V této studii byl galaktanový exopolysacharid (EPS) zCistancheKR780676 byl hodnocen z hlediska jeho potenciáluzmírnit oxidační strespomocí in vitro testů a in vivo studií, saccharomyces cerevisiae (divoký typ) a jehoantioxidant(sod14, sod24, tsa14, cta2 a ctt12)antiapoptotický(pep4 a fs14) aproti stárnutí(sod24, tsa1 a ctt12)) isogenní genové deleční mutanty. Galactan vykazoval silné DPPH aaktivita vychytávání oxidu dusnatéhos hodnotou lCso 450 a 138 ug/ml. V kvasinkovém mutantním modelu byl oxidační stres generovaný H0 rozsáhle vychytáván galaktanem v médiu, jak bylo potvrzeno pomocí spotových testů následovaných fluorescenčním DCF-DA barvením a mikroskopickými studiemi. Ošetření galaktanem vedlo ke snížení ROS generovaného v kvasinkových mutantních buňkách, jak bylo prokázáno sníženou intenzitou fluorescence. Dále galaktan vykazoval ochranu proti oxidativnímu poškození prostřednictvím H,O-indukované inhibice apoptózy v kvasinkových mutantních kmenech (pep4 a fs1), což vedlo ke zvýšené míře přežití neutralizací oxidačního stresu. V chronologickém testu životnosti vykazovaly WT buňky ošetřené galactanEPS 8% zvýšení životaschopnosti, zatímco sod2 mutant vykazoval 10-15% zvýšení, což ukazuje na výrazné účinky proti stárnutí. Galactan od W. confuse KR780676 má obrovský potenciál pro použití jako přírodní antioxidant pro nutriční, farmaceutické a potravinářské technologické aplikace. Podle našich znalostí se jedná o první zprávu o hloubkovém hodnocení in vivo antioxidačních vlastností abakteriálního EPS v systému kvasinkových delečních modelů.

Kliknutím zbohatnete Cistanche na EPS

Oxidace je nezbytný proces pro udržení biologických procesů a také pro výrobu energie ve všech živých organismech. Reaktivní formy kyslíku (ROS) a radikály reaktivních forem dusíku (RNS) jsou produkovány normálním katabolismem molekul kyslíku a dusíku. Silný oxidační stres vede k různým degenerativním stavům, jako je poškození DNA, buněčná degenerace a karcinogeneze. Ty mohou mít za následek mnoho zdravotních poškození, jako napřstárnutí, kardiovaskulární choroby, rakovina, cirhóza, ateroskleróza, cukrovkaa revmatoidní artritidy2-6, antioxidanty jsou molekuly, které zachycují volné radikály generované v potravinách nebo v živém systému a vedou k prevenci zdravotních stavů souvisejících s oxidativním poškozením-9. Ačkoli je mnoho syntetických antioxidantů dostupných jako silné lapače radikálů, některé z nich byly spojeny s některými nežádoucími vedlejšími účinky. Vzhledem k tomu se zvýšil zájem a poptávka po přírodních antioxidantech v potravinářském a farmaceutickém průmyslu. Většina rostlinných a houbových polysacharidů byla hlášena jako významná ochranná činidla proti ROS11–21. Různé mikrobiální exopolysacharidy (EPS) včetně bakterií mléčného kvašení (LAB) byly také popsány pro jejich podstatné antioxidační vlastnosti. Ty jsou považovány za bezpečnější alternativy k syntetickým. V posledních letech bylo mnoho EPS z LAB studováno pro jejich antioxidační potenciál a prevenci oxidačního poškození22,23. Antioxidační potenciál a ochranná role Weissella EPS byly také hlášeny z různých EPS izolovaných z Weissella mnoha kmenů, jako je Cistanche EPSWWC, W. confusa OF126, W. cibaria GA44, W. cibaria YB-1, W. confusa W4 a W. cibaria SJ1424–29. Antioxidační vlastnosti in vivo lze studovat pomocí různých modelových systémů, jako jsou buněčné linie30, C. elegans31, kvasinky32 a myši33. Dříve byly různé sloučeniny testovány na jejich potenciální antioxidační vlastnosti pomocí modelového systému mutantního genu s delecí kvasinkového genu Saccharomyces cerevisiae32,34–37.

