Oxidační stres, dysfunkční energetický metabolismus a destabilizující neurotransmitery změnily cerebrální metabolický profil u potkaního modelu simulovaného saturačního potápění helioxem na 4.0 MPa Ⅱ

Postup extrakce tkáně

Postup extrakce polárních metabolitů ze vzorků tkáně byl menší modifikací, jak bylo popsáno [18]. Předem zvážené vzorky zmrazené tkáně byly rozmraženy na ledu a poté podrobeny mechanické homogenizaci v ledově chladném systému rozpouštědel methanol-chloroform-voda stupně HPLC (400 μL, 400 μl, respektive 285 μl na 100 mg mozkové tkáně) za použití tkáňového homogenizátoru (Precellys 24, Bertin Technologies, Villeurbanne, Francie). Výsledné homogenáty byly ponechány na ledu po dobu 30 minut a poté centrifugovány při 12,000 xg po dobu 10 minut při 4 °C. Supernatant z každého vzorku byl poté odstraněn a lyofilizován, aby se získal prášek obsahující polární metabolity v lyofilizační sušárně (FD-1A-80, BIOCOOL, Čína). Každý vzorek prášku byl následně rekonstituován s 550 μl PBS pufru s 0,1 procenta TSP a všechny vzorky byly poté důkladně promíchány na rotační míchačce a centrifugovány při 12,000 xg po dobu 20 minut při 4˚C. Alikvot 500 ul supernatantu byl poté přenesen do zkumavky NMR o průměru 5,0 mm (Norrel, UK). Princip extrakce proteinu ve vzorku kortexu byl stejný, jak bylo popsáno dříve, bez jakýchkoliv modifikací. Přesné množství vzorků kůry bylo nalito do homogenizačního pufru (HEPES 25 mmol/l, pH 7,4, MgC12 5 mmo1/l, DTT 2 mmol/l, EDTA 1,3 mmol/l, EGTA 1 mmol/l, 0,1 procenta Tritonu X-100, aprotininu, pepstatinu A a leupeptinu po 10 ug/ml) a ručně homogenizovány v ledové lázni. Směs byla odstřeďována při 1,000 x g po dobu 10 minut při teplotě 4 °C a supernatant byl použit pro kvantifikované koncentrace proteinu pomocí Bradfordova testu.

Klikněte sem a zjistěte antioxidační funkci Cistanche

Biochemický test

Pro kvantifikaci metabolických enzymů Na-KATPázy a AChE a neurotransmiterů DA, E, NE, 5HT a GABA byl použit citlivý, kompetitivní enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) s testovacími soupravami. ELISA také stanovila hladiny SOD, MDA a GPx v kortikální tkáni pomocí testovacích souprav podle pokynů výrobce.

NMR měření

Účinné kvantifikace tkáňových metabolitů bylo dosaženo pomocí analytické platformy založené na kapalném NMR spektrometru Bruker Avance-III s vysokým rozlišením vybaveném kryogenní sondou s vysokou citlivostí pracující na frekvenci 600. 17 MHz pro 1H pozorování při 298 K. Vodou potlačená jednorozměrná 1H ZGPR (TOPSPIN verze 3.0, Bruker Biospin) pulzní sekvence (RD-90˚-ACQ) byla aplikována na získat NMR data pro každý vzorek. Čtyři fiktivní skeny a 128 přechodných jevů byly zaznamenány do časové domény 32 K datových bodů s použitím spektrální šířky 20 ppm s relaxačním zpožděním 10,0 s a dobou akvizice 2,73 s. Exponenciální funkce rozšiřování čar 0,3 Hz a nulové plnění na 64 K datových bodů byly aplikovány na všechny volné indukční rozpady (FID) před Fourierovou transformací. Další dvourozměrné NMR techniky s gradientovou korelační spektroskopií pulzního pole (gCOSY) a 2D homonukleární totální korelační spektroskopií (TOCSY) byly použity pomocí standardních pulzních programů na vybraných vzorcích k potvrzení přiřazení chemických posunů. Při získávání všech spekter byl použit automatický měnič vzorků pro kontinuální dodávání vzorků.

Identifikace a potvrzení metabolitů

NMR signály založené na umístění jednotlivých rezonancí na spektrech byly identifikovány v softwarovém balíčku Chenomx NMR Suite v. 8.4 (Evaluation version). Potvrzení některých přiřazení metabolitů byla provedena s ohledem na chemické posuny, vazebné konstanty a multiplicitní vzory metabolitů jako informace o skalárních vazeb extrahovaných z 1 H–1 H COSY, 1 H–1 H TOCSY, veřejných NMR databází, jako jsou COLMAR a Human Metabolome Databáze (HMDB) a literatura [18, 19].

