ČÁST 1 Akteosid potlačuje osteoklastogenezi zprostředkovanou RANKL inhibicí indukce C-Fos a dráhy NF-KB a zeslabením produkce ROS

Seung-Youp Lee^1,2., Keun-Soo Lee^3.¤, Sea Hyun Yi^2., Sung-Ho Kook², Jeong-Chae Lee^2,3*

1 Výzkumný ústav klinické medicíny Chonbuk National University, Biomedical Research Institute of Chonbuk National University Hospital, Jeonju, Chonbuk, Jižní Korea, 2 Department of Ortodontics, Institute of Oral Biosciences and School of Dentistry, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, South Korea, 3 Department of Bioactive Material Sciences, Research Center of Bioactive Materials, Chonbuk National University, Jeonju, Chonbuk, Jižní Korea

Abstraktní

Četné studie uvádějí, že zánětlivé cytokiny jsou důležitými mediátory pro osteoklastogenezi, čímž způsobují nadměrnou kostní resorpci a osteoporózu.Akteosid, hlavní aktivní sloučeninaRehmannia glutinosa, který je široce používán v tradiční orientální medicíně, má protizánětlivý a antioxidační potenciál. V této studii jsme to zjistiliakteosidvýrazně inhibovala diferenciaci a tvorbu osteoklastů z makrofágů kostní dřeně (BMM) a makrofágů RAW264.7 stimulovaných receptorovým aktivátorem ligandu nukleárního faktoru kappaB (NF-kB) (RANKL). Předběžná léčba akteosidy také zabránila kostní resorpci zralými osteoklasty způsobem závislým na dávce.Akteosid(10 mM) zeslabil RANKL-stimulovanou aktivaci p38 kinázy, extracelulárním signálem regulovaných kináz a c-Jun N-terminální kinázy a také potlačil aktivaci NF-kB inhibicí fosforylace podjednotky p65 a inhibitoru kBa. Navíc RANKL zprostředkované zvýšení exprese c-Fos a jaderného faktoru aktivovaných T-buněk, cytoplazmatického 1 (NFATc1), a produkce tumor nekrotizujícího faktoru-a, interleukinu (IL)-1b a IL-6 byly zjevně inhibovány předběžnou léčbou akteosidy. Dále ústníakteosidredukoval úbytek kostní hmoty vyvolaný ovariektomií a produkci zánětlivých cytokinů na kontrolní hladiny. Naše data tomu nasvědčujíakteosidinhibuje diferenciaci a zrání osteoklastů z osteoklastických prekurzorů potlačením RANKL-indukované aktivace mitogenem aktivovaných proteinkináz a transkripčních faktorů, jako jsou NF-kB, c-Fos a NFATc1. Souhrnně tomu tyto výsledky naznačujíakteosidmůže působit jako antiresorpční činidlo ke snížení ztráty kostní hmoty blokováním aktivace osteoklastů.