Tato studie je zaměřena naantioxidační potenciál galaktanu EPSprodukovaný probiotickým kmenem Cistanche KR780676 z indického tradičního fermentovaného jídla (Idli těsto)38,39. V tomto článku je galaktanový EPS testován na antioxidační potenciál in vitro pomocí testů DPPH, oxidu dusnatého a vychytávání hydroxylových radikálů a in vivo antioxidantů,antiapoptotickýavlastnosti proti stárnutíza použití mutantního modelového systému s delecí kvasinkového genu.

Materiály a metody

Všechny chemikálie včetně doplňků médií byly získány od Hi-Media Laboratories Pvt. Ltd., Indie a DCF-DA (2,7-dichlordihydrofuorescein diacetát) od Sigma.

Mikrobiální kultura.CistancheV této studii byl použit KR780676 izolovaný z indického kysele fermentovaného jídla (Idli těsto), o kterém se uvádí, že produkuje galaktanový EPS 38.

Detekce výroby EPS. Produkce Te EPS W. confusa byla pozorována z úrovně kolonie. Stručně řečeno, kmen byl kultivován na MRS agaru (doplněném 2 procenty sacharózy). Po 48 hodinách při 30 stupních byl pozorován vzhled slizkých/slizničních kolonií. Produkce galaktanového EPS byla dále ověřena analýzou rastrovací elektronovou mikroskopií (SEM).

Extrakce EPS. Proces extrakce EPS byl proveden podle metody popsané v Kavitake et al.38. Čerstvé inokulum (10 procent) W. confusa bylo přidáno do 2% sacharózou obohaceného MRS média při 30 stupních po dobu 48 hodin za statických podmínek. Suspenze byla tímto způsobem odstředěna (12,000xg po dobu 15 minut), aby se izolovala biomasa, a dále ošetřena kyselinou trichlorokyselou, aby se odstranily proteinové skupiny. Galaktan-EPS byl vysrážen pomocí ledově studeného ethanolu (trojnásobný objem), odstředěn (19 200 x g po dobu 15 minut) a výsledný EPS byl rozpuštěn ve vodě Milli-Q. Surový EPS byl dialyzován při 12–14 kDa (48 hodin, 4 stupně) a lyofilizován po dobu 48 hodin.

Antioxidační vlastnosti galaktanu EPS in vitro. DPPH test na galaktan byl proveden podle dřívější zprávy od Ye et al.9 a procento vychytávací aktivity (procento) bylo vypočteno podle následující rovnice.

kde Ao a As je absorbance kontroly (blank, bez EPS) a vzorku. Test vychytávání radikálů oxidu dusnatého (NO) pro galaktan byl proveden podle Sreejayan et al.40 a vypočten podle následující rovnice:

kde Ao je absorbance kontroly (blank, bez EPS) a As je absorbance v přítomnosti EPS. Snižující energetická aktivita byla měřena pro galaktanový EPS, jak uvádí Ye et al.9. Te absorbance byla odečtena při 700 nm a redukční potenciál je indikován vysokou absorbanční kapacitou reakční směsi. Kyselina askorbová (Vc) byla použita jako pozitivní kontrola. Aktivita vychytávání hydroxylových radikálů galaktanového EPS byla hodnocena tak, jak je popsáno Yangem et al.41. Absorbance Te byla odečtena při 536 nm a procento zachycování bylo vypočteno jako:

kde vzorek je absorbance vzorku, slepý pokus je absorbance v nepřítomnosti vzorku a roztoku H2O2 a kontrola je absorbance v nepřítomnosti vzorku

In vivo antioxidační vlastnosti galaktanového EPS v kvasinkových mutantních kmenech.

Kmeny kvasinek, S. cerevisiae, BY4741 divokého typu (WT) (MATa his3∆:leu2∆:met15∆:ura3∆) a mutantní kmeny s delecí genu byly získány od společnosti Thermo Fisher Scientific, USA. Kvasinkové kmeny byly pěstovány v médiu kvasinkové pepton-dextrózy (YPD) doplněném nebo bez 200 ug/ml Geneticinu (G418 sulfát) pro selekci mutantů. Pevné médium YPD bylo připraveno přidáním 2 procent Bacto agaru do kapalného média YPD42.

