ČÁST 1 A Cistanches Herba Fraction/𝛽-sitosterol způsobuje redoxně citlivou indukci mitochondriálního uncouplingu a aktivaci adenosinmonofosfát-dependentní proteinkinázy/peroxisomového proliferátorem aktivovaného receptoru 𝛾 koaktivátor-1 A Underssible Myotubes TheC1 Redukční efekt

Hoi Shan Wong, Jihang Chen, Pou Kuan Leong, Hoi Yan Leung, Wing Man Chan a Kam Ming Ko

Division of Life Science, Hong Kong University of Science and Technology, Kowloon, Hong Kong

Correspondence should be addressed to Kam Ming Ko; bcrko@ust.hk

Přijato 29. srpna 2014; Přijato 14. ledna 2015 Akademický redaktor: Man Li Copyright © 2015

Hoi Shan Wong et al. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný pod licencí Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je původní dílo řádně citováno. Předchozí studie prokázaly, že HCF1, semipurifikovaná frakceCistanches Herba, způsobuje snížení hmotnosti u myší krmených normální stravou a vysokým obsahem tuku. Snížení hmotnosti bylo spojeno s indukcí mitochondriálního uncouplingu a změn v metabolických enzymových aktivitách v kosterním svalstvu myší. K dalšímu zkoumání biochemického mechanismu, který je základem snížení hmotnosti vyvolané HCF{2}}, byl zkoumán účinek HCF1 a jeho aktivní složky, 𝛽-sitosterolu (BSS), na myotuby C2C12. Inkubace s HCF1/BSS způsobila přechodné zvýšení mitochondriálního membránového potenciálu (MMP), pravděpodobně fluidizací mitochondriální vnitřní membrány. Zvýšení MMP bylo paralelní se zvýšením produkce mitochondriálních reaktivních forem kyslíku (ROS). Mitochondriální ROS zase spustil redoxně citlivou indukci mitochondriálního uncouplingu uncoupling proteinu 3 (UCP3). Biochemická analýza ukázala, že HCF1 byl schopen aktivovat dráhu adenosinmonofosfát-dependentní proteinkinázy/proliferátorem peroxisomů aktivovaný receptor 𝛾koaktivátor-1, a tím zvýšit expresi cytochrom c oxidázy a UCP3. Studie na zvířatech používající mitochondriální vazebný člen také potvrdily roli mitochondriálního uncouplingu v HCF1-indukované redukci hmotnosti. Závěrem lze říci, že HCF1/BSS způsobuje redoxně citlivou indukci mitochondriálního odpojení a aktivaci AMPK/PGC-1 v myotubech C2C12 s výsledným snížením tělesné hmotnosti a adipozity zvýšenou spotřebou energie.

Pro více informací prosím kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola má mnoho účinků, klikněte sem a dozvíte se více

