aktivaci upstream molekul zapojených do signální dráhy NF-kB. Fosforylace Src a Akt (Ser473) byla zvýšena působením O-3-G (obrázek 4e). Celkově tato data naznačují, že účinky ochrany kůže Q-3-G cílí na aktivaci TAK1 a Src zvýšením hladiny proteinu, čímž upregulují aktivitu AP-1 a NF-kB, v daném pořadí.

2.4. Účinky Q-3-G na transkripční aktivaci AP-1 a NF-kB

Zkoumali jsme buněčnou cytotoxicitu Q-3-G v buňkách HEK293T lidské embryonální ledviny pomocí MTT testu (obrázek 4f). Životaschopnost buněk HEK293T nebyla významně ovlivněna po ošetření Q-3-G（2.5-20μM） ve srovnání s neošetřenými buňkami.

Použili jsme luciferázový test, abychom určili, zda Q-3-G může modulovat testy NF-kB a AP-1 promotoru. Potvrdili jsme, že O-3-G zvyšuje aktivitu luciferázy zprostředkovanou AP{4}} (obrázek 4g) a aktivitu luciferázy zprostředkovanou NF-kB (obrázek 4h) v závislosti na koncentraci. Tyto výsledky potvrzují, že aktivace AP-1 a aktivace NF-KB jsou důležitými farmakologickými cíli Q-3-G.

Kliknutím na odkaz získáte další informace:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-anti-inflamator-antioxidant-moistu-55118278.html