Vliv EPS na růst kvasinek. Exponenciálně rostoucí kultura kvasnic divokého typu (WT) (přibližně 1× 104 buňky) byla ošetřena různými koncentracemi (0–400 ug/ml) EPS v mikrotitrační destičce a konečný objem byl upraven na 200 μl s YPD bujónem. Te kultura byla inkubována po dobu 18 hodin při 30 stupních s následným sériovým ředěním a nanesením na YPD agarové plotny. Destičky Te byly inkubovány při 30 stupních po dobu 2 dnů a byly spočítány jednotky tvořící kolonie (CFU) a životaschopnost byla vyjádřena jako procento CFU43.

Měření biomarkerů oxidačního stresu. Exponenciálně rostoucí kvasinkové buňky WT byly předem ošetřeny s nebo bez 300 ug/ml EPS po dobu 2 hodin. Deset buněk bylo vystaveno 1 mM H2O2 po dobu 1 hodiny při 30 stupních v třepacím inkubátoru a zpracovány pro měření aktivity SOD a hladin peroxidace lipidů podle metody popsané v dřívějších zprávách44–46

Antioxidační vlastnost EPS u mutantů s delecí genu S. cerevisiae.

Exponenciálně rostoucí kultury kvasinkových WT a mutantních kmenů s deficitem antioxidantů (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆, ctt1∆, glr1∆ a yhb1∆) byly ošetřeny 300 ug/ml EPS po dobu 2 hodin 1 mM H202 po dobu 1 hodiny. Sériově zředěné buňky byly rozetřeny na YPD agarové plotny, inkubovány po dobu 2 dnů při 30 stupních a byla vypočtena životaschopnost. Pro bodový test byly kultury sériově zředěny 10-krát, z nichž 4 μl byly naneseny na agarové plotny YPD a inkubovány při 30 stupních po dobu 2 dnů a vyfotografovány43,47. Detekce a měření ROS. Exponenciálně rostoucí WT a mutantní kmeny s deficitem antioxidantů (sod1∆, sod2∆, tsa1∆, cta1∆ a ctt1∆) byly předem ošetřeny s nebo bez EPS po dobu 2 hodin a vystaveny 1 mM H2O2 po dobu 1 hodiny při 30 stupních. Buněčné pelety po centrifugaci při 5000 ot./min po dobu 5 minut byly dvakrát promyty pufrem PBS, resuspendovány ve 200 μl PBS a inkubovány s 20 μM DCF-DA ve tmě po dobu 15–20 minut při pokojové teplotě. Ihned po inkubaci byly buňky dvakrát promyty PBS, upevněny na sklíčka a pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem Olympus Ix71 pod objektivem 40x s použitím modrého filtru. Pro kvantifikaci ROS byly buňky obarvené DCF DA po promytí resuspendovány ve 200 μl PBS a intenzita fluorescence DCF byla měřena pomocí spektrofluorometru při vlnových délkách excitace a emise 495/529 nm. Fluorescenční jednotky byly vyneseny proti každé ošetřené a neošetřené kultuře a porovnány48,49.

Antiapoptotická aktivita galaktanu.

Bodové a CFU testy. Exponenciálně pěstované WT a anti-apop totické mutantní buňky (pep4∆ a fs1∆) byly předem ošetřeny EPS a inkubovány spolu s příslušnými neošetřenými kontrolami po dobu 2 hodin. Pro počty CFU byly kultury ošetřeny nebo neošetřeny EPS po dobu 2 hodin a inkubovány s 0,5 mM H202 po dobu 1 hodiny. Každá sériově zředěná kultura byla nanesena na YPD agarové plotny a inkubována při 30 stupních po dobu 2 dnů a životaschopnost buněk byla reprezentována jako procento CFU. Pro bodový test byly kultury ponechány pro sériové ředění, po kterém následovalo nanesení na agarové plotny YPD s nebo bez 1 mM H202. Destičky byly inkubovány při 30 stupních po dobu 2 dnů a vyfotografovány47.

