Neuroprotektivní potenciál izothiokyanátů v modelu neuroinfamace in vitro

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Přijato: 10. července 2020 / Přijato: 25. října 2020 / Zveřejněno online: 16. listopadu 2020

© Autor(i) 2020

Funkce bylinného prášku Cistanche: má velmi dobrýneuroprotektivní účinek

Abstraktní

Isothiokyanáty (ITC), přítomné jako glukosinolátové prekurzory v brukvovité zelenině, ukázalyprotizánětlivéantioxidační a antikarcinogenní účinky. Zde jsme porovnávali účinky tří různých ITC na produkci ROS a na expresi matrix metaloproteinázy (MMP)-2 a -9, které představují důležité patogenetické faktory různých neurologických onemocnění. Primární kultury krysích astrocytů byly aktivovány LPS a současně ošetřeny různými dávkami allyl isothiokyanátu (AITC), 2-fenethyl isothiokyanátu (PEITC) a 2-sulforafanu (SFN). Výsledky ukázaly, že SFN a PEITC byly schopny působit proti produkci ROS indukované H2O2. Zymografická analýza supernatantů buněčných kultur prokázala, že PEITC a SFN byly nejúčinnějšími inhibitory MMP-9, zatímco pouze SFN významně inhiboval aktivitu MMP-2. PCR analýza ukázala, že všechny použité ITC významně inhibovaly expresi MMP-2 i MMP-9. Výzkum signální dráhy mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) prokázal, že ITC modulují transkripci MMP inhibicí aktivity extracelulárně regulované proteinkinázy (ERK). Výsledky této studie naznačují, že ITC by mohly být slibnými nutraceutickými činidly pro prevenci a doplňkovou léčbu neurologických onemocnění spojených s účastí MMP.

Klíčová slovaAntioxidant · Protizánětlivý · Isothiokyanát · Matrixové metaloproteinázy · Neurodegenerativní onemocnění

Úvod

Neurozánět je komplexní reakce na poranění mozku zahrnující kaskádu biochemických dějů vedoucích k aktivaci rezidentních buněk centrálního nervového systému (CNS). Aberantní aktivace astrocytů ohrožuje jejich neuroprotektivní roli, což vede k uvolňování zánětlivých mediátorů, jako jsou reaktivní formy kyslíku (ROS), oxid dusnatý (NO), cytokiny, chemokiny a matrixové metaloproteinázy.

(MMP).

MMP jsou velkou rodinou neutrálních endopeptidáz závislých na Zn2 plus, které mají jako hlavní cíle složky extracelulární matrix (ECM), jako je fibronektin, kolagen, elastin a laminin (Latronico a Liuzzi 2017).

Tiziana Latronicová

tiziana.latronico@uniba.it

Katedra biologických věd, biotechnologií a biofarmaceutiky, Univerzita v Bari"Aldo Moro",

Bari, Itálie

Ústav věd, University of Basilicata, Potenza,

Itálie

V CNS se MMP účastní různých fyziologických reakcí, jako je morfogeneze, obrat a remodelace ECM, embryogeneze a hojení ran; když však MMP uniknou regulačním mechanismům, stanou se škodlivými (Rosenberg 2009; Agrawal et al. 2008).

V tomto ohledu je známo, že změny v expresi a aktivitě MMP jsou klíčovými patogenetickými událostmi u několika neurologických poruch (Latronico a Liuzzi 2017; Mastroianni a Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). Experimentální důkazy naznačují, že mezi MMP se na neurozánětu podílejí zejména gelatinázy A (MMP-2) a B (MMP-9), protože jejich upregulace může ohrozit integritu hematoencefalické bariéry (BBB). To vede ke zvýšenému náboru a infiltraci imunitních buněk periferní krve do mozkového parenchymu, čímž se udržuje zánětlivý proces, který je příčinou progresivního úbytku neuronů a zhoršené neuronální funkce (Rivest 2009). Několik studií in vitro a in vivo ukázalo, že produkce ROS je jedním z faktorů podílejících se na upregulaci exprese MMP-9 v mozkových buňkách prostřednictvím mechanismů závislých na signální dráze mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) (Hsieh a Yang 2013).

Na základě těchto důkazů je jasné, že downregulace neurotoxických faktorů, vedoucí ke snížení neurozánětlivých reakcí, může představovat účinnou terapeutickou strategii k prevenci vzniku nebo zmírnění progrese mozkových onemocnění.

V posledních letech se biomedicínský zájem v neurologické oblasti stále více zaměřuje na výzkum přírodních sloučenin schopných modulovat procesy spojené s neurozánětlivými odpověďmi. V tomto ohledu několik studií ukázalo, že fytochemické sloučeniny, jako jsou polyfenoly, isothiokyanáty (ITC) a další, mají neuroprotektivní potenciál, který se také odvíjí od jejich schopnosti inhibovat expresi MMP a působit proti produkci ROS (Dinková-Kostova a Kostov 2012, Liuzzi a kol., 2007, 2011).

Isothiokyanáty jsou metabolity produkované několika rostlinami patřícími do čeledí Brassicaceae jako systém obrany proti napadení patogeny (Bones a Rossiter 2006). Vznikají enzymatickou degradací glukosinolátů (GSL) enzymem myrosinázou. ITC jsou přítomny v běžně konzumované brukvovité zelenině, jako je brokolice, růžičková kapusta, zelí, tuřín, křen, kedlubna, hořčice, ředkev, řeřicha a kapusta. Jejich množství v potravinách je velmi proměnlivé a závislé na zpracování a přípravě potravin.