1. Úvod

Obezita, která je definována jako abnormální hromadění tělesného tuku, se ukázala jako hrozba pro veřejné zdraví. Bez ohledu na metabolicky zdravé nebo metabolicky narušené stavy bylo zjištěno, že obezita je spojena se zvýšeným rizikem komorbidit a mortality [1]. Centrální obezita, abnormality v profilech cholesterolu a zvýšení hladiny triglyceridů v plazmě, což jsou všechny běžné rysy obézních jedinců, přispívají k vysokému výskytu diabetu 2. typu, kardiovaskulárních onemocnění, nekardiovaskulárních úmrtí a rakoviny související s obezitou u obézních jedinců [ 2]. Proto je snížení tělesné hmotnosti a adipozity považováno za klíčové pro prevenci zdravotních následků souvisejících s obezitou. Management obezity klade důraz především na nastolení optimální energetické bilance zvýšením energetického výdeje a/nebo snížením energetického příjmu. Úpravy životního stylu, včetně zvýšení fyzické aktivity a rozvoje zdravých stravovacích návyků, jsou obecně považovány za bezpečné přístupy k navození hubnutí. Tyto přístupy se však obecně ukázaly jako neefektivní Hindawi Publishing Corporation Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine Volume 2015, Article ID 142059, 12 pages http://dx.doi.org/10.1155/2015/1420592 Evidence-Based Complementary and Alternativní medicína ke zvýšení energetického výdeje nebo snížení energetického příjmu [3]. Strategie založené na použití farmakologických látek jsou proto v současnosti aktivně zkoumány. V této souvislosti naše předchozí zjištění prokázalo, že HCF1, poločištěná frakceCistanchesHerba(sušená celá rostlinaCistanche deserticolaYC Ma, charakterizovaný jako tonikum „posilňující jang“ v tradiční čínské medicíně), bylo prokázáno, že je účinný při prevenci obezity vyvolané dietou a souvisejících metabolických abnormalit [4]. Perorální podávání HCF1 způsobilo snížení hmotnosti u myší krmených normální stravou (ND-) a vysokotučnou dietou (HFD-), pravděpodobně indukcí mitochondriálního odpojení v kosterním svalstvu, s výsledným zvýšením energetického výdeje [4] ]. Mechanismus, který je základem takového mitochondriálního odpojení{10}}indukovaného HCF (a tedy snížení hmotnosti), však zůstává nejasný. Mitochondriální uncoupling rozptyluje protonové gradienty zavedením alternativní dráhy protonové vodivosti přes vnitřní mitochondriální membránu (IMM), s výsledným snížením potenciálu mitochondriální membrány a mitochondriální tvorby ATP. Tento marný cyklus transportu protonů spotřebovává vysoký podíl metabolické energie v různých tkáních a je odpovědný za významnou část denního energetického výdeje s následným zvýšením využití molekul paliva (jako jsou mastné kyseliny), což způsobuje ztrátu hmotnosti a snížení adipozity [5, 6]. Pro potvrzení mitochondriálního uncoupling efektu produkovaného HCF1 byly účinky HCF1 na expresi MMP a UCP3 zkoumány v myotubech C2C12, což jsou diferencované svalové buňky odvozené ze stehenního svalu myší C3H. Naším cílem bylo prozkoumat biochemický mechanismus, který je základem snížení hmotnosti způsobené HCF1. Pro srovnání byl také studován 𝛽-sitosterol (BSS), aktivní složka HCF1. Možné zapojení mitochondriálního uncouplingu u HCF1-indukovaného snížení hmotnosti u obézních myší krmených HFD bylo dále zkoumáno společným podáváním HCF1 s chemickým vazebným členem, 6-ketocholestanolem (kCh). Adenosinmonofosfát-dependentní proteinkináza (AMPK), všudypřítomná exprimovaná serin/threonin-proteinkináza, představuje důležité centrum pro řízení buněčného energetického metabolismu. Po aktivaci AMPK integruje intra/extracelulární signály a vyvolává buněčné odpovědi prostřednictvím různých buněčných signálních kaskád [7, 8]. AMPK je schopen modulovat buněčný metabolismus regulací metabolických enzymových aktivit prostřednictvím přímé fosforylace. AMPK také produkuje dlouhodobé účinky na transkripční úrovni prostřednictvím své fosforylace peroxisomového proliferátorem aktivovaného receptoru 𝛾koaktivátoru-1 (PGC-1), což vede k adaptivním změnám v genové expresi související s energetickým metabolismem a mitochondriální funkcí [9, 10]. V tomto ohledu jsme také zkoumali účinek HCF1/BSS na AMPK/PGC-1 signální dráhu v myotubech C2C12.

