Fisetin tlumí lipopolysacharidy indukované zánětlivé reakce u makrofágů

Pro více informací kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Několik studií uvádí účinnost a bezpečnost polyfenolů na lidské zdraví; ověření jejich účinnosti však zůstává nedostatečné. Cílem této studie bylo zjistit, zda fisetin, jeden z flavonoidů vyskytujících se převážně v ovoci a zelenině, může potlačit lipopolysacharidy (LPS-) indukovanézánětlivéreakce v makrofázích. LPS zvýšil abundanci prozánětlivé mRNA (MCP 1, IL-1ß a iNOS), ale byl potlačen fisetinem. Zvýšení oxidu dusnatého pomocí LPS, faktoru oxidačního stresu, bylo zmírněno fisetinem. Kromě toho byla snížena fosforylace mitogenem aktivované proteinkinázy (ERK a JNK) zesílená LPS. Nakonec fisetin zeslabil expresi nebo aktivitu uPA, uP AR, MMP-2 a MMP-9, které jsou známé jako související faktory náboru nebo infiltrace makrofágů. Závěrem,fisetinje slibná terapeutická látka pro zánětlivá onemocnění související s makrofágy, jako je sepse a ateroskleróza.

Kliknutím sem získáte další informace.

1. Úvod

Léčebné využití přírodních složek si v posledních 2 desetiletích získalo větší pozornost. Na základě jejich vysoké účinnosti a nízké toxicity je 40 procent terapeutických látek schválených FDA na přírodní bázi nebo jejich deriváty [1]. Toxicitě spojené s jinými drogami bylo úspěšně zabráněno různými přírodními produkty [2]. Proto je velmi důležité a významné dále zkoumat přírodní sloučeniny rostlinného původu.

Polyfenolyjsou rostlinné sekundární metabolity a jsou široce přítomny v potravinách a nápojích rostlinného původu, ovoci, zelenině, koření, čaji a víně. Ačkoli nejsou považovány za základní mikroživiny, několik druhů literatury dokazuje jejich příznivé účinky na lidské zdraví, zejména při dietách spojených s vysokou konzumací ovoce a zeleniny [3-5]. V průběhu desetiletí byly provedeny četné studie pro zkoumání farmakologických účinků polyfenolů, které naznačují přínosy pro zdraví. Rostoucí důkazy ukázaly, že několik polyfenolů máprotizánětlivévlastnosti

[6-8]. Nedávné studie navíc prokázaly, že několik druhů polyfenolů může inhibovat regulační enzymy nebo transkripční faktory, které se účastní zánětu [9].

Dieta ovlivňuje různá stádia zánětu a prokazuje významný dopad na několik zánětlivých onemocnění[10,11]. Zánět hraje klíčovou roli ve vývoji onemocnění, jako je cukrovka, astma, kardiovaskulární onemocnění a rakovina [12]. Proto kontrola zánětu může těmto onemocněním zabránit. Protože makrofágy jsou hlavními mediátory zánětu, mají různé funkce v tkáňové homeostáze a zánětu. Činidla účinně modulující jejich funkce mají tedy velkou klinickou hodnotu, protože aberantní aktivace makrofágů může způsobit škodlivé imunitní reakce. Současná výzkumná tendence jasně ukazuje, že přírodní produkty jsou jedním z nejdůležitějších zdrojů nových léků [13].

Jeden polyfenol, isetin (3,3',4',7-tetrahydroxyflavon), je bohatě obsažen v jahodách, jablkách, rajčatech, cibuli, pomeranči, broskvi, hroznech, kiwi, tomelu, čaji a víně [14] . Dosud fisetin hlásil silné protizánětlivé [15-17],

antioxidační [18], protinádorové [19,20, antiangiogenní [21], antidiabetické [22], neuroprotektivní [23] a kardioprotektivní účinky [24] jak v buněčné kultuře, tak na zvířecích modelech relevantních pro lidská onemocnění. Ačkoli má fisetin mnoho fyziologických účinků, jeho účinek na makrofágy není příliš popsán.

V této studii jsme zkoumali příznivé účinky fisetinu na zánětlivou odpověď aktivovaných makrofágůlipopolysacharid(LPS).