Nedávno se ukázalo, že ITC mají řadu terapeutických účinků, včetně antioxidačních, antibakteriálních, protizánětlivých a chemopreventivních účinků (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

Ochranná aktivita ITC se provádí prostřednictvím modulace různých signálních drah zapojených do detoxikace, zánětu, apoptózy a regulace buněčného cyklu. Několik důkazů naznačuje, že antikarcinogenní a protizánětlivé vlastnosti ITC lze připsat především jejich schopnosti aktivovat dráhu nukleárního faktoru erytroidního 2-faktoru 2 (Nrf2). Nrf2 je redox-senzitivní transkripční faktor, který se v přítomnosti elektrofilních činidel a podmínek oxidativního stresu translokuje do jádra, kde váže prvky antioxidační odezvy (ARE), indukuje expresi cytoprotektivních genů zapojených do detoxikace a modulace oxidačních podmínek a zánětlivé procesy (Heiss et al 2001). V tomto ohledu bylo publikováno, že ITC jsou schopny zvýšit antioxidační kapacitu lidských buněk indukcí exprese detoxikačních enzymů fáze II a up-regulací produkce GSH (Wagner et al 2010). Dále byla hlášena existence křížové komunikace mezi Nrf2 a dráhou nukleárního faktoru (NF)-κB, která vede k modulaci zánětu (Sturm a Wagner 2017; Lee a Johnson 2004). V tomto ohledu různé experimentální in vitro a in vivo modely neurozánětu prokázaly, že ITC jsou schopny významně snížit translokaci NF-κB s následnou inhibicí prozánětlivých cytokinů a MMP (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

V tomto dokumentu jsme zkoumali účinek tří ITC, tj. allyl isothiokyanátu (AITC), 2-fenethyl isothiokyanátu (PEITC) a 2-sulforafanu (SFN) na uvolňování MMP-2 a -9 a také na produkci ROS astrocyty aktivovanými LPS. Naše výsledky prokázaly, že PEITC, SFN a AITC jsou schopny in vitro inhibovat expresi MMP-9 a MMP-2 v astrocytech aktivovaných LPS a působit proti produkci ROS indukované H2O2. Kromě toho jsme prokázali, že ITC modulují nadměrnou expresi MMP mechanismy souvisejícími s inhibicí aktivity extracelulárně regulované proteinkinázy (ERK). Tyto výsledky naznačují, že strava bohatá na brukvovitou zeleninu může mít potenciální přínos pro prevenci a doplňkovou léčbu neurologických onemocnění.

Materiály a metody

Chemikálie a činidla

Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM), fetální bovinní sérum (FBS), penicilin a streptomycin poskytla společnost GIBCO (Paisley, Skotsko). Želatina, DNáza 1, poly-L-lysin

(PLL), trypsin, lipopolysacharid (LPS), trypanová modř a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-difenyltetrazoliumbromid (MTT ), allyl isothiokyanát (AITC) [cod. 377 430, čistota 95 procent (HPLC)], 2-fenethylisothiokyanát (PEITC) [cod. 253 731, čistota 99 procent)], 2-sulforafan (SFN) [cod. S6317, čistota větší nebo rovna 95 procentům (HPLC)] byly poskytnuty od Sigma (St. Louis, MO, USA). 2',7'-dichlorfluorescein diacetát (DCFH-DA) byl zakoupen od Calbiochem. Standardní proteiny a R-250 Coomassie Brilliant Blue byly od Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Protilátky proti gliálnímu fibrilárnímu kyselému proteinu (GFAP) (RRID: AB_2294571) byly zakoupeny od společnosti Serotec (Oxford, UK). Protilátky proti extracelulárně regulovaným proteinkinázám (ERK) 1/2 a fosforylované ERK 1/2 (p-ERK 1/2) byly od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Hybond-P PVDF membrány, zesílená chemiluminiscence (ECL) Western blotting Analysis System a anti-myší-HRP sekundární protilátka byly od GE

Healthcare Life Sciences (Little Chalfont, Buckinghamshire,

Spojené království). Páry primerů specifické pro MMP-2, MMP-9 a 18S rRNA byly od Sigma Genosys (Cambs, UK). RNeasy mini kit a QuantiTect Reverse Transscription kit byly zakoupeny od Qiagen (Valencia, CA, USA). Reagencie Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix pro PCR byly zakoupeny od Lucigen Corporation (Middleton, WI, USA).

Etické prohlášení

Pokusy se zvířaty byly provedeny v souladu s doporučeními v NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals a se souhlasem Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Bari, Italy (Číslo povolení: 23-98- A).