Detekce antiapoptotického markeru EPS

pomocí kvasinkových mutantních kmenů. Pro další potvrzení záchranného účinku EPS na kvasinkové buňky před apoptotickou buněčnou smrtí indukovanou peroxidem vodíku v kvasinkách byly WT a antiapoptoticky deficitní mutantní kmeny (pep4∆ a fs1∆) zkoumány na markery apoptózy. Exponenciálně rostoucí buňky WT, pep4∆ a fs1∆ byly ošetřeny nebo neošetřeny 300 ug/ml EPS po dobu 2 hodin a poté byly vystaveny 1 mM H2O2 po dobu 1 hodiny. Jak ošetřené, tak neošetřené buňky byly obarveny akridinovou oranží a ethidium bromidem (AO/EB) a pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem na kondenzaci chromatinu50,51. Pro barvení DAPI byly ošetřené a neošetřené buňky fixovány 4% paraformaldehydem a inkubovány s 1 ug/ml DAPI po dobu 5–10 minut ve tmě při pokojové teplotě. Buňky byly upevněny na sklíčka po promytí PBS a pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem Olympus IX71 (UV filtr, objektiv 40x) na fragmentaci jádra52,53.

Účinek EPS proti stárnutí pomocí chronologického testu životnosti.

Kultury kvasinek divokého typu a mutant s deficitem antioxidantů (sod2∆, tsa1∆ a ctt1∆) byly pěstovány, aby dosáhly stacionární fáze a inkubovány s nebo bez EPS pro stanovení chronologické životnosti (CLS). Přežití každého kmene bylo vypočteno v různých časových intervalech od 0 do 30 dnů. Životaschopnost buněk byla vyjádřena jako procento CFU pro ošetřené i neošetřené kultury54,55. Statistická analýza. Všechny experimenty byly provedeny v triplikátech (±SD) a statisticky analyzovány pomocí softwaru IBM SPSS 20 v jednocestném modelu ANOVA. Tukeyho srovnávací test HSD (str<0.05) was used to measure the significance level. 

Výsledky a diskuse Bakterie mléčného kvašení (LAB) izolované z fermentovaných potravin vzbudily v posledních letech obrovskou pozornost potravinářských technologů kvůli jejich prokázaným probiotickým vlastnostem. Mezi bakterie izolované z indických fermentovaných potravin patří Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Leuconostoc spp. a méně prozkoumané Weisella spp. Stejně jako ostatní prospěšné LAB, kmen Cistanche KR780676, který byl izolován z fermentovaného těsta idli v naší laboratoři, působí jako potenciální probiotický kandidát39. Dřívější zprávy byl tento galaktan charakterizován jako lineární homopolysacharid a také testován na jeho fyzikálně-chemické, funkční a emulgační vlastnosti38,56–58. Také jsme uvedli, že buňky a buněčné supernatanty W. confusa KR780676 vykazovaly silnou antioxidační aktivitu39. Produkce EPS z W. confusa KR780676 byla pozorována na MRS agarové plotně obohacené 2 procenty sacharózy, inkubované po dobu 48 hodin (obr. 1A-i), což odhalilo slizké kolonie Weissella a bylo to dále potvrzeno na snímku SEM (kolonie Weissella). ukazující přítomnost galaktanového EPS spolu s buňkami (obr. 1A-ii). Přehled výroby EPS krok za krokem je znázorněn na obr. 1B.

Antioxidační vlastnosti galaktanu EPS in vitro. Jak je znázorněno na obr. 2A, aktivita zachycování DPPH je pozorována jako závislá na koncentraci, vychytávací aktivita se zvyšuje s koncentrací galaktanu. Polovina maximální účinné koncentrace (IC50) kyseliny askorbové byla 8,8 ug/ml, zatímco galaktanový EPS byl 450 ug/ml. 1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl (DPPH) je stabilní volný radikál, který delokalizuje nepárové elektrony proti molekule jako celku, čímž zabraňuje dimerizaci molekul a vede k tmavě fialové barvě59. Když se roztok DPPH přidá k různým koncentracím (50 až 500 µg/ml) galaktanu, způsobí to snížení fialové barvy, když se koncentrace zvýší. Antioxidanty při reakci s elektronem DPPH se tmavě fialová barva DPPH změní na světle fialovou; a intenzita barvy závisí na antioxidační aktivitě substrátu60. Galactan prokázal 60% potenciál vychytávání DPPH, který je vyšší než EPS z endofytické bakterie Paenibacillus polymyxa EJS-3 (<45.40%)33.