2. Materiály a metody

2.1. Izolace rezidentních peritoneálních makrofágů.

BALB/c myši byly získány z Institutu lékařské vědy Tokijské univerzity a chovány v Animal Resource Center of Okayama University. Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny v souladu s pokyny NIH (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals). Experimentální protokol byl schválen Etickým kontrolním výborem pro experimentování na zvířatech na Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences (OKU-2018449). Všechny myši byly udržovány v bariérovém zařízení a krmeny běžnou laboratorní stravou. Samci a samice myší BALB/c, stáří 16±4 týdnů, byli anestetizováni isofluranem a usmrceni cervikální dislokací. Makrofágy byly sklizeny pomocí peritoneální laváže za použití fyziologického roztoku (5 ml). Roztok pro peritoneální výplach byl centrifugován při 1500 ot./min. po dobu 5 minut. Sediment byl suspendován v malém množství DMEM (SIGMA, kat. č. D6046). Červené krvinky byly lyžovány pomocí roztoku chloridu amonného. Počet makrofágů byl vypočten pomocí hemocytometru, poté resuspendován v DMEM obsahujícím teplem inaktivovaný FBS (10 procent vv), penicilin (10 U/ml) a streptomycin (10 mg/ml) a naneseny do 6-jamky desky (Corning Incorporated, kat. č. 3516) [25,26].

2.2. Podmínky buněčné kultury.

Po nočním hladovění v séru byly makrofágy inkubovány s vybranými koncentracemi fisetinu (10, 30 a 100 μM; SIGMA, Kat. č. F4043) nebo vehikulum po dobu 3 hodin a inkubovány v přítomnosti nebo nepřítomnosti LPS (10 ng/ml; SIGMA, kat. č. L4391) po vhodnou dobu. Poté bylo médium a buňky shromážděny. Médium bylo použito pro stanovení oxidu dusnatého (NO) a želatinovou zymografii. Buněčné lyzáty byly použity pro kvantitativní polymerázovou řetězovou reakci (qPCR) a western blotting.

2.3. Polymerázová řetězová reakce v reálném čase.

mRNA byly extrahovány z makrofágů pomocí RNeasy Mini Kits (QIAGEN, kat. č. 74104). Reverzní transkripce byla provedena pomocí iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, kat. č. 1708891). qPCR byla provedena pomocí ABI Step One Real-Time PCR System (Applied Biosystems, QuantStudio 3) s použitím Fast SYBR Green Real-time PCRMixture (Applied Biosystems, kat. č. 4385612)[27). Primery pro monocytový chemotaktický protein 1 (MCP-1) (Takara Bio Inc, kat. č. MA066003), interleukin 1 beta(IL-1 ) (Takara Bio Inc., kat. č. MA025939), indukovatelná syntáza oxidu dusnatého (iNOS) (Takara Bio Inc, kat. č. MA083369), matricová metaloproteináza-(MMP-)2 (Takara Bio Inc., kat. č. MA127110), MMP-9 (Takara Bio Inc ., kat. č. MA031311) a 18S ribozomální RNA(18S) (Takara Bio Inc., kat. č. MA050364) byly komerčně dostupné. Každý vzorek byl normalizován na hodnoty pro expresi 18S mRNA (metoda AACT) [27].

2.4. Test oxidu dusnatého.

Jednotlivé supernatanty buněčných kultur byly shromážděny a centrifugovány 10 minut při 14, 000ot/min při 4 stupních. Poté byl supernatant použit pro stanovení oxidu dusnatého (NO). Test NO byl proveden tak, jak je popsáno v komerčně dostupných soupravách (BioAssay Systems, kat. č. D2NO-100). BioAssay Systems'QuantiChrom Nitric Oxide Assay Kit je kolorimetrický test pro stanovení produkce NO po redukci dusičnanů na dusitany pomocí vylepšené Griessovy metody.

2.5. Western blotting.

Celobuněčné proteiny byly extrahovány z makrofágů pomocí lyzačního pufru (Cell Signaling, kat. č. 9803). Každý vzorek byl aplikován na 10% SDS-PAGE a přenesen na polyvinylidenfluoridovou membránu, imunoblotován s primárními protilátkami (fosforylace kinázy regulované extracelulárním signálem (p-ERK); Cell Signaling, kat. č. 9101, fosforylace c-Jun N-terminální kináza (p-JINK); Cell Signaling, kat. č. 9251, aktivátor plazminogenu urokinázy (uPA); Abcam, kat. č.

ab20789, urokinázový aktivátor plazminogenu a receptor (uPAR); R&D, kat. č. AF534, a -aktin; Sigma Cat. č. A5441)[28]. Membrány byly poté inkubovány s vhodnými sekundárními protilátkami a imunitní komplexy byly vizualizovány chemiluminiscencí (Merck Millipore, kat. č. WBLUF0100, kat. č. WBLUC0100) a kvantifikovány pomocí General Electric Imager (GE Healthcare, LAS4000 mini)[29].

2.6. Želatinová zymografie.