cistanchevýhody deserticoly

2. Materiály a metody

2.1. Extrakce bylin.

Cistanches Herba, sušená celá rostlinaCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), byl zakoupen od místního prodejce bylinek (Lee Hoong Kee). Bylina byla ověřena dodavatelem a vzorek poukázky (HKUST00301) byl uložen v Divizi biologických věd, Hong Kong University of Science and Technology (HKUST). ACistanchesBylinný extrakt byl získán ethanolovou extrakcí rozemletého rostlinného materiálu zahříváním pod zpětným chladičem při teplotě 78 °C po dobu 2 hodin, jak bylo popsáno dříve [11], s výtěžkem 14 procent (w/w). Extrakt byl dále frakcionován pomocí chromatografie na silikagelu [12]. HCF1 byl získán ve výtěžku 1,14 procent (hmotn./hmotn.). Extrakt byl vysušen odpařením rozpouštědla za sníženého tlaku při 50 °C a vysušený extrakt byl před použitím skladován při -20 °C.

2.2. Chemikálie.

Anti-𝛽-aktinová protilátka, BSS (CAS 83-46- 5), koktejl inhibitorů proteázy a koktejl inhibitorů fosfatázy 3 byly zakoupeny od Sigma (St Louis, MO). Protilátka anti-AMPK𝛼1/2, protilátka anti-p-AMPK𝛼1/2, protilátka anti PGC-1 (H-300), protilátka anti-UCP3 (E-18), {{16} }[4- (2-piperidin-1-yl-ethoxy)-fenyl)]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a ]-pyrimidin (CC) a 6-ketocholestanol (kCh) byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-COX protilátka byla zakoupena od Cell Signaling (Danvers, MA). Anti-lamin B1 protilátka byla zakoupena od Abcam (Cambridge, MA). Testovací činidlo Bio-Rad bylo zakoupeno od Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA, USA). Všechny ostatní chemikálie byly zakoupeny od Sigma (St. Louis, MO, USA).

2.3. Buněčná kultura.

C2C12, kulturu myoblastů odvozených z kosterního svalstva myší C3H [13] z American Type Culture Collection (ATCC), laskavě poskytl profesor Zhenguo Wu (Division of Life Science, HKUST). Buněčná linie byla kultivována v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) (Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY), doplněném 10 procenty (obj./obj.) fetálním bovinním sérem (FBS), 100 IU/ml penicilinu a 100 𝜇g /ml streptomycinu a 17 mM NaHC03. Diferenciace myoblastů C2C12 na myotuby C2C12 byla indukována nahrazením kompletního kultivačního média diferenciačním médiem obsahujícím 2 procenta (v/v) koňského séra (HS) místo 10 procent (v/v) FBS. Buňky byly pěstovány v atmosféře 5 % (obj./obj.) CO2 na vzduchu při 37 C.

Cistanchemáúčinek hubnutí

2.4. Biochemické analýzy v myotubech C2C12

2.4.1. MMP.

Potenciál mitochondriální membrány byl měřen pomocí fluorescenčního kationtového barviva, 5,5,6,6 -tetrachlor- 1,1,3,3 -tetraethylbenzimidazolyl-karbocyanin jodidu (JC- 1) [14]. Buňky byly kultivovány v hustotě 1.0 × 104 buňky v 96-jamkových mikrotitračních destičkách. Po stabilním připojení byly buňky předem obarveny 20 M JC-1 (rozpuštěné v kultivačním médiu) při 37 °C po dobu 10 minut. Po předběžném barvení byly buňky dvakrát promyty Hankovým vyváženým solným roztokem (HBSS), doplněným 0,1 procenta hovězího sérového albuminu (BSA). Měření MMP bylo zahájeno přidáním média obsahujícího HCF1/BSS. Množství J-agregátu molekul JC-1, které se tvoří ve vnitřní membráně mitochondrií s vysokým membránovým potenciálem, bylo stanoveno sledováním červené fluorescence JC-1 (Ex 485 nm/Em 580 nm) Důkaz -Based Complementary and Alternative Medicine 3 při 37°C po dobu 1 hodiny. MMP byla stanovena odečtením intenzit fluorescence slepých vzorků (tj. obsahujících pouze médium) od intenzit fluorescence testovaných vzorků. Hodnoty MMP buněk inkubovaných s HCF1/BSS byly normalizovány s příslušnými kontrolními hodnotami neinkubovanými s HCF1/BSS a vyjádřeny jako procento kontroly.