Příprava kultur astrocytů

Astrocyty byly připraveny z neokortikálních tkání {{0}}denních potkanů ​​Wistar (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Itálie). Pro přípravu astrocytů bylo použito 6 vrhů po 12 mláďatech obou pohlaví. Zvířata byla usmrcena vystavením oxidu uhličitému (CO2) a usmrcena rychlou dekapitací. Neokortikální tkáně byly vypreparovány a použity pro purifikaci primárních gliových buněčných kultur podle metody popsané Latronico et al. (2018). Stručně, po pitvě byly mozky krys zbaveny mozkových plen a krevních cév, mechanicky rozemlety a natráveny 0,25 procenta trypsinu v přítomnosti 0,01 procenta DNázy. Po odstředění a posouzení životaschopnosti buněk byly buňky umístěny do baněk potažených PLL (75 cm2) v hustotě 1,5 x 107 buněk/lahev v DMEM, 10 procent FBS, 100 IU ml -1 penicilin, 100 ug ml -1 streptomycin a udržována na 37 stupních v 5 procentech CO2. Po 7 dnech byly baňky třepány, aby se odstranily oligodendrocyty a mikroglie. Čistota astrocytů, získaných trypsinizací (0,25 procent trypsin/0,02 procent EDTA), byla hodnocena imunobarvením na GFAP.

Léčba astrocytů aktivovaných LPS allyl isothiokyanátem, fenethyl isothiokyanátem nebo 2-sulforafanem

Konfluentní astrocyty, nasazené na 96 jamkové destičky, byly stimulovány 10 µg ml -1 LPS a současně ošetřeny různými koncentracemi allyl isothiokyanátu (AITC), 2-fenethyl isothiokyanátu (PEITC) nebo 2-sulforafanu (SFN) v DMEM bez séra. Astrocyty v bezsérovém DMEM a astrocytech aktivovaných LPS představovaly negativní a pozitivní kontroly, v daném pořadí. Kromě toho, protože zásobní roztoky AITC (100 uM), PEITC (67 uM) a SFN (56,4 uM) byly vyrobeny v DMSO, křivka dávka-odezva na DMSO, zředěný v kultivačním médiu při stejné koncentraci rozpouštědla přítomné v analyzovaných vzorků, byla provedena pro odhad toxicity sloučeniny. Po 20 hodinách inkubace při 37 stupních, 5 procentech CO2 byly supernatanty shromážděny a skladovány při -20 stupních až do použití, zatímco buňky byly podrobeny testu MTT k posouzení životaschopnosti buněk.

Test životaschopnosti buněk MTT

Cytotoxicita AITC, PEITC a SFN na astrocytech byla detekována pomocí MTT [{{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,{{5 }}difenyltetrazoliumbromid]. Tento test je založen na redukci MTT mitochondriální sukcinátdehydrogenázou v životaschopných buňkách na nerozpustný modrý formazanový produkt, který lze spektrofotometricky měřit. Stručně řečeno, po ošetření po dobu 20 hodin s AITC, PEITC nebo SFN bylo kultivační médium odstraněno a buňky byly naplněny 0,5 mg ml-1 MTT. Po inkubaci po dobu 2 hodin při 37 stupních bylo odstraněno 5% médium C02 a krystaly formazanu v buňkách byly solubilizovány 90% ethanolem. Po protřepávání destiček po dobu 15 minut, aby se dosáhlo úplné solubilizace krystalů, bylo množství formazanového produktu stanoveno optickou absorbancí při 560 nm s referenční vlnovou délkou 690 nm. Životaschopnost buněk byla vyjádřena jako procento kontroly (CTRL), reprezentované neošetřenými buňkami, které bylo nastaveno na 100 procent. Pro každou sloučeninu byla získána křivka závislosti buněčné životaschopnosti na dávce.

Detekce reaktivních forem kyslíku

Detekce reaktivních forem kyslíku (ROS) byla provedena nanesením astrocytů 10 μM 2',7'-dichlorofluorescein diacetátu (DCFH-DA) v DMEM bez fenolové červeně při 37 stupních po dobu 30 minut. Poté byl z jamek odstraněn DCFH-DA a buňky byly ošetřeny po dobu 1 hodiny pomocí AITC (400 μM), PEITC (10 μM) nebo SFN (25 μM) v DMEM bez fenolové červeně v přítomnosti H2O2 v konečné koncentraci 100 μM . Buňky ošetřené pouze DCFH-DA nebo H2O2 představovaly negativní (CTRL) a pozitivní kontroly (H2O2), v daném pořadí. Po inkubaci byly buňky promyty PBS a lyžovány

Tris-HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0,5 procenta, pH 7,5,

poté se odstřeďuje při 10,000×g, 4 stupních po dobu 10 minut. Supernatanty byly shromážděny a jejich spektrofluorimetrická analýza byla provedena při 525 nm za excitace při 485 nm. Výsledky byly normalizovány na celkový obsah proteinu a produkce ROS byla vyjádřena jako relativní procento intenzity fotoluminiscence (PL) oproti pozitivní kontrole.