Oxid dusnatý vzniká, když se nitroprusid sodný rozkládá ve vodném roztoku při pH 7,2. Dusičnany a dusitany vznikají za aerobních podmínek, kdy se oxid dusnatý váže s kyslíkem61. Jak je znázorněno na obr. 2B, galaktan má potenciál snižovat tvorbu oxidu dusnatého z nitroprusidu sodného, ​​protože polovina maximální účinné koncentrace (IC50) je 138 ug/ml, zatímco standardní kyselina askorbová byla 11 ug/ml. Jak je znázorněno na obr. 2C, redukční energetická aktivita EPS pozitivně koreluje s jeho koncentrací v rostoucím pořadí. Standard (kyselina askorbová) vykazoval vyšší redukční kapacitu než galaktan EPS, což bylo v souladu s Ye et al.9. Snižující energetická aktivita galaktanu ukazuje na potenciální antioxidační aktivitu. Když je do galaktanového EPS přidán ferrikyanid draselný [K3Fe (CN)6], antioxidanty v něm přítomné se redukují na ferrikyanid draselný [K4Fe(CN)6]

Obrázek 2. Antioxidační vlastnosti galaktanu in vitro. (A) Aktivita vychytávání DPPH radikálů, (B) Stanovení oxidu dusnatého, (C) Stanovení redukční síly a (D) Aktivita vychytávání hydroxylových radikálů galaktanového EPS.

Aktivita galaktanu pohlcující hydroxylové radikály je znázorněna na obr. 2D. Galactan vykazoval 41,93 procenta jako nejvyšší aktivitu, zatímco 58,10 procent podle standardu při stejné koncentraci (1 mg/ml). Trend výsledků je v souladu s předchozími zprávami pro EPS z Lactobacillus plantarum C88 (85,21 procenta pro koncentraci 4 mg/ml EPS)62 a Paenibacillus polymyxa EJS-3 (68,55 procenta pro koncentraci 1 mg/ml EPS)63. V porovnání se standardy vykázal galaktan účinnost 72,16 procent, zatímco EPS z Lactobacillus plantarum C8862 a Paenibacillus polymyxa EJS-363 vykázal 95,19 a 68,55 procenta.

Antioxidační vlastnosti galaktanového EPS in vivo na kvasinkovém modelu. Dřívější zprávy ukázaly různé biologické vlastnosti podporující zdraví, jako jsou antiproliferativní, protivředové, cholesterol snižující, antioxidační, protizánětlivé a imunomodulační aktivity EPS odvozené od LAB64. Z tohoto pohledu je důležité podrobně vyhodnotit antioxidační účinek EPS, který by mohl podpořit jejich prebiotický a/nebo probiotický potenciál, zejména k udržení střevní homeostázy zmírněním oxidačního stresu. Buněčný antioxidační aparát hraje klíčovou roli při zmírňování nevyhnutelných ROS generovaných prostřednictvím klíčových buněčných metabolických drah. Nerovnováha mezi vrozenou antioxidační obranou buňky a generovaným ROS může být pro buňky velmi škodlivá. Silný oxidační stres způsobuje potenciální poškození buněčných životně důležitých složek, proteinů, nukleových kyselin a molekul lipidů, což následně ovlivňuje mnoho základních signálních drah a vyvolává apoptózu. Bylo prokázáno, že dietní příjem antioxidantů snižuje frekvenci markerů poškození buněk, jako jsou hladiny ROS, poškození DNA zprostředkované ROS, apoptóza a buněčná transformace, což dále vede ke snížení výskytu poruch souvisejících s věkem65 Mikrobiální EPS jako xanthan a levany prokázaly antioxidační aktivitu v in vitro testech (DPPH a testy na hydroxylových radikálech)5 a proti buňkám lidského karcinomu žaludku BGC-823, v tomto pořadí66. Dříve jsme v této studii hodnotili antioxidační, antiapoptotické a antiagingové účinky vyvíjené galaktanovým EPS izolovaným z W. confusa KR780676 pomocí kvasinky Saccharomyces cerevisiae BY4741 jako modelového organismu.