Supernatanty buněčných kultur byly rozděleny za neredukujících podmínek pomocí SDS-PAGE (10 % hm./obj.) polymerované v přítomnosti želatiny (0,1 % hm./hm.), aby se vyhodnotily aktivity MMP{ {4}}. Gely byly dvakrát promyty Tritonem X-100 (2,5 procent obj./obj.) po dobu 60 minut a destilovanou vodou po dobu 15 minut. Gely byly poté inkubovány přes noc při 37 stupních Cin 50 mM Tris pufru obsahujícím chlorid vápenatý (5 mM) pH 8,0. Po inkubaci byly gely obarveny Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, kat. č. {18}}) po dobu 30 minut při pokojové teplotě, poté následuje odbarvení odbarvovacím roztokem Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad, kat. č..{22}}), dokud se neobjeví čiré proužky. Gelové obrázky byly kvantifikovány pomocí General Electric Imager (GE Healthcare, LAS 4000 mini); nezabarvené, průsvitné štěpené oblasti představovaly oblasti aktivity MMP [30].

2.7. Statistika.

Všechny statistické analýzy byly provedeny pomocí Sigma Plot v14.0(Systat Software Inc, Kalifornie, USA). Data jsou prezentována jako průměr ± standardní chyba průměru. Statistická významnost mezi více skupinami byla hodnocena jednosměrnou nebo dvoucestnou analýzou rozptylu následovanou Holm-Sidakovým post hoc testem nebo Student-Newman-Keulsovým post hoc testem. phodnota<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Výsledky

3.1. Fisetin zmírnil zánětlivé mediátory v makrofázích stimulovaných LPS.

Protože aktivované makrofágy produkují prozánětlivé cytokiny a zánětlivé mediátory, jako je NO[8], zkoumali jsme účinky fisetinu na zánětlivé mediátory v makrofázích stimulovaných LPS. Za prvé, abychom prozkoumali, zda fisetin vykazuje protizánětlivý účinek na transkripční úrovni, určili jsme hladiny exprese mRNA A zánětlivých genů, jako jsou MCP-1, IL-1 a iNOS (obrázek 1(a) ). Jak se očekávalo, exprese těchto zánětlivých genů byla potlačena fisetinem způsobem závislým na dávce. Dále, abychom potvrdili, zda fisetin potlačuje zánětlivou odpověď v makrofázích, hodnotili jsme jeho schopnost potlačit produkci NO v makrofázích ošetřených LPS (obrázek 1(b)). Jak se očekávalo, fisetin snižoval produkci NO způsobem závislým na dávce.

3.2. Fisetinem redukovaná mitogenem aktivovaná proteinkináza v makrofázích stimulovaných LPS.

Protože bylo hlášeno, že fisetin inhibuje cesty mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) v různých typech buněk [31, 32], zkoumali jsme účinky fisetinu na MAPK v makrofázích. Nejprve byla pozorována aktivace MAPK indukovaná LPS v makrofázích (obrázek 2(a)). Zvýšení p-ERK pomocí LPS dosáhlo vrcholu za 15 minut po stimulaci, zatímco zvýšení p-JNK pomocí LPS dosáhlo vrcholu za 30 minut. V následujících experimentech byly tedy makrofágy stimulovány LPS po dobu 30 minut. Současná léčba fisetinem významně snížila LPS-indukované zvýšení p-ERK a p-JNK (obrázky 2(b) a 2(c)).

3.3. Fisetin Snížený uPA a uPAR u makrofágů stimulovaných LPS.

Aktivace makrofágů úzce souvisí s invazivitou buněk. Kromě toho uPA a uPAR v makrofázích přispívají k infiltraci buněk. Byl tedy zkoumán účinek fisetinu na expresi uPA a uPAR. LPS indukoval nadbytek proteinu uPA (obrázek 3(a)) a uPAR (obrázek 3(b)). Souběžná léčba fisetinem snížila přírůstek uPA (obrázek 3(a)) a uPAR pomocí LPS (obrázek 3(b)).

3.4. Fisetin snížený MMP-2 a MMP-9 v makrofázích stimulovaných LPS.

Dále, abychom objasnili účinek fise-cínu na MMP, zkoumali jsme exprese MMP-2 a MMP-9, downstream mediátory uPA/uPAR. Pokud jde o hladinu mRNA, LPS významně zvýšil expresi mRNA MMP-2 a MMP-9 ve srovnání s ošetřením vehikulem (obrázek 4(a)). Fisetin snižoval zesílení těchto genových expresí MMP-2 nebo MMP9 indukovaných LPS způsobem závislým na dávce (obrázek 4(a)). Kromě toho byly proteinové aktivity MMP-9 hodnoceny zymografií (obrázek 4(b)). Proteinové aktivity MMP-9(92kDa) byly zvýšeny stimulací LPS, která byla snížena fisetinem (obrázek 4(b)).

4. Diskuze

Zjistili jsme významný účinek fisetinu proti zánětu v makrofázích. Tato studie prokázala, že fisetin zmírnil indukci zánětlivých složek, jako jsou MCP-1, IL-1, iNOS a NO, indukované LPS v makrofázích. Kromě toho fisetin potlačil aktivaci MAPK a zeslabil LPS-indukovaný přírůstek exprese uPA a uPAR. Kromě toho fisetin zmírnil nárůst množství mRNA MMP-2 a MMP-9 a aktivitu MMP-9.