Pro více informací prosím kontaktujte:emily.li@wecistanche.com

Úvod

Kost je neustále remodelována vyváženou aktivitou osteoklastů a osteoblastů [1]. Osteoklasty vznikají z hematopoetických prekurzorových buněk monocytární/makrofágové linie, zatímco osteoblasty jsou mezenchymální linie [2]. Abnormalosteoklastová aktivace nebo snížená osteoblastogeneze mohou narušit kostní homeostázu a případně způsobit onemocnění, jako je osteoporóza, artritida a rakovina kostí [3,4]. Osteoporóza je běžné onemocnění kostí, které vede ke zvýšenému riziku zlomenin. Nejběžnější forma osteoporózy je způsobena nedostatkem estrogenu u žen v menopauze. Léky, jako jsou kortikosteroidy a antiepileptika, mohou také způsobit nerovnováhu mezi resorpcí a tvorbou kosti, což může vést k osteoporóze [5]. K léčbě osteoporózy bylo použito mnoho antiresorpčních inhibitorů včetně bisfosfonátů, kalcitoninu, estrogenu a selektivních modulátorů estrogenových receptorů. Tyto inhibitory udržují kostní hmotu inhibicí funkce osteoklastů [6]. Estrogenová substituční terapie je nejoblíbenější léčbou k prevenci a léčbě postmenopauzální osteoporózy. Dlouhodobá estrogenová substituční terapie však může zvýšit riziko rakoviny endometria a prsu. Mnoho výzkumníků proto zaměřilo své úsilí na vývoj nového antiresorpčního činidla, které nemá vedlejší účinky [7–10]. Protože osteoklasty fungují při kostní resorpci, byla specifická inhibice osteoklastů považována za hlavní cíl v mnoha studiích. Osteoklasty jsou mnohojaderné obří buňky tvořené mononukleárními progenitory z rodiny monocytů/makrofágů prostřednictvím sekvenční proliferace, diferenciace a fúze hematopoetických prekurzorových buněk [11]. Faktor stimulující kolonie makrofágů (M-CSF) a receptorový aktivátor nukleárního faktoru (NF)-kB (RANK) ligand (RANKL) jsou zásadní faktory pro diferenciaci osteoklastů[12]. Kromě toho několik zánětlivých cytokinů, jako je tumor nekrotizující faktor (TNF) a interleukin (IL)-1b, přispívá k osteoklastogenezi modulací indukce RANKL, osteoprotegerinu a M-CSF [7,13]. Vazba RANKL na receptor RANK na buněčném povrchu vede k RANKL/RANK/TNFR

komplexy asociovaných faktorů (TRAF), které sekvenčně aktivují NFkB a mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK), včetně cJun N-terminální kinázy (JNK), p38 kinázy a extracelulární kinázy související se signálem (ERK) [14]. Tato aktivace hraje klíčovou roli při zprostředkování diferenciace, aktivace a přežití osteoklastů. RANKL také aktivuje expresi transkripčních faktorů, jako je nukleární faktor aktivovaných T-buněk, cytoplazmatický 1 (NFATc1) a-Fos, které jsou nezbytné pro vývoj osteoklastů [ 7,9]. Proto je signalizace RANKL považována za hlavní cíl antiresorpčních látek, které potlačují aktivaci osteoklastů a jsou bez kostí.Akteosidje hlavní účinnou látkou Rehmannia glutinosa, která je široce používána v tradiční orientální medicíně [15,16].Akteosidje silný antioxidant a má antihepatotoxické, protizánětlivé a antinociceptivní účinky [17–20]. Dříve jsme to zjistiliakteosidsnižuje aktivitu tyrosinázy a biosyntézu melaninu regulací signalizace ERK [21], chrání před poškozením gingivy zprostředkovaným reaktivními formami kyslíku (ROS)[22] a potlačuje poškození buněk zprostředkované mykotoxiny [23]. Tyto účinky spolu úzce souvisíakteosidschopnost odstranit ROS a regulovat signalizaci zprostředkovanou MAPK. Zejména se předpokládá, že ROS zprostředkovávají RANKL-indukované signální dráhy a buněčné události v osteoklastech. Předběžná léčba antioxidanty inhibovala RANKL-indukovanou aktivaci NF-kB, ERK a IkBa, a tím potlačila osteoklastogenezi [24]. Tato zjištění silně naznačují, že kromě protizánětlivé aktivity je pro antiresorpční činidlo rozhodující i antioxidační aktivita, tedyakteosidmůže potlačit RANKL-indukovanou osteoklastogenezi. V této studii jsme zkoumali, zdaakteosidmá terapeutický účinek na úbytek kostní hmoty. Zkoumali jsme účinkyakteosidna diferenciaci osteoklastů a kostní resorpci a související buněčné mechanismy s použitím in vitro a in vivo experimentálních systémů.

akteosid

Materiály a metody

Etické prohlášení

Postupy péče o zvířata a jejich používání byly schváleny Výborem národní univerzity Chonbuk pro etiku v péči o laboratorní zvířata a jejich používání (povolení č. CBU 2010-0007). Všechny experimenty v této studii byly provedeny podle pokynů Výboru pro péči o zvířata a použití na univerzitě.