Vliv EPS na růst kvasinek. Buňky kvasinek divokého typu ošetřené různými koncentracemi EPS nevykazovaly žádné růstové defekty, což potvrzuje, že galaktan neindukoval žádnou cytotoxicitu ani růstové defekty v žádné z koncentrací v rozmezí od 0 do 400 ug/ml (obr. 3A ). Buňky ošetřené 300 ug/ml nebo vyšší koncentrací galaktanu vykazovaly významně vyšší růst, což ukazuje, že galaktan měl aktivitu stimulující růst kvasinek.

Pro následné experimenty s kvasinkovými kmeny se používá koncentrace galaktanu 300 ug/ml. Galactan snižuje aktivitu enzymu SOD. Po silné in vitro antioxidační aktivitě galaktanového EPS bylo dále podrobeno kontrole jeho účinku na aktivitu SOD v kvasinkových WT buňkách. Naše výsledky (obr. 3B) ukazují, že oxidační stres vyvolaný působením H2O2 způsobil prudké zvýšení aktivity SOD buněk WT ošetřených H2O2- ve srovnání s buňkami neošetřenými. Na rozdíl od toho předběžné ošetření buněk WT galaktanem následované expozicí H2O2 vedlo k dvojnásobnému snížení aktivity SOD ve srovnání s aktivitou buněk ošetřených samotnou H2O2, což ukazuje, že galaktan pomáhá kvasinkovým buňkám při zvládání oxidativních látek vyvolaných superoxidovými radikály. stres47,67.

Oxidační stresindukovaný působením peroxidu aktivuje enzym superoxid a změna úrovně aktivity SOD je přímým měřítkem úrovně buněčného oxidačního stresu. V této studii byla použita metoda redukce NBT, kde je NBT indikátorem produkce superoxidových radikálů. Inhibice redukce NBT je přímým měřítkem SOD. Protože SOD soutěží s NBT o superoxidové radikály generované vystavením riboflavinu viditelnému světlu v přítomnosti kyslíku a methioninu, který je donorem elektronů. Superoxid redukuje NBT na modrý produkt, formazan, který lze kolorimetricky měřit při 560 nm.

Předchozí zprávy naznačují, že LAB EPS má antioxidační účinek v závislosti na koncentraci v in vitro testech a v buněčných liniích rakoviny tlustého střeva a in vivo modelech. Schopnost EPS vychytávat ROS lze připsat jejich různým chemickým skupinám68. Ukázalo se, že další EPS (500 µg/ml) z Bacillus amyl liquefacient výrazně ovlivňují aktivitu SOD a chrání buňky HepG2 před oxidačním stresem vyvolaným H2O2 68. Podobně EPS z L. plantarum ukázal na koncentraci závislý účinek na aktivitu SOD v buňkách Caco2 proti oxidativnímu stresu vyvolanému H2O2-69. Naše výsledky v souladu s těmito zprávami ukazují, že předběžné ošetření galaktanem EPS zachycuje superoxidové radikály indukované působením H2O2 v kvasinkových WT buňkách.

EPS snižuje peroxidaci buněčných lipidů. Malondialdehyd (MDA) je nejstudovanějším biomarkerem buněčné peroxidace lipidů, který indikuje úroveň oxidačního stresu. MDA je chemicky stabilní, vysoce reaktivní dialdehyd a může se snadno vázat na proteiny, nukleové kyseliny a lipoproteiny. Je vysoce mutagenní a může výrazně ovlivnit biochemické vlastnosti těchto biomolekul, což je škodlivé pro různé signální dráhy70. Zvýšení hladin MDA je indikátorem poškození tkáně vyvolaného ROS a jeho zvýšené hladiny jsou detekovány u několika lidských patologií46. V této studii, aby se zjistilo, jak předběžné ošetření EPS ovlivňuje peroxidaci lipidů indukovanou H2O2 v kvasinkových buňkách WT, byly odhadnuty hladiny MDA. Výsledky ukázaly přibližně 1,{7}}násobné snížení hladiny MDA v buňkách předem ošetřených EPS ve srovnání s těmi, které byly vystaveny samotné H202, jak je znázorněno na Obr. 3C.