Detekce želatináz

Gelatinázová aktivita v buněčných supernatantech (SN) byla detekována zymografickou analýzou, jak uvádí Latronico et al. (2013). Stručně, množství SN, odpovídající přibližně 10 ug celkových proteinů, bylo solubilizováno pomocí 30 ul Laemmliho vzorkového pufru bez -merkaptoethanolu. Vzorky byly analyzovány v 7,5% polyakrylamidovém gelu kopolymerizovaném s 0,1% (hmotn./obj.) želatinou. Po elektroforetickém běhu byly gely dvakrát promyty 2,5% Triton X-100/10mM CaCl2 v 50mM Tris-HCl, pH 7,4 a inkubovány po dobu 24 hodin při 37 stupních v 1% Tritonu X-100 /50 mM Tris-HCl/10 mM CaCl2, pH 7,4. Gely byly obarveny Coomassie brilantní modří R-250 a odbarveny ve směsi methanol/kyselina octová/H20 (4:1:5 obj./obj.). Gelatinázová aktivita byla vizualizována jako čirý pás štěpení na modrém pozadí gelu a byla kvantifikována počítačovou denzitometrickou obrazovou analýzou pomocí Image LabTM Software (Bio-Rad Laboratories). želatináza

aktivita byla vyjádřena jako optická hustota (OD) x mm2, představující skenovací plochu pod křivkami, která bere v úvahu jak jas, tak šířku zóny lýzy substrátu. Data byla vyjádřena pomocí následující rovnice: procento inhibice=[100 - (OD vzorek/OD pozitivní kontrola) x 100].

Reverzní transkripční-polymerázová řetězová reakce (RT-PCR)

Astrocyty nasazené na 6jamkové destičky byly aktivovány LPS (10 ug ml-1) a současně ošetřeny ITC v maximální netoxické koncentraci. Po 20 hodinách inkubace byla z astrocytů extrahována celková RNA pomocí mini sady Qiagen RNeasy podle pokynů výrobce. Komplementární DNA (cDNA) byla syntetizována z 500 ng RNA pomocí soupravy QuantiTect Reverse Transscription kit podle pokynů výrobce. Celkem 25 ng produktů reverzní transkripce bylo použito k amplifikaci 591 bp fragmentu pomocí specifických primerů (sense 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′; antisense 5′-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) pro potkaní MMP-2 sekvenci a 541 bp fragment s použitím specifických primerů (sense 5'-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3'; anti-sense 5'-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) pro krysí MMP-9 sekvenci. Paralelně byla provedena amplifikace 308 bp fragmentu krysí 18S rRNA (sense 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; antisense 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), relativně invariantní interní referenční gen . Sady primerů, již validované v jiných studiích (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011) specificky rozpoznávají pouze geny zájmu, jak je indikováno amplifikací jednoho pásu očekávané velikosti PCR produkty. PCR amplifikace byla prováděna po 25 cyklů , z nichž každý sestával z denaturace při 94 stupních , nasedání na 59 stupních a extenze při 72 stupních . Po amplifikaci byly produkty analyzovány v 1,5% agarózových gelech. Po denzitometrické analýze gelů byla amplifikace cílových genů normalizována na expresi 18S rRNA a výsledky byly vyjádřeny jako procento inhibice ve srovnání s pozitivní kontrolou, jak je uvedeno pro kvantifikaci gelatinázy.

Detekce fosforylace ERK 1/2 pomocí analýzy western blot

ERK 1/2 byly detekovány imunoblotovou analýzou, jak je popsáno v Latronico et al. (2018). Stručně řečeno, splývající primární

astrocyty nanesené na {{0}}jamkové destičky, ponechány v klidu v médiu bez séra po dobu 24 hodin, byly předem ošetřeny po dobu 1 hodiny pomocí AITC (40}0 μM), PEITC (10 μM), nebo SFN (25 uM) v DMEM bez fenolové červeně. Po stimulaci po dobu 2 hodin 10 ug ml-1 LPS byly buňky lyžovány pomocí 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM pyrofosfátu sodného, ​​1 mM glycerofosfátu 1 procento Tritonu X-100, 1 mM fenylmethylsulfonyl fluorid, 20 ug/ml aprotininu, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fluorid, 1 mM Na3V04, pH 7,5. Šedesát ug celkových proteinů každého vzorku bylo rozděleno elektroforézou na 10% SDS-polyakrylamidovém gelu a proteiny byly poté imunoblotovány na polyvinylidendifluoridové membrány. Po blokování přes noc při 4 stupních pomocí 0,05 procenta Tween 20, 1 procenta mléka, 1 procenta hovězího sérového albuminu ve 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) byly membrány sondovány přes noc při 4 stupních monoklonální anti-p- ERK 1/2 protilátka (1:500). Poté byly membrány třikrát promyty 0,05% Tween 20 v Tris-pufrovaném fyziologickém roztoku, sondovány sekundární protilátkou proti myší-křenové peroxidáze (1:20,000) po dobu 2-h při 24 stupních a detekovány se zvýšenou chemiluminiscencí. Pro hodnocení celkového množství ERK byly membrány stripovány a inkubovány s protilátkou specifickou pro nefosforylovanou ERK 1/2 (1:500). Intenzity pásů byly kvantifikovány denzitometrickým skenováním blotů a hladiny fosforylace ERK 1/2 byly normalizovány na nefosforylovanou ERK 1/2 a vyjádřeny jako procento ve srovnání s pozitivní kontrolou (astrocyty ošetřené LPS), podle následující rovnice:

procento pERK 1/2=(ODvzorek/ODpozitivní kontrola) × 100.

Statistická analýza

Analýza dat byla provedena pomocí GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Data byla vyjádřena jako průměrné hodnoty ± SD. Statistická analýza byla provedena za použití jednosměrné analýzy rozptylu (ANOVA) následované Dunnettovým vícenásobným porovnáváním post hoc testem.