Vícerozměrná statistická analýza

Protokol předběžného zpracování použitý pro předběžné zpracování každého 1D1H NMR spektra byl stejný jako protokol popsaný v naší předchozí práci [20]. 'H NMR spektra byla fázována a korigována na základní linii pomocí MestReNova (Mestrelab Research, SL, Španělsko) a spektrální oblast každého metabolitu byla integrována do jednoho vědra. Rezonance signálu organického rozpouštědla a reziduální signální oblast H20/HOD byly odstraněny ve všech 1D1H NMR spektrech. Ve všech spektrech byla použita procedura 0.{{30}}03 Hz segmentu a normalizace na součet spektrální intenzity vynásobený 10000. Pro analýzu v dalším kroku byly vybrány pouze hodnoty největšího segmentu v jednom píku, aby se zabránilo nesprávné interpretaci diskriminačních metabolitů v důsledku překrývajících se signálů. Následně byly extrahovány integrální skupiny 47 metabolitů a podrobeny jednorozměrné a vícerozměrné analýze dat. Indiskriminační analýza analýzou hlavních komponent (PCA) a diskriminační analýza pomocí částečné diskriminační analýzy nejmenších čtverců (PLS-DA) a diskriminační analýza ortogonálních projekcí do latentních struktur (OPLS-DA) byla provedena pomocí softwarového balíku SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics , Umeå, Švédsko) škálováno na data rozptylu jednotek. Grafy skóre PCA a PLS-DA byly ilustrovány první a druhou hlavní složkou (t[1], t[2]), zatímco graf skóre OPLS-DA použil t[1] a ortogonální složku (to[1 ]). Parametry Q2 (cum), R2Y(cum) a R2X (cum) byly vypočteny pro testování robustnosti diskriminačních modelů proti přesazení [21]. Jak již bylo popsáno výše, hodnota hodnocení kvality Q2 � 0,4 je považována za spolehlivý model. Strategie sedminásobné křížové validace a 200krát permutační test s první komponentou byly použity k ochraně před přepasováním modelu a dalšímu ověření spolehlivosti a důvěryhodnosti modelů. Pokud měla regresní přímka Q2 negativní průsečík a hodnoty Q2 proložené v bodě nejvíce vlevo byly větší než všechny hodnoty Q2 v pravých bodech v permutovaném testu, byl zavedený model OPLS-DA robustní [22]. Byla použita výchozí 10-strategie křížového ověření skládání, aby se předešlo nadměrnému přizpůsobení modelu. Obecně se statistika hodnocení kvality (Q2) � 0,4 považuje za spolehlivý model, jak bylo popsáno dříve. Korelační koeficienty (r) a hodnoty VIP extrahované z modelů OPLS-DA byly použity k identifikaci metabolitů, které významně přispěly k oddělení mezi těmito dvěma skupinami. Kromě toho byly pomocí funkce vypočteny násobné změny metabolitů mezi skupinami. IA/IB, kde IA a IB představují střední hodnoty integrálu metabolitu ve skupinách A a B, v daném pořadí. Teplotní mapa a rámečkové grafy byly vyneseny pro usnadnění pochopení variací metabolitů mezi skupinami.

Jednorozměrná statistika metabolitových integrálů

Celkový průměr metabolitů v každé skupině je vyjádřen jako průměr ± standardní odchylka (SD). Jednorozměrná analýza byla také provedena pomocí ANOVA (analýza rozptylu). Statisticky významné rozdíly mezi skupinami byly vyhodnoceny nepárovým t-testem dvou konců po logaritmické konverzi v softwaru GraphPad Prism V 8.4.3 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA). Statisticky významné rozdíly byly definovány hodnotami p (< 0.05). According to the three criteria, including an absolute value of r greater than 0.50, a value of VIP greater than 1.0, and a p-value less than 0.05, the bucket variables with one of three features will be selected as discriminatory variables. Because more than one bucket value was listed from the same metabolite, two or more discriminative variables arising from the same metabolite will be present in the discriminatory panel. Selection will be carried out based on VIP rankings, and only the variables from the same metabolites with the highest VIP values were therefore selected as discriminatory metabolite level features, which will be included in the next-step analysis.