Dříve bylo prokázáno, že EPS z L. plantarum C88 snižuje hladiny MDA vyvolané léčbou H2O2 způsobem závislým na dávce (50–200 ug/ml) v buňkách Caco2, což ukazuje, že poškození membrán střevních buněk způsobené peroxidem lze zmírnit doplněním EPS69 (zhang 2013). Dále, 500 ug/ml EPS z B. amyloliquefaciens významně snížilo H2O2-indukovanou MDA v buňkách HepG271. Naše výsledky H2O2-indukovaných hladin MDA v kvasinkových buňkách a její významné snížení po předběžném ošetření buněk galaktanovým EPS naznačují, že ošetření galaktanovým EPS snižuje buněčnou ROS-indukovanou lipidovou peroxidaci a naopak může chránit buňky před poškozením tkání způsobeným peroxidovými radikály a pomáhají udržovat buněčnou integritu

experimenty. *představuje P<0.0001 a signifcant increase/decrease in EPS+ H2O2 treated samples compared to those treated with H2O2 alone.

Galactan chrání kvasinkové antioxidační genové mutanty při oxidativním stresu. Aby bylo možné vyhodnotit antioxidační schopnost galaktanu, byly různé kvasinkové mutanty s deficitem antioxidačního genu (kterým chybí různé geny reakce na oxidační stres) ošetřeny galaktanem a poté vystaveny subletální dávce H2O2 42. Mutanty SOD (sod1∆ a sod2∆), katalázy (cta1∆ a ctt1∆), thioredoxin peroxidázy (tsa1∆), glutathionreduktázy (glr1∆) a oxidoreduktázy oxidu dusnatého (yhb1∆) při působení H2O2. vykazovala nízké přežití (sod1∆ 10,8 procenta, sod2∆ 13,17 procenta, tsa1∆ 13,55 procenta, cta1∆ 15,34 procenta, ctt1∆ 17,06 procenta, glr1∆ 27,31 procenta) proti W8yhb31 procenta a W.T8 Naproti tomu s předúpravou galaktanem se u všech mutantů s deficitem antioxidačních genů zvýšila tolerance vůči oxidativnímu stresu a výrazně se zvýšila jejich životaschopnost (sod1∆ 78,43 procent, sod2∆ 59,96 procent, cta1∆ 87 procent, ctt1∆ 87 procent, tsa ∆ 72,73 procent, glr1∆ 75,26 procent a yhb1∆ 82,41 procent), jak je znázorněno na obr. 4A. Tyto výsledky naznačují, že galaktan může účinně vychytávat volné radikály indukované H2O2 u mutantů postrádajících specifické geny reakce na oxidační stres a chrání buňky před oxidativním stresem. Podobná ochrana byla pozorována ve spotovém testu, kde galaktan zachránil mutanty před oxidačním stresem a zvýšil životaschopnost, jak je ukázáno na obr. 4B.