Výsledek

Vliv isothiokyanátových sloučenin na životaschopnost astrocytů

Pro vyhodnocení cytotoxicity AITC, PEITC nebo SFN byly provedeny předběžné experimenty. Za tímto účelem byly purifikované astrocyty ošetřeny po dobu 20 hodin sloučeninami ITC v koncentracích v rozmezí 5 až 400 uM nebo DMSO zředěným v kultivačním médiu, jak je popsáno v části Metoda. Jak je znázorněno na obr. 1, DMSO nebyl toxický ve všech použitých koncentracích, které odpovídají koncentracím testovaných roztoků ITC. Mezi zkoumanými ITC, AITC

Obr. 1 Buněčná životaschopnost astrocytů ošetřených isothiokyanátovými sloučeninami. Konfluentní primární astrocyty byly ošetřeny po dobu 20 hodin allyl isothiokyanátem (AITC), 2-fenethyl isothiokyanátem (PEITC) nebo 2-sulforafanem (SFN) v uvedených koncentracích a poté podrobeny testu MTT. Kromě toho, protože je v zásobních roztocích rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO), byla v každém experimentu provedena křivka závislosti odezvy na dávce na DMSO, naředěný v kultivačním médiu při stejné koncentraci rozpouštědla (v procentech) přítomné ve vzorcích ITC, aby se získal spolehlivý odhad toxicity ITC. Ovládací prvek (CTRL) byl repre-

vonné z neošetřených astrocytů v DMEM bez séra. Grafy představují křivky závislosti na dávce a životaschopnosti buněk, vyjádřené jako procento přežití buněk ve srovnání s kontrolou. Dávky sloučenin, které určovaly životaschopnost buněk nad 60 procent, byly zvoleny jako maximální netoxické koncentrace. Hodnoty jsou průměr ± SD z n=3 experimentů provedených na různých buněčných populacích. Mikrografy ukazují reprezentativní výsledky buněčné morfologie pozorované pod mikroskopem s fázovým kontrastem (50x zvětšení) po ošetření různými sloučeninami

byl méně toxický pro astrocyty. Konkrétně AITC nebyl toxický pro buňky do 400 uM, zatímco PEITC a SFN byly toxické při koncentracích nad 10 a 25 uM, v daném pořadí. Mikroskopické pozorování potvrdilo výsledky testu MTT ukazující, že při toxických koncentracích PEITC a SFN byl počet astrocytů snížen a ty, které zůstaly, vykazovaly cytotoxické změny v jejich cytoplazmě.

Ochranný účinek sloučenin ITC na produkci ROS v astrocytech ošetřených peroxidem vodíku

Pro hodnocení ochranného účinku ITC vůči oxidativnímu stresu byly astrocyty předem ošetřeny PEITC, AITC a SFN v maximální netoxické koncentraci a poté stimulovány H2O2. Intracelulární produkce ROS, indukovaná H202, byla testována pomocí DCFH-DA. Jak je znázorněno na obr. 2, expozice H2O2 zesílila fluorescenční signál v

Obr. 2 Produkce reaktivních forem kyslíku (ROS) v astrocytech ošetřených ITC. Přítomnost ROS byla testována měřením změn fluorescenčního signálu 2',7'-dichlorfluoresceinu (DCFA), jak je uvedeno v části Materiály a metody. Astrocyty nasazené na 6jamkové destičky byly předem ošetřeny po dobu 30 min DCFA a poté ošetřeny po dobu 1 hodiny 10 μM PEITC, 400 μM AITC nebo 25 μM SFN v přítomnosti H2O2 v konečné koncentraci 100 μM . Astrocyty ošetřené samotnou DCFA (CTRL) nebo 100 μM H2O2 představovaly negativní a pozitivní kontrolu. Fluorescenční signál detekovaný v buněčných lyzátech byl měřen fluorometrem při 525 nm při excitaci při 485 nm. Produkce ROS byla vyjádřena jako procento (procenta) intenzity fotoluminiscence (PL) ve srovnání s pozitivní kontrolou. Hodnoty jsou průměr ± SD z n=3 experimentů provedených na různých buněčných populacích. Statisticky významný pokles ve srovnání s H2O2 je označen hvězdičkami (jednocestná ANOVA následovaná Dunnetovým post hoc testem; *p <>

astrocyty ve srovnání s kontrolou (CTRL). Jak dokazuje pokles intenzity fluorescence DCF, předběžné ošetření astrocytů sloučeninami ITC působilo proti tvorbě ROS indukované H2O2. Mezi testovanými ITC byly pouze PEITC a SFN schopny významně snížit produkci ROS asi o 20 a 24 procent v porovnání s pozitivní kontrolou (H2O2).

Isothiokyanátové sloučeniny inhibují hladiny MMP-2 a MMP-9 v astrocytech aktivovaných LPS

Účinek sloučenin ITC na hladiny MMP-2 a MMP{1}} byl hodnocen na astrocytech aktivovaných LPS, o kterém je známo, že indukuje expresi gelatináz (Gottschall a Deb 1996), a současně ošetřených AITC, PEITC nebo SFN v rozsahu koncentrací, které nebyly toxické pro buňky. Jak je znázorněno na obr. 3a, na gelu byly přítomny dva jasné pruhy štěpení 72 a 92 kDa odpovídající MMP-2 a MMP-9. Aktivace astrocytů pomocí LPS zvýšila hladiny MMP-2 a vyvolala syntézu MMP-9. Léčba pomocí AITC (obr. 3b), PEITC (obr. 3c) nebo SFN (obr. 3d) určila dávku závislou

snížení hladin MMP-9, které se lišily v závislosti na použité sloučenině. Konkrétně mezi použitými ITC byl SFN nejúčinnější v inhibici MMP-9, protože stanovil 70procentní inhibici při dávce 10 μM a 100% inhibici při dávce 25 μM. Kromě toho pouze SFN v maximální netoxické koncentraci byl schopen významně inhibovat MMP-2 (obr. 2d).