2.4.2. Aktivace adenosinmonofosfát-dependentní proteinkinázy (AMPK).

Myotuby C2C12 byly nasazeny (1,5 x 105 buněk) do 6-jamkových mikrotitračních destiček. Po stabilním připojení byly buňky preinkubovány s médiem obsahujícím HCF1/BSS po dobu 8 hodin. Předinkubované buňky byly poté lyžovány 300 µl lyzačního pufru dodecylsulfátu sodného (SDS-) (20 mM Tris-Cl, 2 mM kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), 3 mM kyselina ethylenglykoltetraoctová (EGTA), 1 procento (w/ v) Triton X- 100, 10 procent (w/v) glycerol, 5 procent SDS, 1 mM dithiothreitol (DTT), koktejl inhibitorů proteázy a koktejl inhibitorů fosfatázy 3, pH 7,5). Lyzát byl dále centrifugován při 12 000 x g při 4 °C po dobu 10 minut, aby se odstranily buněčné zbytky. Rozsah aktivace AMPK byl hodnocen z relativního poměru fosfor-AMPK𝛼 (p-AMPK) a AMPK𝛼 analýzou Western blot s použitím anti-p-AMPK𝛼1/2 protilátky a anti-AMPK𝛼1/2 protilátky po analýze SDS-PAGE, s separační gel 10% (v/v) akrylamidu. Byl nanesen buněčný lyzát (20 µg) a jako referenční marker byl použit -aktin. Imunitně obarvené proteinové pásy byly analyzovány denzitometrií (Quantiscan, Biosoft) a množství (libovolné jednotky) p-AMPK𝛼 a AMPK𝛼 byly normalizovány s ohledem na hladinu 𝛽-aktinu (libovolné jednotky) ve vzorku.

2.4.3. PGC-1 jaderná translokace.

Myotuby C2C12 byly kultivovány v hustotě 2.0×106 buněk v 100 mm kultivačních miskách. Po 8 hodinách preinkubace HCF1/BSS byly buňky trypsinizovány a inkubovány s 1 ml ledově chladného hypotonického pufru (10 mM HEPES, 1,5 mM KCI a 1,5 mM MgCl2, pH 7,9) při 4 °C po dobu 10 minut. Po inkubaci byly buňky shromážděny centrifugací při 500 x g při 4 °C po dobu 10 minut. Odebrané buňky byly resuspendovány ve 300 𝜇L hypotonického pufru, doplněného 0,5 mM DTT, 0,1 procenta (w/v) nonyl fenoxy-polyethoxylethanolu (NP-40) a koktejlem inhibitorů proteázy, aby se usnadnila extrakce rozpustných cytosolových proteinů . Výsledný lyzát byl centrifugován při 12 000 x g při 4 °C po dobu 1 minuty, aby se získaly cytosolové (supernatant) a jaderné (pelety) frakce. Izolace jaderných proteinů bylo dosaženo inkubací pelety s 25 µL ledově chladného hypertonického pufru (20 mM HEPES, 25 procent (w/v) glycerol, 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,2 mM DTT, 0. koktejl inhibitoru proteázy, pH 7,9) při 4 °C po dobu 30 minut s následnou centrifugací při 12 000 xg při 4 °C po dobu 5 minut. Rozsah jaderné translokace PGC-1 byl odhadnut z relativního poměru hladiny PGC-1 v cytosolových a jaderných frakcích pomocí analýzy Western blot po analýze SDS-PAGE, jak je popsáno výše. Byly naneseny jak cytosolové, tak jaderné frakce (20 𝜇g), přičemž jako cytosolové a jaderné referenční markery byly použity -aktin a lamin B1. Množství (libovolné jednotky) PGC-1 byla normalizována s ohledem na hladiny -aktinu a laminu B1 (libovolné jednotky) ve vzorku.