Systémová statistická metabolická korelační analýza a hierarchická shluková analýza

Výpočet Pearsonova korelačního koeficientu a hierarchická shluková analýza byly provedeny na základě relativních integrálů metabolitů v R Studio (verze 1.4.1717) s malými skripty. Pro každý pár skupin byla korelační matice znázorněna na mapě pixelů, jak je popsáno v literatuře [21]. Stručně řečeno, pro každou proměnnou v jedné skupině byly korelace s hodnotami p menšími než 0.05 byly považovány za významné statistické korelace a byly ponechány pro konstrukci konečné korelační sítě pro ilustraci latentních vztahů metabolitů v rámci skupiny a narušené metabolické vztahy mezi skupinami. Červenější čtverečky indikují významnější pozitivní korelaci. Modrější čtverečky označují významnější pozitivní korelaci. Bílé čtverečky označují korelaci bez významu. Analýza nejdůležitějších cerebrálních metabolických drah a sítí vyvolaných jako respondenti HSD byla provedena pomocí nástroje MetaboAnalyst 3.0. Pro provedenou analýzu topologie dráhy byla vybrána knihovna savčích drah Rattus norvegicus (krysa). Tento přístup byl také použit k poskytnutí odhadů dopadu dráhy, míry falešného objevu (FDR) a hodnot p.

Výsledky Kortikální biochemické indexy ze skupin HSD a CON

Pro ověření metabolických alteračních účinků HSD na mozkové tkáně, biochemické parametry, včetně metabolických enzymatických aktivit Na-KATP, AChE a LDH souvisejících s energetickým metabolismem, neurotransmitery DA, E, NE, 5HT a GABA a aproteiny související s oxidativním stresemzDRN, MDAa Gpx v ipsilaterálních kortexových tkáních HSD a CON potkanů ​​byly také stanoveny (tabulka 1). Ve srovnání s kontrolní skupinou byly hladiny DA, E, NE a MDA významně zvýšeny, zatímco obsahy Na-KATP, AChE, LDH, 5HT, GABA, SOD a Gpx byly v modelu HSD sníženy. Limit detekce testovacích souprav použitých v této práci byl uveden v tabulce S3 v souboru doplňkových materiálů.

Tabulka 1. Kvantifikace biochemických parametrů byla měřena v kortexové tkáni CON a HSD zvířat pomocí ELISA s testovacími soupravami. (průměr ± SD). označuje statistickou významnost.

Metabolity identifikované v1H NMR spektrech vzorků mozkové tkáně

Obr. 3 zobrazuje tři reprezentativní1H NMR spektra z kůry (obr. 3A), hipokampu (obr. 3B) a striata (obr. 3C) krysy HSD. Široká škála prominentních metabolitů byla identifikována podle1H NMR dat vzorků mozkové tkáně a jsou to anionty organických kyselin (laktát (Lac), malonát (Maln), sukcinát (Suc), malát (Mal), fumarát (FMA). ), 2-hydroxybutyrát (2-HB), acetát (Ace), formiát (For), taurin (Tau), askorbát (Asc), 2-hydroxybutyrát (2HIB)), aminokyseliny (leucin (Leu), isoleucin (Ile), valin (Val), alanin (Ala), glycin (Gly), tyrosin (Tyr), fenylalanin (Phe), aspartát (Asp), glutamin (Gln), glutamát (Glu) , threonin (Thr), serin (Ser), lysin (Lys), asparagin (Asn)), neurotransmitery (-aminobutyrát (GABA)), metabolity související s energií (kreatin (Cre), adenosintrifosfát (ATP), adenosinmonofosfát ( AMP)), metabolity související s fosfolipidy (Ofosfoethanolamin (PEA), O-fosfocholin (Pcho), sn-glycero-3-fosfocholin (GPC)) a další (myo-inositol (MI), nikotinamid adenindinukleotid (NAD plus ), kyselina nikotinurová (Nic), N-acetylaspartát (NAA), nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfát (NADP plus), UDP-N-galaktóza (UDPGa), uridin (Uri), uracil (Ura), cystidin (Cyt) uridin 5'-monofosfát (UMP), inosin 5'-monofosfát (IMP), inosin (Ino), cholin (Cho), karnitin (Car), glutathion (GSH). Tabulka S1 ukazuje podrobné informace o přiřazení metabolitů.