Myši, chemikálie a laboratorní zboží

Čtyřtýdenní samice myší ICR byly zakoupeny od OrientBio Inc. (Seoul, Korea) a umístěny při 2261 uC a 5565 procentech vlhkosti při 12hodinovém cyklu světlo/tma s volným přístupem k potravě a vodě. Akteosid (3,4-dihydroxy-b-fenethyl-Oa-rhamnopyranóza syl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glukopyranosid; C29H36O15) (obr. S1) byl izolován z listů Rehmannia glutinosa. Akteosid byl před použitím rozpuštěn ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS). RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 a M-CSF byly zakoupeny od R & D systems (Minneapolis, MN, USA). Protilátky specifické pro c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATcl, IkBa, p-IkBa a b-aktin byly získány od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Protilátky pro p-p38 a p38 byly zakoupeny od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Sady Calcium Assay a Osteocalcin (OC) EIA byly zakoupeny od BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) a Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA), v daném pořadí, pro stanovení biochemických parametrů séra. K měření hladiny TRAP5b v séru byla také použita testovací souprava myší tartrát-rezistentní kyselá fosfatáza (TRAP) (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA). Pokud není uvedeno jinak, další chemikálie byly získány od Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) a laboratorní zboží bylo od SPL Life Sciences (Pochun, Jižní Korea).

Buněčné kultury

Buňky kostní dřeně byly získány z tibie a femory 6 týdnů starých samic myší ICR podle metod popsaných dříve [25]. Suspenze kostní dřeně byla inkubována v 100-mm kultivační misce v přítomnosti 50 ng/ml M-CSF. Po 3 dnech byly adherentní buňky použity jako makrofágy kostní dřeně (BMM) k indukci osteoklastické diferenciace. Některé buňky kostní dřeně byly také inkubovány po dobu 48 hodin bez M-CSF a adherentní buňky byly kultivovány v médiu pro diferenciaci osteoblastů, jak je popsáno jinde [25]. Makrofágové buňky RAW264.7 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS), 2 mM L glutaminu a antibiotiky. Tyto buňky byly použity jako protějšek buněčné linie pro BMM ke zkoumání účinku akteosidu na osteoklastogenezi.

Osteoklastická diferenciace a barvení TRAP

BMM byly předem ošetřeny různými koncentracemi (0–50 mM) akteosidu po dobu 2 hodin před stimulací 100 ng/ml RANKL. Kultivační médium bylo nahrazeno čerstvým médiem ve dnech 2 a 5. Po 7 dnech inkubace byly kultury fixovány v 4% PBS-pufrovaném paraformaldehydu a obarveny TRAP za použití sigma Aldrich kitu podle pokynů výrobce. TRAP-pozitivní buňky byly spočítány pomocí optické mikroskopie a buňky obsahující 3 nebo více jader byly považovány za osteoklasty. Buňky RAW 264.7 byly také vystaveny 100 ng/ml RANKL po předběžném ošetření akteosidem po dobu 2 hodin a po 7 dnech inkubace, buňky byly zpracovány pro barvení TRAP.

Měření životaschopnosti buněk

Životaschopnost buněk byla stanovena pomocí činidla ve vodě rozpustné tetrazoliové soli (WST)-8. Stručně řečeno, buňky BMM nebo RAW264.7 kultivované v růstovém médiu obsahujícím 10 procent FBS a antibiotika byly ošetřeny 10 mM akteosidem nebo fenolickými sloučeninami, jako je kvercetin, luteolin, apigenin nebo epigalokatechin-3-galát (EGCG). Činidlo WST-8 bylo přidáno do kultur po 48 hodinách inkubace. Po inkubaci po dobu dalších 4 hodin byla měřena specifická absorbance WST{10}} při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).

Test kostní resorpce

BMM (16105 buněk/ml) byly suspendovány v a-MEM obsahujícím 50 ng/ml M-CSF a 100 ng/ml RANKL, poté rozděleny na 24-jamkovou destičku potaženou nanokrystaly fosforečnanu vápenatého (OAAS{6} Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Jižní Korea) při hustotě 26104 buněk/cm2 s a bez akteosidu. Po inkubaci po dobu 7 dnů byly buňky odstraněny z destiček pomocí 5% chlornanu sodného a pod optickým mikroskopem byla pozorována tvorba důlků. Resorbovaná plocha byla také měřena obrazovým analyzátorem a vyjádřena jako procento kontrolní hodnoty.