Isothiokyanátové sloučeniny inhibují expresi genů MMP-2 a MMP-9 v astrocytech aktivovaných LPS

Aby se určilo, zda jsou studované sloučeniny ITC schopny inhibovat expresi MMP-2 a MMP-9, byla provedena RT-PCR na astrocytech aktivovaných LPS ošetřených maximální netoxickou koncentrací ITC. Jak je ukázáno na reprezentativních gelech na obr. 4a, ošetření LPS-aktivovaných astrocytů jednotlivými ITC bylo schopno působit proti zvýšené expresi MMP-2 a MMP{8}} mRNA. Jak je znázorněno na obr. 4b, kvantitativní analýza výsledků prokázala, že při maximální netoxické koncentraci sloučeniny ITC stanovily statisticky významnou inhibici exprese MMP-2 a MMP-9 ve srovnání na pozitivní kontrolu (LPS). Konkrétně PEITC a SFN vykazují stejné procento inhibice na MMP-2 (85 procent) a MMP-9 (100 procent), zatímco AITC byly v inhibici MMP méně účinné než PEITC a SFN{{17} } (65 procent) a MMP-9 (90 procent).

ERK 1/2 se podílí na inhibici exprese MMP prostřednictvím ITC

Protože ERK 1/2 je hlavní signální transdukční dráha zapojená do regulace exprese MMP-2 a MMP-9 v astrocytech aktivovaných LPS (Lee et al. 2003), účinek sloučenin ITC na byla testována aktivace extracelulárně regulovaných proteinkináz (ERK) 1/2.

Jak je znázorněno na obr. 5, LPS indukoval statisticky významné zvýšení hladin fosforylované ERK 1/2 (p-ERK), které bylo potlačeno předběžnou úpravou sloučeninami ITC.

Diskuse

Obecně se má za to, že hlavní obranné strategie proti mnoha nemocem spočívají především ve vyhýbání se rizikovým faktorům a osvojení si správné životosprávy. Existuje mnoho vědeckých důkazů podporujících hypotézu, že některé přírodní metabolity, typicky produkované různými druhy ovoce a zeleniny, jsou schopny modulovat patologické jevy, jako je rakovina, neurologická onemocnění a další multifaktoriální onemocnění. V tomto scénáři vzbudily velký zájem isothiokyanáty (ITC) vzhledem k jejich antifungálním, antibakteriálním,

Obr. 3 Účinek isothiokyanátových sloučenin na hladiny MMP-2 a MMP-9 v astrocytech aktivovaných LPS. V a je uveden reprezentativní zymografický gel analýzy kultivačních supernatantů z astrocytů aktivovaných LPS (10 ug ml-1) a současně ošetřených po dobu 20 hodin pomocí AITC, PEITC nebo SFN v uvedených koncentracích (μM). Negativní a pozitivní kontroly byly získány z nestimulovaných a neošetřených astrocytů v médiu bez séra (CTRL) a LPS-

aktivované buňky (LPS), resp. Histogramy b–d představují výsledky (průměr ± SD) n {{0}} experimentů provedených na různých buněčných populacích, vyjádřené jako procento inhibice MMP ve srovnání s LPS, vypočítané po skenování denzitometrie a počítačové analýze gelů . Statisticky významný pokles ve srovnání s LPS je označen hvězdičkami (jednocestná ANOVA následovaná Dunnetovým post hoc testem; *p < 0,05,="" **p=""><>

antikarcinogenní, antimutagenní, antioxidační a protizánětlivé biologické vlastnosti (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015; Vig et al., 2009; Talalay a Fahey 2001). Isothiokyanáty pocházejí z enzymatické degradace glukosinolátů (GSL), které jsou sekundárními metabolity přítomnými v 15 botanických čeledích řádu Capparales a jsou velmi hojné v čeledi Brassicaceae (Fahey et al. 2001). GSL jsou hydrolyzovány myrosinázou (-thioglukosid glukohydroláza e; EC 3.2.3.147) v různých složkách, jako jsou ITC, dusitany, thiokyanáty, epithionitrily, SFGate, glukóza a oxazolidiny (Li a Kushad 2005). Přestože byly ITC rozsáhle studovány v oblasti chemoterapie (Grundemann a Huber 2018), bylo provedeno jen málo výzkumů o jejich terapeutickém potenciálu u neurologických onemocnění, přestože byla prokázána schopnost SFN a AITC procházet přes BBB a akumulovat se v mozkovém parenchymu. (Clarke et al. 2011; Jazwa et al. 2011; Zhang 2010). V tomto článku jsme porovnali účinky tří ITC,