U sepse způsobené gramnegativní infekcí je LPS běžně uznáván jako původce sepse. V mnoha studiích byl LPS použit jako model sepse i zánětu. Chronický zánět navíc indukuje časnou rakovinu aktivací zánětlivých buněk a nesprávnou produkcí prozánětlivého mediátoru, jako je iNOS, a transkripčních faktorů, jako je nukleární transkripční faktor kappa B (NF-xB)[33]. Kromě toho bylo také popsáno, že oxidační stres je redukován zeslabením exprese iNOS [34]. Naše studie prokázala, že fisetin může být účinný při prevenci a léčbě sepse a septického šoku díky supresivnímu účinku na množství mRNA prozánětlivých genů a produkci NO. V této studii fisetin potlačil produkci NO snížením exprese mRNA prozánětlivého genu (iNOS); proto bylo pravděpodobné, že fisetin zmírňuje oxidační stres. V důsledku toho tyto výsledky podpořily protizánětlivé, protinádorové a antioxidační účinky fisetinu.

Několik studií uvádí, že LPS indukoval fosforylaci MAPK, včetně ERK a JNK [35]. Kromě toho bylo hlášeno, že fisetin inhibuje migraci a invazi lidských cervikálních buněk snížením exprese uPA prostřednictvím suprese MAPK[36]. -fágů, je k dispozici několik zpráv týkajících se účinku fisetinu na expresi a aktivitu uPA a uPAR. Naše studie poprvé prokázala, že fisetin potlačil expresi uPA a uPAR indukovanou LPS prostřednictvím potlačení signalizace MAPK v makrofázích, jak bylo dříve popsáno u rakovinných buněk.

MMP jsou rodinou proteáz, jejichž exprese souvisí s určitými procesy, jako je vývoj, fyziologie a patologie. Obecně je MMP-9 rozpoznán jako marker různých zánětlivých onemocnění, jako je ateroskleróza, artritida a systémový lupus erythematodes [37]. Navíc MMP-9 byla úzce spojena s migrací buněk [38,39]. Několik studií zejména uvádí, že MMP-2 a MMP-9 se podílejí na aterogenezi a hrají důležitou roli ve stabilizaci aterosklerotických plátů 40-42]. V tomto bodě naše výsledky naznačují, že inhibitory MMP-9 může nabídnout slibný terapeutický přístup ke stabilizaci zranitelných plátů. Nedávné výzkumy navíc ukázaly, že hojení ran v kůži je narušeno nadměrnou aktivací MMP-9 [43]. Proto bylo navrženo, že fisetin má také potenciál jako terapeutický přístup k hojení kůže. Budou vyžadovány budoucí studie k objasnění podrobností o molekulárních mechanismech.

Nedávným trendem ve farmaceutickém průmyslu je objevování strategií, jak vyvinout samotnou přírodní rostlinu jako nový lék. Dvě nedávné studie na zvířatech skutečně prokázaly, že LPS-indukovaný akutní plicní zánět a kolagenem indukovaná artritida se léčbou fisetinem zlepšily |32,44. Další ex vivo studie také prokázala, že fisetin byl schopen zmírnit LPS-indukované uvolňování cytokinů z leukocytů pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí nebo diabetem 2. typu[45]. Pro zmírnění zánětlivých a autoimunitních onemocnění bylo vyvinuto mnoho imunosupresivních léků[46-50]; nicméně většina sloučenin vykazuje významné vedlejší účinky. Vzhledem k tomu, že polyfenoly jsou běžně přítomny v dietním ovoci a zelenině, mohou být pravděpodobně bezpečnějšími imunosupresivy [51, 52]. Ovoce a zelenina obsahují širokou škálu fytochemikálií včetně seskviterpenových laktonů, terpenoidů, polysacharidů a fenolických sloučenin. Naše výsledky, které prokazují protizánětlivé, protinádorové a antioxidační účinky fisetinu, silně naznačují, že jej lze vyvinout jako nový lék. Přestože je fisetin slibným kandidátem pro imunoterapii, potenciál přírodních produktů obsahujících fisetin jako terapeutického činidla pro určité onemocnění je třeba dále ověřit v klinickém prostředí.

5. Závěry

Tato studie prokázala, že fisetin zmírnil přírůstkyzánětlivégeny (MCP-1, IL-1b a iNOS), produkci NO a fosforylaci MAPK, uPA, uPAR a MMP, indukovanou LPS v makrofázích. Tyto výsledky naznačují, že fisetin může být terapeutickou látkou pro několik onemocnění souvisejících s makrofágy.