Analýza Western Blot

Celé proteinové lyzáty byly připraveny v lyzačním pufru, jak je popsáno jinde [26]. Cytosolické a jaderné proteiny byly připraveny tak, jak bylo popsáno dříve [25]. Stejná množství proteinového extraktu byla oddělena 12–15 procenty SDS-PAGE a blotována na polyvinyldifluoridové membrány. Bloty byly sondovány primárními protilátkami přes noc při 4 uC před inkubací se sekundární protilátkou v blokovacím pufru po dobu 1 hodiny. Bloty byly vyvinuty se zvýšenou chemiluminiscencí (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK) a exponovány na rentgenový film (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).

Test aktivity MAPK

Buňky byly předem ošetřeny akteosidem po dobu 2 hodin a poté stimulovány RANKL další -30 min. Aktivity MAPK byly stanoveny pomocí imunometrických testovacích souprav, jako je souprava pro test p-p38kinázy (Assay Designs, Inc., MI, USA), souprava pro testování enzymu p-ERK (Assay Designs) a souprava pro sendvičovou ELISA p-SAPK/JNK ( Cell Signaling Technology, MA, USA). Všechny postupy se řídily pokyny výrobce a absorbance byla měřena čtečkou mikrodestiček.

Elektroforetický test posunu mobility (EMSA)

Vazebné reakce DNA-protein byly prováděny po dobu 30 min při pokojové teplotě, s 10–15 mg proteinu ve 20 ml pufru obsahujícím 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml poly (dI-dC), 5 procent glycerolu 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mm NaCl, 30, 000 CPM oligonukleotidů značených [a-32P] dCTP a Klenow fragment DNA polymerázy. Vzorky byly separovány na 6% polyakrylamidových gelech, které byly vysušeny a exponovány na rentgenový film (Eastman Kodak Co.) po dobu 12–24 hodin při 270 uC. Sekvence oligonukleotidových primerů specifické pro NF byly 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTGGCC TGG A-39 a 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGGACC GGA CCT GGA A{{30 }}.

NF-kB luciferázový test

Makrofágy RAW264.7 v 24-jamkových destičkách byly transfekovány 0,8 mg kB-luciferázového reportérového vektoru s použitím 2 ml Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podle pokynů výrobce. 24 hodin po transfekci byly buňky stimulovány RANKL v přítomnosti a nepřítomnostiakteosidpo dobu 24 hodin. Buňky byly resuspendovány ve 100 ml reportérového lyzačního pufru (Promega, Madison, WI, USA). Stejná množství proteinových vzorků byla umístěna do 96-jamkových mikrodestiček a smíchána s luciferázovým substrátem. Luminiscence byla měřena pomocí mikrodestičkového luminometru (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Německo). V tomto experimentu byl jako pozitivní kB inhibitor použit propustný NF-B inhibiční peptid (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA).

Měření cytokinů

Buňky BMM nebo RAW264.7 byly stimulovány RANKL v přítomnosti akteosidu v 24-jamkových kultivačních destičkách. Po 48 hodinách inkubace byly supernatanty kultur shromážděny a hodnoceny testem ELISA s použitím souprav OptEIATM specifických pro TNF-a, IL-1b- a IL-6- podle pokynů výrobce.

Reverzní transkripčně-polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-PCR)

Exprese mRNA osteoklastických markerů, jako je c-Fos, NFATcl a TNF-a, byla stanovena pomocí RT-PCR v reálném čase. Stručně řečeno, celková RNA byla extrahována z makrofágů pomocí Trizolreagent podle pokynů výrobce (Invitrogen). cDNA byla syntetizována s 1 mg celkové RNA za použití SuperScriptReverse Transscriptase II a primerů (Invitrogen). Power SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) byl použit k detekci akumulace produktu PCR během cyklování se systémem detekce sekvence ABI 7500 (AppliedBiosystems). Po denaturaci při 95 uC po dobu 10 minut byla provedena PCR