2.4.4. Exprese mitochondriálního uncoupling proteinu 3 (UCP3) a cytochrom c oxidázy (COX).

Myotuby C2C12 byly nasazeny (2.0 × 106 buněk) na 100 mm kultivační plotny. Po stabilním připojení byly buňky preinkubovány s médiem obsahujícím HCF1/BSS při 37 °C po dobu 48 hodin. Po odstranění média obsahujícího HCF1/BSS byly buňky trypsinizovány a lyžovány přidáním 300 ml SDS-lyzačního pufru. Buněčný lyzát byl centrifugován při 12 000 x g při 4 °C po dobu 10 minut, aby se odstranily buněčné zbytky. Hladiny UCP3 a COX v supernatantu byly stanoveny analýzou Western blot s použitím protilátky anti-UCP3 (E- 18) a protilátky anti-COX po analýze SDS-PAGE, jak je popsáno výše. Byl nanesen buněčný lyzát (50 µg) a jako referenční marker byl použit Ν-aktin. Množství (libovolné jednotky) UCP3 a COX byly normalizovány s ohledem na hladinu 𝛽-aktinu (libovolné jednotky) ve vzorku.

2.5. Péče o zvířata.

ICR myši (8 týdnů; 30 až 35 g pro samce a 25 až 30 g pro samice) byly chovány v 12hodinovém cyklu tma/světlo v prostředí s řízenou vzduchem/vlhkostí při teplotě asi 22 °C a potrava a voda byly povoleny ad libitum v zařízeních péče o zvířata a rostliny (APCF) na Hong Kong University of Science and Technology (HKUST). Všechny experimentální postupy byly schváleny Výborem pro výzkumnou praxi (HKUST) (číslo schválení protokolu pro zvířata 2013049; datum schválení: 25. září 2013; délka experimentu: 3 roky).

2.6. Protokol léčby.

Aby se prozkoumal účinek 6-keto-cholestanolu (kCh) na snížení hmotnosti vyvolané HCF1- u myší krmených HFD, byla zvířata náhodně rozdělena do 6 skupin, v každé bylo 10–15 myší: (1 ) normální strava (ND, 13 procent energie pocházející z tuku, zakoupeno od LabDiet, produkt číslo 5010) kontrola; (2) ND plus kCh (v denní dávce 9 mg/kg); (3) HFD (60 procent energie získané z tuku; zakoupeno od Research Diet Inc., číslo produktu D12492) kontrola; (4) HFD plus HCF1 (v denní dávce 45 mg/kg); (5) HFD plus kCh; a (6) HFD plus HCF1 plus kCh. Bylo prokázáno, že HCF1 v denní dávce 45 mg/kg vede k významnému snížení hmotnosti u myších samců [4], zatímco kCh při denní dávce 9 mg/kg ruší HCF1- indukovaný odpojovací účinek v mitochondriích izolovaných z myšího kosterního svalu (data nejsou uvedena). Zvířatům byl intragastricky podáván kCh, HCF1 nebo HCF1/kCh, 5 dní v týdnu, po dobu 8 týdnů (tj. celkem 40 dávek). Kontrolní myši obdržely pouze vehikulum (olivový olej). Tělesná hmotnost a spotřeba potravy myší byly monitorovány týdně v průběhu experimentu. Změny tělesné hmotnosti byly kvantifikovány výpočtem plochy pod křivkou (AUC) z grafu vynášejícího procento počáteční tělesné hmotnosti proti času (týden 1 až 8) a vyjádřeny v libovolných jednotkách. Myši byly usmrceny cervikální dislokací 24 hodin po poslední dávce (s kCh, HCF1 nebo HCF1/kCh) po celonočním hladovění. Vzorky m. gastrocnemius byly vyříznuty pro měření mitochondriálního dýchání. Tukové polštářky (gonadální, retroperitoneální a mezenterický tuk) byly vypreparovány a zváženy. Poměr hmotnosti konkrétního tukového polštáře k tělesné hmotnosti byl odhadnut a vyjádřen jako "index tukového polštáře".