přítomný v několika běžně konzumovaných brukvovitých zeleninách, na produkci reaktivních forem kyslíku (ROS) a expresi matricové metaloproteinázy (MMP) v in vitro modelu neurozánětu reprezentovaného astrocyty aktivovanými lipopolysacharidem (LPS) nebo ošetřenými H2O2. Astrocyty, nejhojnější typ gliových buněk CNS, hrají klíčovou roli v udržování mozkové homeostázy a jsou charakteristickým znakem různých neurologických onemocnění (Cekanaviciute a Buckwalter 2016; Colombo a Farina 2016). Jsou považovány za klíčové regulátory vrozené imunitní reakce a jejich reakce na škodlivé inzulty, jako je oxidační stres, může zhoršit zánětlivé reakce a poškození tkáně nebo podpořit opravu tkáně. Je dobře známo, že aktivované astrocyty produkují neurotoxické faktory, jako jsou MMP, které mají klíčovou roli při podpoře neurozánětu a progresivní ztráty neuronů u neurologických onemocnění (Hsieh a Yang 2013). Proto modulace

Obr. 4 Vliv sloučenin ITC na expresi MMP-2 a MMP-9 v astrocytech aktivovaných LPS. Astrocyty nasazené na 6jamkové destičky byly aktivovány LPS (10 µg ml-1) a současně ošetřeny po dobu 20 hodin pomocí AITC (400 μM), PEITC (10 μM) nebo SFN (25 μM), poté podrobeny RT-PCR. Reprezentativní agarózové gely s expresí MMP-2 a MMP-9 jsou uvedeny v (a). Histogramy v (b) představují výsledky (průměr ± SD) n=3 experimentů provedených na různých buňkách

události, které nastanou po aktivaci astrocytů, by mohly zmírnit zánětlivou reakci a poškození neuronů.

Výsledky této studie ukázaly, že mezi studovanými ITC byl AITC méně toxický, protože nevedl k žádnému snížení životaschopnosti buněk ve všech použitých koncentracích. Na rozdíl od toho, podobně jako to, co bylo pozorováno jinými autory na různých gliových buněčných liniích, PEITC a SFN vykazovaly buněčnou toxicitu při koncentracích vyšších než 10 a 25 µM, v daném pořadí (Lee et al. 2015; Eren et al. 2018; Su et al. 2015).

V současné vědecké literatuře existuje mnoho kontroverzních údajů o molekulárních mechanismech, které jsou základem účinků ITC na životaschopnost buněk. V tomto ohledu většina studií naznačuje, že ITC inhibují apoptózu indukující buněčný růst, zastavení buněčného cyklu, tvorbu ROS v rakovinných buňkách, ale ne v normálních buňkách (Fofaria et al. 20}15; Qin et kol. 2018; Sestili a Fimognari 2015). Zjistili jsme, že SFN a PEITC, ale ne AITC, mají ochrannou roli proti oxidativnímu stresu v astrocytech, skutečně při maximálních netoxických koncentracích byly schopny působit proti produkci ROS vyvolané expozicí H2O2. CNS je zvláště citlivý na oxidační stres kvůli vysoké spotřebě kyslíku, slabým antioxidačním systémům a vysokému obsahu biomakromolekul náchylných k oxidaci. Předpokládá se, že tvorba ROS a oxidativní poškození se podílejí na patogenezi neurologických poruch, jako je Alzheimerova choroba (AD), Parkinsonova choroba (PD), amyotrofická laterální skleróza (ALS) a roztroušená skleróza (MS) (Lee et al. 2015). Proto, i když v našich experimentech in vitro SFN a PEITC působily proti produkci ROS v mírném rozsahu, mohli bychom předpokládat, že in vivo dlouhodobé podávání ITC může vést k významnějšímu snížení ROS, což může časem vést k významnému pro populace vyjádřené jako procento inhibice MMP ve srovnání s pozitivní kontrolou (LPS), vypočítané po skenovací denzitometrii a počítačové analýze gelů. Statisticky významný pokles exprese MMP-2 a MMP{10}} ve srovnání s LPS je označen hvězdičkami (jednosměrná ANOVA následovaná Dunnetovým post hoc testem; *p <>

prevence a modulace mozkových onemocnění. ROS působí jako kritická signální molekula pro spuštění kaskády zánětlivé reakce do CNS. V tomto ohledu je dobře známo, že ROS reguluje expresi mnoha genů zapojených do neurozánětu prostřednictvím aktivace prozánětlivých transkripčních faktorů, jako je nukleární faktor-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana et al. 2019). V tomto scénáři hrají důležitou roli MMP, jejichž exprese je up-regulována ROS prostřednictvím aktivace NF-κB (Yan a Boyd 2007).