Měření intracelulárního ROS

Zásobní roztok 29,79-dichlordihydrofluorescein-diacetátu (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Německo) byl připraven v DMSO a skladován při 220 uC v temnu. Stručně řečeno, BMM (106 buněk/ml v 6-jamkových destičkách) byly kultivovány s 50 ng/MLM-CSF po dobu 24 hodin a poté ošetřeny různými koncentracemi (0–10 mM) akteosidu 2 hodiny před stimulací 100 ng/mlRANKL. Po 1 hodině společné inkubace byly tyto buňky následně inkubovány s 25 mM DCFH-DA po dobu 30 minut. Zelená fluorescence 29,79-dichlorfluoresceinu (DCF) byla zaznamenána při 515 nm (FL 1) pomocí systému FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) a 10000 událostí byly počítány na vzorek.

Indukce osteoporózy vyvolané ovariektomií

Pro tuto studii byly použity samice myší ICR (6 týdnů staré). Myši podstoupily falešnou operaci (Sham, n=10) nebo chirurgickou ovariektomii (OVX, n=20) v anestezii. Jeden týden po operaci byly OVX myši náhodně rozděleny do 2 skupin po 10 myších: bilaterální OVX a bilaterální OVX doplněné 200 ml PBS obsahujícího 1 mM akteosid orálně (AC skupina). Ústníakteosidbylo podáváno jednou za 3 dny po dobu 8 týdnů po operaci a stejné množství PBS bylo podáváno skupinám Sham a OVX. Po 1 dni od posledního podání byly myši usmrceny a poté byly analyzovány biochemické parametry v séru a 3-rozměrná kostní struktura.

Stanovení biochemických parametrů séra

Vzorky krve byly odebrány srdeční punkcí a sérum bylo odebráno centrifugací. Vzorky séra byly skladovány při 280 uC pro analýzy biochemických parametrů. Sérové ​​hladiny IL-1b a IL-6 byly odhadnuty pomocí soupravy ELISA, jak je popsáno výše, zatímco aktivita alkalické fosfatázy (ALP) byla stanovena pomocí biochemického kolorimetrického testu, který měří množství p -nitrofenol vyrobený z p-nitrofenolfosfátového substrátu, jak je popsáno jinde [27]. K odhadu biomarkerů tvorby a resorpce kosti byly také stanoveny hladiny OC, vápníku a TRAP5b v séru podle pokynů výrobců.

Analýza struktury kostí a morfometrických parametrů

Stehenní kosti myší (Sham, OVX a AC skupiny) byly vypreparovány a naplněny fyziologickým roztokem pro mechanické testování. Mechanická pevnost femuru byla měřena tak, jak je popsáno jinde [28]. Lomové zatížení bylo zaznamenáno jako maximální síla v newtonech v bodě, kdy došlo ke zlomenině středního dříku pravého femuru. Kromě toho byl světlý femur každého zvířete histomorfometricky analyzován pomocí systému mikropočítačové tomografie (micro-CT) (SkyScan 1076 microfocus X-ray system, Kontich, Belgie). Stručně řečeno, kosti ve skladu se 4 procenty formaldehydu byly povrchově vysušeny na papírovém ubrousku před zabalením do plastové „přilnavé fólie“ nebo do parafilmu, aby se zabránilo vysychání během skenování. Každá kost obalená plastem byla umístěna do zkumavek z plastu/polystyrenové pěny, které byly namontovány vertikálně horizontálně v 1076 skenerové komoře pro vzorky pro mikro-CT zobrazování. Skenování bylo prováděno pomocí 100 kV zdrojového napětí a 140 mA zdrojového proudu s rozlišením 35 mm. Trojrozměrné modely trabekulárních kostí femuru byly rekonstruovány pomocí SkyScan CT Analyzer verze 1.11. Strukturální parametry, jako je minerální hustota trabekulární kosti (BMD, g/cm3), procentuální objem kosti (objem kosti (BV)/objem tkáně (TV), procenta), tloušťka (Tb.Th, mm), separace (Tb.Sp Poté byly změřeny , mm) a počet (Tb.N, 1/mm).