Cistancheje přírodní bylina s účinkem na hubnutí

2.7. Biochemické analýzy u myší

2.7.1. Vzorové přípravky.

Rozemleté ​​svalové tkáně gastrocnemia byly smíchány s 10 ml roztoku kolagenázy (0,075 procent (hmotn./obj.)) v pufru (100 mM KCl, 50 mM MOPS, pH 7,2) a směsi byly inkubováno při 4 °C po dobu 20 minut. Směsi natrávených tkání byly centrifugovány při 600 x g při 4 °C po dobu 20 minut. Supernatant byl odstraněn; natrávené tkáně byly smíchány s 20 ml ledově chladného homogenizačního pufru (50 mM sacharóza, 200 mM mannitol, 5 mM KH2P04, 1 mM EGTA a 5 mM MOPS, pH 7,2) a homogenizovány na ledu homogenizátorem z teflonu. při 4000 ot./min pro 25 až 30 úplných zdvihů. Homogenáty byly poté centrifugovány při 600 x g při 4 °C po dobu 10 minut, čímž byla získána frakce bez jádra (supernatant). Mitochondriální pelety byly připraveny ze svalových homogenátů centrifugací při 9200 xg při 4°C po dobu 30 minut. Mitochondriální frakce byly získány suspendováním pelet v pufru obsahujícím 125 mM KCl, 10 mM Tris-Base, 2 mM KH2P04, 0,5 mM EGTA a 20 mM MOPS, pH 7,5 [15].

2.7.2. Mitochondriální dýchání.

Rychlosti dýchání v mitochondriích izolovaných z myšího kosterního svalstva byly stanoveny tak, jak popsali Wong a Ko [12]. Stručně řečeno, mitochondriální dýchání bylo měřeno polarograficky pomocí elektrody Clarkova typu (Hansatech Instruments, Norfolk) při 30 C. Mitochondriální frakce (1 mg proteinu/ml) byly inkubovány v dýchacím pufru (3{17} } mM KCI, 6 mM MgCl2, 75 mM sacharózy, 1 mM EDTA a 20 mM KH2P04, pH 7,0). Byl přidán roztok substrátu obsahující 15 mM pyruvát sodný a 5 mM malát sodný. Po ekvilibraci bylo dýchání ve stavu 3 zahájeno přidáním ADP (konečná koncentrace 0,6 mM). Když byl veškerý přidaný ADP spotřebován pro tvorbu ATP, byl přidán oligomycin, aby se vyvolalo dýchání ve 4. stavu. Poměr kontroly dýchání (RCR) byl odhadnut výpočtem poměru dechových frekvencí 3. a 4. stavu [16].

2.7.3. Mitochondriální exprese UCP3 v kosterním svalu myši.

Mitochondriální hladiny UCP3 byly odhadnuty analýzou Western blot s použitím anti-UCP3 (E-18) protilátky po analýze mitochondriální frakce SDS PAGE za použití separačního gelu 10% akrylamidu. Na gel byly aplikovány mitochondriální frakce izolované z myšího kosterního svalu (~60 𝜇g) a jako referenční marker byla použita cytochrom c oxidáza (COX). Imunobarvené proteinové pásy byly analyzovány denzitometrií a množství (libovolné jednotky) UCP3 normalizováno s odkazem na hladinu COX (libovolné jednotky) ve vzorku.