Protože dysregulace MMP přispívá k patogenezi řady neurozánětlivých a neurodegenerativních onemocnění, představuje jejich inhibice důležitou terapeutickou strategii. Z tohoto důvodu se v posledním desetiletí soustředil rostoucí zájem na potenciál léčiv a přírodních sloučenin inhibovat MMP. Četné studie in vitro prokázaly, že protizánětlivý a antioxidační účinek několika léčiv a bioaktivních sloučenin přítomných v zelenině a mořských organismech je spojen s jejich schopností inhibovat expresi MMP (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. 2015). V této studii jsme prokázali, že mezi testovanými ITC byly SFN a PEITC nejúčinnější v inhibici hladin a exprese MMP-2 a MMP-9 v astrocytech aktivovaných LPS. Inhibice MMP prostřednictvím ITC byla popsána v jiných studiích in vivo a in vitro. Zejména Li a kol. (2013) prokázali, že SFN je schopen zmírnit poškození BBB inhibicí exprese MMP-9 v in vivo modelu experimentální autoimunitní encefalomyelitidy. Jiní autoři uvedli, že SFN byla schopna zmírnit expresi MMP-9 po poranění míchy u myší (Mao et al. 2010a). Kromě toho studie in vitro prokázaly, že potlačení buněčné migrace a migrace pomocí ITC

Obr. 5 Extracelulárním signálem regulovaná kináza 1/2 (ERK 1/2) se účastní inhibice exprese MMP sloučeninami ITC. Reprezentativní autoradiografické filmy analýzy westernovým přenosem lyzátů z astrocytů předem ošetřených po dobu 1 hodiny pomocí AITC (400 μM), PEITC (10 μM) nebo SFN (25 μM) a poté aktivovaných po dobu 2 hodin pomocí LPS (10 ug ml{{ 13}}). Neošetřené a nestimulované buňky představují negativní kontrolu (CTRL). Histogram v (b) představuje invazi hladin pERK1/2 v buňkách gliomu C6 spojenou s inhibicí exprese MMP-9 zprostředkované NF-κB (Lee et al. 2015).

Molekulární mechanismy, kterými ITC inhibují MMP, jsou nejasné a neexistují žádné studie zkoumající antioxidační a protizánětlivé vlastnosti ITC na primárních kulturách astrocytů. Několik studií podporuje hypotézu, že inhibiční účinek ITC je důsledkem jejich schopnosti blokovat NF-KB signální dráhou Nrf2. V tomto ohledu studie in vivo prokazuje, že myši s knockoutem Nrf2 byly náchylnější k zánětlivé odpovědi míchy zprostředkované NF-KB a ke zvýšené expresi genů závislých na NFκB včetně MMP-9 (Mao et al. 2010b ). Přestože se dráhy NF-KB a Nrf2 mohly vzájemně prolínat, ukázali jsme, že k regulaci NF-KB dochází také prostřednictvím modulace molekulárních mechanismů, které jsou nezávislé na Nrf2. Zjistili jsme, že AITC, PEITC a SFN inhibovaly aktivaci ERK1/2, která hraje klíčovou roli v kaskádě událostí přenosu signálu, které nakonec regulují transkripci genu MMP.

Experimentální důkazy, že SFN v maximální netoxické koncentraci zcela inhibovaly expresi i hladiny MMP-9, zatímco AITC a PEITC maximálně inhibovaly expresi MMP-9, ale pouze snížily MMP{{3} } na přibližně 50 procent, může naznačovat, že tyto sloučeniny modulují transkripci MMP-9 různými mechanismy účinku. V tomto ohledu bylo publikováno, že SFN, kromě inhibice LPS-indukované aktivace NF-KB, interferuje s vazbou LPS na TLR4 receptor (Koo et al 2013). Inhibiční účinek SFN na TLR4 by mohl zabránit aktivaci astrocytů pomocí LPS, což může vést k upstreamové inhibici exprese MMP-9 s následným nedostatkem produkce MMP-9.

získané po denzitometrickém skenování autorradiografických filmů a normalizaci na nefosforylovanou ERK 1/2. Data představují průměry ± SD z n=3 experimentů provedených na různých buněčných populacích. Hvězdičky představují hodnoty statisticky odlišné od pozitivní kontroly (astrocyty aktivované LPS), která byla nastavena na 100 procent (jednocestná ANOVA následovaná Dunnettovým vícenásobným porovnáváním post hoc; *p <>

Závěry

V souhrnu naše data naznačují, že ošetření astrocytů pomocí ITC snižuje tvorbu ROS a inhibuje uvolňování MMP-2 a MMP-9, což poskytuje nový pohled na antioxidační a protizánětlivé vlastnosti ITC na gliální buňky. Tyto výsledky naznačují, že ITC by mohly být slibnými nutraceutickými činidly pro vývoj neuronutričních intervencí založených na používání zdravých potravin, pro prevenci a doplňkovou léčbu neurologických onemocnění.

Financování Financování s otevřeným přístupem poskytované Università Degli Studi di Bari Aldo Moro v rámci dohody CRUI-CARE.

Dodržování etických norem

Střet zájmů Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Otevřený přístup Tento článek je licencován podle Creative Commons Attribution 4.{1}} Mezinárodní licence, která umožňuje použití, sdílení, adaptaci, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu nebo formátu, pokud uvedete příslušné jméno původního autora (s) a zdroj, uveďte odkaz na licenci Creative Commons a uveďte, zda byly provedeny změny. Obrázky nebo jiný materiál třetích stran v tomto článku jsou zahrnuty v licenci Creative Commons k článku, pokud není uvedeno jinak v kreditní hranici k materiálu. Pokud materiál není zahrnut v licenci Creative Commons článku a vaše zamýšlené použití není povoleno zákonnými předpisy nebo překračuje povolené použití, budete muset získat povolení přímo od držitele autorských práv. Chcete-li zobrazit kopii této licence, navštivte http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.