Metabolomická analýza odhalila změny metabolického profilu

PCA, průzkumný a nezaujatý analytický přístup 1H NMR spekter ze všech mozkových extraktů napříč různými oblastmi mozku, byl poprvé vytvořen, aby odhalil hlavní metabolické trendy řízené hyperbarickou expozicí 400 msw saturační prostředí heliox. Graf rozptylu PC1 vs. PC2 získaný z PCA (obr. S1A–S1C) dat integrálního segmentu odhalil určitou diskriminaci s určitým překrýváním mezi těmito dvěma klasifikacemi. Kontrolovaná vyšetření modelů PLS-DA (obr. S1A'–S1C') a OPLS-DA (obr. 4A–4C) vykazovala jasné třídní rozlišení metabolických profilů mezi skupinami. Obr. 4 ukazuje grafy skóre modelu OPLS-DA pro oblast kortexu (A), oblast hipokampu (B) a oblast striata (C), ukazující jasné rozlišení mezi skupinami HSD a kontrolami. Vysoká vysvětlená variace a správnost předpovědi odrážená hodnotami R2X a Q2 (S1A'–S1C' obr., obr. 4A–4C) a grafy permutačních testů (obr. 4'-4C'A) naznačovaly robustnost generovaných kontrolovaných modelů. Korelační koeficient (r) extrahovaný z grafů S-čáry, proměnná důležitost v projekci (VIP) a p-hodnota z neparametrických jednorozměrných testů byly shromážděny pro posouzení významných metabolitů odpovědných za vzorce rozlišující třídu. Při splnění kteréhokoli ze tří kritérií (absolutní hodnota r větší než 0,50, hodnota VIP větší než 1,0 spolu s hodnotou p menší než 0,05) jsme vybrali panel statisticky významných metabolitů (Tabulka 1) odpovědné za oddělení mezi skupinami CON a HSD. V tabulce 1 hodnoty násobku změny větší než 1 indikují zvýšenou hladinu ve skupině HSD, zatímco hodnoty násobku změny menší než 1 indikují sníženou úroveň ve skupině HSD. Průměrné hodnoty SD diskriminačních metabolitů jsou uvedeny v tabulce S2. Pomocí hierarchické shlukové analýzy metabolitů a metody průměrného propojení umožňuje vygenerovaná tepelná mapa (obr. 5A–5C) s dendrogramy lepší vizualizaci tří metabolických změn v oblasti mozku způsobených hyperbarickou expozicí v prostředí nasyceném heliem a kyslíkem.

Metabolické poruchy pozorované v různých oblastech mozku HSD potkanů

Výše zmíněná vícerozměrná analýza a jednorozměrná analýza využívající kbelíkovou výšku metabolitů v různých skupinách poskytly skvělou pracovní trubici k identifikaci diskriminačních metabolitů odhalujících potenciální neurologické metabolické změny spojené s událostmi HSD. V kortexové tkáni HSD byly nalezeny zvýšené AMP, FMA, Nic a Phe a pokles Ala, Asn, Car, Cho, Cyt, GABA, GSH, Ino, Lac, Pcho, Phe, Tyr, Ura a Uri skupina ve srovnání se skupinou CON (obr. 5A, tabulka 1). Mezitím se v hippocampu Ala, GSH, Lac, Uri, Cyt, GABA, Tyr a Ura také snížily a AMP se zvýšil ve skupině HSD, stejně jako v kortexu. Kromě toho byly upregulované Thr a downregulované Gly, ATP, Tau, Imp, Suc, Asc a DMA exprimovány v extraktech hippocampu skupiny HSD vzhledem ke kontrolám (obr. 5B, 5D, tabulka 1). Ve srovnání se skupinou CONS se obsah Cyt, GABA, Ura, Cho a Thr také snížil, stejně jako v kortexu a hipokampu. Navíc zvýšené hladiny aminokyselin s rozvětveným řetězcem (BCAA, včetně Leu, Ile, Val) a Lys a snížené hladiny Gln, NAA, NAD plus, NADP plus, Asp, série metabolitů ATP, Tau, IMP, a Suc, který se také snížil v hippocampu, a další dva metabolity, Ino a Pcho, které se také snížily v kortexu, byly pozorovány ve striatových tkáních potkanů ​​skupiny HSD (obr. 5C, 5D, tabulka 1). Takové množství metabolitů vždy naznačuje implikované molekulární dráhy se složitostí a rozmanitostí. Hodnoty integrálního segmentu diskriminačních metabolitů byly kvantifikovány a statisticky významné násobné změny jejich koncentrací mezi skupinou s heliox-saturací-hyperbarickou expozicí a kontrolní skupinou jsou shrnuty v tabulce S2 a tabulce 2 pro tři oblasti mozku.

Obr. 4. Grafy skóre ortogonální parciální diskriminační analýzy nejmenších čtverců (OPLS-DA) a grafy permutačních testů, které rozlišují účinek 400 msw heliox-saturační expozice na 1H NMR spektra z kontrolních skupin v kortexu (CONC, n=8, HSDC, n=8, A a A') (R2X=0,38; Q2=0,46), hippocampus (CONH, n {{12} }, HSDH, n=8, B a B') (R2X=0.37; Q2=0.43) a striatum (CONS, n=8, HSDS, n=8, C a C') (R2X=0.39; Q2=0.40). Hodnoty parametru Q2 v grafech skóre OPLS-DA, které byly rovné nebo větší než 0,40, spolu s hodnotami Q2 bodu nejvíce vlevo v permutovaných modelech byly větší než všechny proložené hodnoty Q2 pravých bodů (permutace test 80krát), což naznačuje, že zavedené modely OPLS-DA byly platné.