2.8. Proteinový test.

Koncentrace proteinu byly stanoveny pomocí soupravy pro stanovení proteinů Bio-Rad. Alikvot (10 𝜇L) vzorku mitochondriálního/buněčného lyzátu byl zředěn 40 𝜇L vody. Alikvot (10 𝜇L) naředěného vzorku byl poté přidán do jamky 96-jamkové mikrotitrační destičky, poté bylo přidáno 200 𝜇L zředěného Bio-Rad testovacího činidla (5-násobné ředění). Směs byla ponechána stát při teplotě místnosti po dobu 5 minut a poté byla měřena absorbance reakční směsi při 570 nm. Koncentrace proteinu byla stanovena z kalibrační křivky za použití bovinního sérového albuminu (BSA) jako standardu.

2.9. Statistická analýza.

Všechna data byla vyjádřena jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM), pokud není uvedeno jinak. Data byla analyzována jednosměrnou analýzou rozptylu (jednosměrná ANOVA), pokud není uvedeno jinak, a rozdíly mezi skupinami byly detekovány pomocí Tukeyova testu rozsahu s 𝑃<>

Cistanchedeserticola mámnoho efektů

3. Výsledky

3.1. Účinky HCF1/BSS na MMP v C2C12 Myotubes.

Inkubace chemického odpojovače, karbonylkyanidu {{0}} (trifluormethoxy)fenylhydrazonu (FCCP), v koncentraci 1 𝜇M, způsobila časově závislé snížení MMP, přičemž rozsah snížení byl 29 procent při konec měření (obrázky 1 a 2). Naproti tomu HCF1 a BSS v koncentracích 30 ng/ml a 10 𝜇M zvýšily MMP o 5 a 4 procenta v prvních 10 minutách inkubace HCF1/BSS (obrázky 1 a 2) . Po počátečních zvýšeních vyvolaných HCF1/BSS následovalo postupné snížení MMP na 95, respektive 93 procent příslušné počáteční hodnoty na konci měření (60 minut inkubace HCF1/BSS) (obrázky 1 a 2). Změny MMP vyvolané HCF1/BSS byly charakterizovány použitím specifických inhibitorů. Rotenon (0,1 nM), inhibitor mitochondriálního komplexu I, a cholesterol (0,3 𝜇M), zesilovač tuhosti membrány, potlačovaly změny MMP vyvolané HCF1/BSS v průběhu měření (obrázky 1 a 2). Na druhou stranu, společná inkubace se specifickým inhibitorem UCP, GDP, chemickým vazebným členem, 6-ketocholestanolem (kCh) nebo antioxidantem, dimethylthiomočovinou (DMTU), snížila HCF1-indukované snížení MMP v pozdější době inkubace HCF1 (obrázek 1). GDP, kCh a DMTU také snížily BSS-indukované snížení MMP v pozdější době inkubace BSS, přičemž hodnota MMP byla 110 procent ve srovnání s příslušnou časově odpovídající kontrolou (obrázek 2).

3.2. Vliv HCF1/BSS na aktivaci AMPK v C2C12 Myotubes.

Vliv HCF1 na AMPK byl zkoumán měřením poměru fosforylovaného AMPK𝛼 (p-AMPK𝛼) k celkovému AMPK𝛼 (AMPK𝛼), což ukazuje rozsah aktivace AMPK. Inkubace s HCF1 při koncentracích 30 a 100 ng/ml vyvolala časově závislé zvýšení aktivace AMPK, přičemž rozsah těchto zvýšení byl 32 a 43 procent po 8 hodinách inkubace HCF1, v porovnání s příslušným časem- přizpůsobené ovládání (obrázek 3). Souběžně s HCF1 preinkubace s BSS (10 µM) významně zvýšila rozsah aktivace AMPK o 25 procent ve srovnání s nepředinkubovanou kontrolou (obrázek 5). Aktivace AMPK indukovaná HCF1/BSS v myotubách C2C12 byla zcela zrušena koinkubací buď s kCh (oddělovač) nebo DMTU (obrázky 4 a 5, tabulky 1 a 2 doplňkového materiálu dostupného online