Buňky se vyvíjejí s enzymatickými antioxidačními obrannými systémy, aby vydržely endogenní oxidační stres způsobený ROS generovaným různými fyziologickými reakcemi, které by jinak měly škodlivé účinky na blaho buňky. Předchozí zprávy a naše výsledky v této studii naznačují, že EPS jsou schopny vychytat ROS a zlepšit životaschopnost buněk. Naše výsledky s kvasinkovými mutantními kmeny odpovědí na oxidační stres naznačují, že léčba galaktanem EPS vychytává jak cytosolické, tak mitochondriální superoxidové radikály indukované působením H2O2, jak dokazuje zvýšená životaschopnost kvasinkových mutantních kmenů sod1∆ a sod2∆. SOD jsou primární enzymatické antioxidační obrany v buňkách proti endogennímu a exogennímu oxidativnímu stresu a mutace v těchto genech se podílejí na rakovině a degenerativních poruchách. Podobně antioxidační záchrana cta1∆ a ctt1∆ (katalázové mutanty) ošetřením EPS ukazuje, že ošetření galaktanem EPS poskytuje ochranu proti peroxizomálnímu a cytosolickému oxidačnímu stresu vyvolanému H2O2. Kataláza je zodpovědná za buněčnou detoxikaci peroxidu vodíku a její nedostatek je spojen s nástupem poruch souvisejících s věkem. TSA1, thioredoxin peroxidáza je jak ribozomálně asociovaný, tak volný cytoplazmatický protein, který zbavuje buňky stresu peroxidem vodíku. Zprávy naznačují, že TSA1 má také roli při oxidativní opravě poškození DNA. Naše výsledky naznačují, že ošetření EPS zachraňuje kvasinkové tsa1∆ buňky před stresem vyvolaným peroxidem. Savčí peroxiredoxiny mají pozitivní vliv na buněčný růst, metabolismus a imunitní funkce. Jejich nedostatek má za následek zvýšený buněčný oxidační stres, který ovlivňuje klíčové signální dráhy a podílí se na neurodegenerativních poruchách, maligních a zánětlivých onemocněních 72. Glutathionový antioxidační mechanismus je další enzymatický antioxidační obranný systém první linie přítomný v buňkách k překonání oxidačního stresu. GLR1 je kvasinkový homolog savčí glutathionreduktázy, lokalizovaný jak v cytosolu, tak v mitochondriích73. Glr redukuje oxidovaný glutathion (GSSH) na redukovaný glutathion (GSH) a hraje roli při udržování hladin GSH v buňkách, což zase detoxikuje superoxidové a hydroxidové radikály, čímž chrání buňky před oxidačním stresem74. Naše výsledky ukazují vysokou citlivost kvasinek glr1∆ na H2O2, která byla zmírněna předúpravou galaktanem EPS, což naznačuje, že galaktan EPS může chránit buňky, které postrádají GLR1, před oxidačním stresem. Je zajímavé, že nedostatek glutathionreduktázy se podílí na stárnutí a metabolických, degenerativních a kardiovaskulárních poruchách souvisejících s věkem75,76. Jak je znázorněno na obr. 4A, yhb1∆ byl také chráněn galaktanovým EPS proti stresu H2O2, což naznačuje, že galaktanový EPS chrání buňky, které mají nedostatek YHB1, před oxidačním stresem. Kvasinky YHB1 jsou oblíbeným hemoglobinem, o kterém se uvádí, že chrání buňky před stresem způsobeným oxidem dusnatým77 a oxidačním stresem78. Důkazy naznačují, že lidský homolog YHB1 zřejmě zachraňuje buňky před toxicitou alfa-synukleinu, což je biomarker Parkinsonovy choroby79. Tato předchozí zjištění a naše výsledky naznačují, že EPS může podporovat přežití buněk proti rozvoji degenerativních poruch.

Pro posouzení hladiny ROS v kvasinkových mutantech s přítomností a nepřítomností galaktanu při stresu H2O2 byly kvasinkové buňky pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem a hladina intracelulární oxidace byla vypočtena pomocí spektrofluorometru47,48. Kvasinkové mutanty ošetřené samotnou H202 vykazovaly více zeleně fluoreskujících buněk ve srovnání s těmi, které byly předem ošetřeny galaktanem. (Obr. 4C). Intenzita fluorescence DCF se zvýšila přibližně o 60 procent, zatímco při předběžném ošetření galaktanem se snížila na přibližně 30 procent u kvasinkových mutantů ošetřených H2O2- ve srovnání s WT a příslušnou kontrolou (obr. 4D). Mikroskopické i spektrofotometrické výsledky naznačují zvýšenou hladinu ROS v buňkách, které postrádají specifické antioxidační geny ve srovnání s příslušnými kontrolami. Kultury předem ošetřené galaktanem a poté vystavené H2O2 vykazovaly sníženou fluorescenci ve srovnání s kulturami bez předchozího ošetření galaktanem, což naznačuje, že galaktan snižoval expozici H2O2 indukci ROS v kvasinkových mutantních buňkách a podporuje přežití buněk. Ve všech výše uvedených experimentech, když byly buňky promyty před přidáním H202, nevykazovaly žádnou významnou záchranu (doplňková data), což naznačuje, že vychytávání ROS galaktanem je způsobeno přímým zachycováním v médiu spíše než intracelulárním působením.