Pcho, které se také snížilo v kortexu, bylo pozorováno ve tkáních striata u krys skupiny HSD (obr. 5C, 5D, tabulka 1). Takové množství metabolitů vždy naznačuje implikované molekulární dráhy se složitostí a rozmanitostí. Hodnoty integrálního segmentu diskriminačních metabolitů byly kvantifikovány a statisticky významné násobné změny jejich koncentrací mezi skupinou s heliox-saturací-hyperbarickou expozicí a kontrolní skupinou jsou shrnuty v tabulce S2 a tabulce 2 pro tři oblasti mozku.

Obr 5. Teplotní mapa a statistické korelační grafy odvozené z hodnot segmentu diskriminačních metabolitů z kůry (A, A', vzorky HSDC leží v horním panelu a CONC leží v dolním panelu), hippocampu (B, B', HSDH skupina leží v horním panelu a CONH leží v dolním panelu) a striatum (vzorky C, C', HSDS leží v horním panelu a CONS leží v dolním panelu) tkáně HSD a CON potkanů. Metabolity na teplotní mapě jsou organizovány hierarchickým shlukováním na základě celkové podobnosti ve vzorcích úrovní. Vennův diagram (D) ilustrující překrytí metabolitů mezi srovnáními HSDC-CONC, HSDH-CONH a HSDS-CONS.

Metabolitová korelační analýza

Vztah mezi nebo mezi metabolity byl na obr. 5A'-5C' tak komplexní. U energetických metabolitů jsou pozitivní korelace pro Lac vs Ala v HSDC, AMP vs IMP v HSDH, ATP vs Pcho v HSDS, Suc vs GABA/Gln/Tyr/NAA v HSDS a negativní korelace pro Lac vs Thr a GSH vs. Suc v HSDH, Suc vs Val v HSDS byly přítomny v grafech korelace metabolitů. U neurotransmiterů byly pozitivní korelace pro GABA vs Car v HSDC, GABA vs Cho v CONH a GABA vs Suc/Ino/Gln v HSDS v grafech korelace metabolitů. Negativní korelace pro GABA vs FMA v CONC a GABA vs NAA/Ura/NADP plus v CONS byly přítomny v grafech korelace metabolitů. Pro související metabolityoxidační stres,pozitivní korelacepro GSH vs Asn v HSDC a CONC, Tau vs Lac v HSDH, Tau vs Suc/Ala v CONH, negativní korelace pro GSH vs Suc v HSDH, Tau vs Thr v HSDH byly přítomny v korelaci metabolitů pozemků.

Analýza metabolické dráhy

Kvantitativní analýza dráhy sestávající z analýzy obohacení dráhy a dopadu dráhy z topologie dráhy odhalila vysoce statisticky významné HSD-indukované modulace řady metabolických drah. Skóre dopadu dráhy spolu s mírou falešného objevu (FDR) a hodnotami p jsou popsány na obr. 6. Dráhy byly považovány za významně obohacené, pokud byly hodnoty p nižší než 0.05; profilované metabolity (shody) vzhledem k celkovým metabolitům dráhy (stav shody) byly vyšší než 1; a skóre dopadu (indikující dopad významně ovlivněných metabolitů v dráze na základě síťové topologie měření relativní centrality mezilehlosti) byly vyšší než 0. Dráhy v kůře (obr. 6A) s největší hodnotou metabolického dopadu bylyfenylalanin, tyrosin, abiosyntéza tryptofanu>metabolismus fenylalaninu> metabolismus pyrimidinů > metabolismus alaninu, aspartátu a glutamátu. Dráhy v hippocampu (obr. 6B) s největším metabolickým dopadem byly biosyntéza fenylalaninu, tyrosinu a tryptofanu > metabolismus glutathionu > metabolismus glycinu, serinu a threoninu > metabolismus purinů > metabolismus pyrimidinů > metabolismus alaninu, aspartátu a glutamátu > metabolismus butanoátu . Dráhy ve striatu (obr. 6C) s největším metabolickým dopadem byly metabolismus alaninu, aspartátu a glutamátu > metabolismus nikotinátu a nikotinamidu > metabolismus purinů.

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp% 2fTel% 3a plus % 7b % 7b0% 7d