3.3. Vliv HCF1/BSS na jadernou translokaci PGC-1 v myotubech C2C12.

Aktivaci PGC-1 lze nepřímo měřit rozsahem jaderné translokace PGC-1. Preinkubace s HCF1 a BSS významně zvýšila PGC-1 jadernou translokaci o 25 a 28 procent, jak dokazují zvýšené poměry PGC-1 v jádře k cytoplazmě (obrázky 6 a 7). Specifický inhibitor AMPK, 6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)-fenyl)]-3-pyridin-4-ylpyrazolo[ 1,5-a]-pyrimidin (CC) v koncentraci 10 𝜇M inhiboval HCF1/BSS-indukovaný nárůst PGC-1 jaderné translokace o 156 a 235 procent v myotubech C2C12 ( Tabulky 1 a 2). HCF1/BSS indukované jaderné translokaci PGC-1 bylo také zabráněno koinkubací buď s kCh nebo DMTU (obrázky 6 a 7, tabulky 1 a 2 doplňkového materiálu).

3.4. Účinek HCF1/BSS na mitochondriální expresi UCP3 a cytochrom c oxidázy (COX) v myotubech C2C12.

Aby bylo možné určit význam aktivace indukované HCF1/BSS v dráze AMPK/PGC-1, účinky HCF1/BSS na mitochondriální uncoupling a biogenezi, jak byly hodnoceny hladinami UCP3 a COX (spolehlivý indikátor mitochondriální hmoty v buňkách), resp. Předinkubace s HCF1/BSS významně zvýšila mitochondriální hladiny UCP3 a COX, přičemž rozsah těchto zvýšení byl 37 a 23 procent (v myotubách inkubovaných HCF) (obrázek 8) a 52 a 24 procent (v myotubách inkubovaných BSS ) (obrázek 9), v tomto pořadí, ve srovnání s příslušnou nepředinkubovanou kontrolou. Zvýšení hladin UCP3 a COX vyvolané HCF1/BSS bylo zcela zabráněno koinkubací HCF1 s kCh, DMTU, popř.

CC (tabulky 1 a 2 doplňkového materiálu). Je třeba poznamenat, že koncentrace kCh a CC použité v tomto experimentu byly upraveny na 20 a 1 M, v daném pořadí, aby se zabránilo cytotoxickým účinkům kCh a CC na myotuby C2C12 (nepublikované pozorování).

3.5. Role mitochondriálního uncouplingu v HCF1-indukované redukci hmotnosti u obézních myší vyvolaných HFD.

Možná role mitochondriálního uncouplingu v HCF1-indukované redukci hmotnosti byla dále zkoumána použitím chemického vazebného členu, kCh (tabulka 3 doplňkového materiálu). HCF1 indukoval mitochondriální odpojení v kosterním svalstvu myší, jak dokazuje snížení poměru mitochondriální kontroly dýchání (RCR) a zvýšení mitochondriální exprese UCP3 u myší krmených ND i HFD. kCh per se (při denní dávce 9 mg/kg) významně zvýšilo mitochondriální RCR o 23 procent u myší krmených ND (ale ne u myší krmených HFD). HCF1-indukované mitochondriální uncoupling u myší krmených HFD bylo zcela inhibováno koléčbou kCh. HCF1 způsobil snížení hmotnosti u myší krmených ND i HFD. Tento účinek byl spojen s potlačením HFD-indukovaného zvýšení indexu viscerálního tuku. Na rozdíl od HCF1 neměl kCh během 8-týdenního průběhu experimentu žádný detekovatelný účinek na přírůstek hmotnosti u zvířat s ND a HFD. Společné podávání kCh s HCF1 zrušilo HCF1-indukované supresivní účinky na zvýšení tělesné hmotnosti a indexu viscerálního tuku u myší vyvolané HFD (tabulka 3 doplňkového materiálu).