Osteogenní diferenciační a mineralizační test

Buňky kostní dřeně kultivované v {{{{10}}}}jamkových kultivačních destičkách byly ošetřeny DAG (10 nM dexamethason, 50 mM kyselina askorbová a 20 mM b-glycerofosfát) v přítomnosti 10 mM akteosidu. Po 2 týdnech diferenciace byly buňky fixovány ledově studeným 70% (obj./obj.) ethanolem po dobu 1 hodiny a barveny destilovanou vodou s 0,2% alizarinovou červení Sin po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Poté, co byly buňky odbarveny a vysušeny na vzduchu, byly destičky pro buněčné kultury vyhodnoceny světelnou mikroskopií za použití inverzního mikroskopu (Nikon TS100, Japonsko). Pro kvantifikaci množství červeného barviva bylo barvivo eluováno 10% acetylpyridiniumchloridem třepáním po dobu 20 minut a absorbance byla měřena při 560 nm. Množství vápníku uloženého v buněčných vrstvách bylo také měřeno pomocí Calcium Kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japonsko) podle pokynů výrobce. Kromě toho byla pomocí RT-PCR v reálném čase stanovena exprese kostně specifických mRNA markerů, jako je transkripční faktor související s runt{20}} (Runx2), osterix, kostní sialoprotein (BSP) a OC. Oligonukleotidové primery těchto markerů byly navrženy s velikostí produktu menší než 200 bp pomocí PrimerExpress Software 3.0 (Applied Biosystems), jak je popsáno jinde[27].

Statistická analýza

Pokud není uvedeno jinak, jsou všechna data vyjádřena jako průměr 6 standardní odchylky (SD) ze 3 nebo více nezávislých experimentů. Jednosměrná ANOVA byla použita pro vícenásobná srovnání pomocí softwaru SPSS verze 12.0. Za statisticky významnou byla považována p-hodnota 0.05.

Výsledek

Akteosid inhibuje tvorbu osteoklastů makrofágy způsobem závislým na dávce

Pro ověření účinku akteosidu na diferenciaci BMM na osteoklasty byly buňky kultivovány s různými koncentracemi (0–20 mM) akteosidu po dobu 7 dnů v přítomnosti 50 ng/ml M CSF a 100 ng/ml RANKL . Akteosid snižoval počet osteoklastů způsobem závislým na dávce. Když byly buňky předem ošetřeny 10 mM akteosidem po dobu 2 hodin, počet osteoklastů se snížil o 43 procent ve srovnání s buňkami doplněnými M-CSF a RANKL (obr. 1A). Obr. 1B ukazuje diferenciaci osteoklastů zprostředkovanou RANKL a její inhibici kombinovanou léčbou s akteosidem. V souladu s tímto výsledkem předléčení akteosidy snížilo RANKL-stimulovanou diferenciaci buněk RAW264.7 a tvorbu osteoklastů (obr. 1C a D). Když byl anti-osteoklastický potenciál akteosidu na BMM porovnán s anti-osteoklastickým potenciálem několika fenolických sloučenin ve stejné koncentraci (10 mM), luteolin vykazoval nejvyšší aktivitu (obr. 2A). Avšak samotný luteolin, kvercetin nebo apigenin snižovaly životaschopnost buněk (obr. 2B). Všechny sloučeniny inhibovaly osteoklastickou diferenciaci makrofágy RAW264.7 s následujícími relativními aktivitami: luteolin. kvercetin=apigenin .EGCG=akteosid (obr. 2C). Luteolin, kvercetin nebo samotný apigenin také vykazovaly sníženou životaschopnost buněk (obr. 2D). Naproti tomu léčba kvercetinem způsobila pouze významné snížení životaschopnosti jak u BMM, tak u buněk RAW264.7, když byly tyto buňky vystaveny 10 mM každé sloučeniny po dobu 2 dnů s 50 ng/ml M-CSF, 100 ng/ml RANKL, nebo obojí (data nejsou uvedena). Když je koncentrace těchto sloučenin požadována k inhibici 50 procent

Tvorba osteoklastů v BMM (IC50) byla vypočtena pomocí křivek koncentrace-aktivita, IC50 akteosidu, kvercetinu, luteolinu, apigeninu a EGCG byla 5,1, 2,3, 2,6, 4,8 a 6,6 mM, v daném pořadí (obr. 2E). Tento výsledek byl podobný případu, kdy byly zkoumány makrofágy RAW264.7. Tyto údaje naznačují, že luteolin a kvercetin mají vyšší antiklastogenní účinky než akteosid. Naproti tomu kvercetin při IC50 měl také mírný toxický účinek na buňky (data nejsou uvedena).

AkteosidInhibuje kostní resorpci makrofágy Akteosid také zabránil RANKL-zprostředkované kostní resorpci způsobem závislým na dávce, jak bylo měřeno in vitro modelovým systémem (obr. 3A). Kostní resorpce byla významně inhibována, když byly BMM inkubovány s 1 mM akteosidem (obr. 3B). Ošetření 10 mM akteosidem téměř úplně zeslabilo tvorbu důlků indukovanou RANKL pomocí BMM. Podobně akteosid snižoval kostní resorpci v buňkách RAW264.7 stimulovaných RANKL (obr. S2A a B). Schopnostakteosidk inhibici kostní resorpce záviselo na načasování léčby ve vztahu ke stimulaci RANKL. Akteosid (10 mM) přidaný 4 dny po stimulaci RANKL nesnížil tvorbu jamek u BMM, zatímco potlačil počet vytvořených osteoklastů (obr. 3C). Tento rozdílný výsledek byl částečně způsoben oblastí jamky již vytvořené po 4 dnech tvorby stimulace RANKL (obr. 3D).

AkteosidDown-reguluje včasné signální cesty RANKL

RANKL indukuje aktivaci 3 dobře známých MAPK a NF-kB v prekurzorech osteoklastů a tato aktivace je nutná pro časnou diferenciaci osteoklastů. Abychom porozuměli možným mechanismům, kterými akteosid inhibuje osteoklastogenezi, zkoumali jsme účinek akteosidu na aktivaci MAPK a NF-B v makrofázích. Buňky BMM a RAW264.7 byly předem ošetřeny 10 mM akteosidem po dobu 2 hodin a poté stimulovány 100 ng/ml RANKL po dobu 30 minut. Fosforylace MAPK byla zkoumána Western blotem a imunometrickou analýzou. RANKL indukoval fosforylaci p38, ERK a JNK v BMM (obr. 4A) a RAW264.7 buněk (obr. 4B). Akteosid zabránil těmto RANKL-indukovaným zvýšením p-p38, p-ERK a p-JNK. Tento výsledek byl podpořen imunometrickou analýzou, která předběžná úprava 10 mM akteosidem významně inhibovala hladiny fosforylovaných MAPK v těchto makrofázích (obr. 4C). Léčba RANKL zvýšila vazbu DNA NF-kB, zatímco akteosid inhiboval RANKL-indukovanou aktivaci vazby NF-kB-DNA (obr. 5A). Tato inhibice byla výraznější u BMM než u buněk RAW264.7. Akteosid také snížil fosforylaci p65 a IkBa stimulovanou RANKL v buňkách BMM a RAW264.7 (obr. 5B a C). Přidání 10 mMacteosidu téměř úplně inhibovalo jak degradaci, tak aktivaci IkBa v BMM (obr. 5B). Aby se dále potvrdilo, že aktivace NF kB se účastní působení akteosidu, konstrukty promotor-luciferáza kB byly přechodně transfekovány do buněk RAW264.7. Buňky inkubované se 100 ng/ml RANKL měly 3-krát vyšší aktivitu promotoru kB, která byla významně oslabena 10 mM akteosidem (obr. 5D).

Akteosid potlačuje produkci zánětlivých cytokinů a expresi TNF-a, c-Fos a NFATc1 v RANKL-stimulovaných makrofázích

TNF-a, IL-1b a IL-6 jsou důležité při tvorbě a funkci osteoklastů, která je zprostředkována signalizací NF-kB v makrofázích stimulovaných RANKL. RANKL stimuloval produkci těchto cytokinů a tato produkce byla výrazně snížena předběžnou úpravou 10 mM akteosidem u BMM (obr. 6A). Podobně akteosid zeslabil RANKL-indukovanou produkci cytokinů, kromě IL -6, v makrofázích RAW264.7 (obr. S3). Abychom porozuměli molekulárním mechanismům účinku akteosidů v osteoklastogenezi, dále jsme zkoumali účinek akteosidu na expresi TNF-a, c-Fos a NFATc1. RANKL up-reguloval expresi mRNA těchto faktorů v buňkách BMM a RAW264.7 (obr. 6B a C). Předběžné ošetření 10 mM akteosidem významně inhibovalo RANKL-indukovanou expresi těchto faktorů v obou

BMM a buňky RAW264.7. Předběžné ošetření akteosidy také silně snížilo hladiny proteinu c-Fos a NFATc1 v BMM stimulovaných RANKL (obr. 6D). Tyto výsledky tomu nasvědčujíakteosiddown-reguluje RANKL indukující mediátory tvorby osteoklastů na genové a proteinové úrovni.

Akteosid snižuje intracelulární tvorbu ROS u BMM způsobem závislým na dávce

Protože je známo, že intracelulární produkce ROS koreluje s osteoklastogenezí stimulovanou RANKL, zkoumali jsme, zda akteosid inhibuje produkci ROS během diferenciace osteoklastů zprostředkované RANKL pomocí barviva DCFH-DA, které propouští buňky a je citlivé na oxidaci. Analýza průtokovou cytometrií ukázala, že střední fluorescenční signál specifický pro DCF u BMM byl zjevně posunut doprava po stimulaci RANKL ve srovnání s neošetřenými kontrolními buňkami (obr. 7A). Tento posun byl podobný případu, kdy byly po stimulaci RANKL pozorovány makrofágy RAW264.7 (data nejsou uvedena). Léčba BMM akteosidem snížila intenzitu signálu DCF způsobem závislým na dávce. Předběžné ošetření 10 mM akteosidem téměř úplně snížilo hladiny intracelulárního ROS produkovaného během diferenciace osteoklastů na neošetřené kontrolní hladiny (obr. 7B).

Orální podávání akteosidů inhibuje změnu osteoporotických biochemických markerů a úbytek kostní hmoty u myší po ovariektomii

Abychom prozkoumali účinek akteosidu na ztrátu kostní hmoty, připravili jsme osteoporotický zvířecí model pomocí ovariektomie. Během experimentálního období nebyl žádný významný rozdíl v tělesné hmotnosti mezi OVX a Shammice (data nejsou uvedena). Skupina měla významně vyšší sérové ​​hladiny IL-1ba IL-6 než skupina Sham (obr. 8). Zvýšení těchto zánětlivých cytokinů vyvolané ovariektomií bylo zmírněno perorálním podáváním akteosidů (skupina AC). Sérové ​​hladiny markerů kostního obratu, jako je ALP, vápník, TRAP5b a OC, byly významně zvýšeny ve skupině OVX. Z těchto osteoporotických markerů byly zvýšené hladiny vápníku, TRAP5b a OC u OVX myší zjevně inhibovány léčbou akteosidy, zatímco sérová hladina ALP se léčbou nezměnila. Průměrné maximální zatížení zlomeninou do středu pravé diafýzy femuru bylo významně nižší ve skupině OVX než ve skupině Sham (obr. 9A). Léčba akteosidy zvýšila maximální zálohu zlomenin na úroveň u skupiny Sham. Když byla vypreparována kortikální kost stehenní kosti a pozorována optickou mikroskopií, osteoporotické rysy zobrazené ve skupině OVX u AC myší téměř úplně zmizely (obr. 9B). Pro ověření účinku akteosidu na model osteoporózy indukované OVX byly BMD a kostní morfologické parametry v trabekulární části lehkého proximálního femuru analyzovány pomocí mikro-CT. Jak je znázorněno na obr. 9C, u OVX myší byla nalezena změna femorální trabekulární architektury, zatímco tato změna byla zmenšena ošetřením akteosidem. Výsledky z mikro-CT analýzy odhalily, že BMD, měřítko síly kosti, byla u OVX myší dramaticky snížena (obr. 9D). Ve srovnání se skupinou Sham vykazovaly myši OVX také významné změny v BV/TV, Tb. Sp, a Tb. N, ale ne Tb.Th. Orální léčba akteosidy u OVX myší významně zabránila změně BMD, stejně jako BV/TV a Tb.N.