Účinky glykosidů Cistanche na synaptickou morfologickou plasticitu u myší zrychlených stárnutím
Mar 11, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
LIAN Juanqi1, WANG Lu2, ZHAO Fujun3, LIN Shuai3, YAN Xusheng4, JIA Jianxin4, CAI Zhiping4
(1. ročník 2014 Graduate School of Baotou Medical College, Baotou 014060, Čína)
(2. třída 12 ročníku klinické medicíny 2015 na lékařské fakultě Baotou)
(3. třída 1 ze soudního lékařství 2013 na Baotou Medical College)
(4. Ústav lidské anatomie Baotou Medical College)
ABSTRAKTNÍ
Objektivní: Prozkoumat účinekglykosidycistanche (GCs) na synaptickou plasticitu hipokampálních neuronů u myší náchylných k senescenci 8 (SAMP8).Metody: 4 0 myši byly náhodně rozděleny do kontrolní skupiny, skupiny s vehikulem, skupiny s nízkou dávkou (podávané GC 2,5 mg/kg ·d), skupiny se střední dávkou (podávané GC 5.0 mg/kg < d)="" a="" skupina="" s="" vysokou="" dávkou="" (podávané="" gc="" 10,0="" mg/kg="" ·="" d).="" myším="" v="" kontrolní="" skupině="" nebyl="" poskytnut="" žádný="" zásah;="" ti="" v="" podávaných="" skupinách="" a="" skupina="" s="" vehikulem="" podstoupila="" intraperitoneální="" podávání="" (gc/fyziologický="" roztok)="" nebo="" fyziologický="" roztok="" po="" dobu="" 30="" dnů.="" počet="" normálních="" pyramidálních="" neuronů="" v="" hipokampální="" oblasti="" ca1="" byl="" spočítán="" pomocí="" nissl="" barvení;="" počet="" dendritických="" trnů="" v="" synapsích="" byl="" spočítán="" golgiho="" barvením="" a="" proteinová="" exprese="" psd-95="" byla="" kvantifikována="">Výsledek: Ve srovnání s těmi v kontrolní skupině GC významně zvýšily počet normálních pyramidálních neuronů v hipokampální oblasti CA1 (P<0.05) and="" increased="" the="" number="" of="" dendritic="" spines="" in="" synapses="" (p=""><0.05). the="" expression="" levels="" of="" psd-95="" in="" administered="" groups="" were="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.05), and="" the="" effect="" in="" the="" middle="" dose="" group="" was="" the="" most="" significant.="">Závěr: GC mohou zlepšit míru přežití hipokampálních pyramidálních buněk a zlepšit synaptickou plasticitu.
KLÍČOVÁ SLOVA: Glykosidy cistanche (GC); Myš se zrychleným stárnutím; Dendritická páteř; PSD – 95
Se stárnutím sociální populace se stává stále závažnějším, prevalenceAlzheimerova choroba(AD) postupně narůstalo, což přineslo velkou zátěž rodinám pacientů a společnosti
[1]. Hlavními klinickými projevy AD jsou kognitivní poruchy a poruchy paměti a hlavními případovými znaky jsou senilní plaky tvořené extracelulárními amyloidovými depozity a intracelulárními neurofibrilárními klubky[2]. Patogeneze AD je stále neprůkazná. Patologické změny synapsí jsou považovány za neurobiologický základ AD paměti a kognitivní dysfunkce. Abnormální změny v synapsích mohou být základním článkem v patogenezi AD. Senescence akcelerovaná myš (SAM) je inbrední model stárnoucí myši. Jeho podlinie P8 má jednotné a stabilní patologické charakteristiky stárnutí, což se projevuje progresivním poklesem učení a paměti a rozpoznávání s přibývajícími měsíci. Známá dysfunkce a patologické projevy jsou podobné pacientům s AD, takže myši SAMP8 jsou ideálním zvířecím modelem pro studium mechanismu poškození učení a paměti související se stárnutím.
Tento článek má v úmyslu analyzovat míru přežití buněk, měřit hustotu dendritické páteře a detekovat postsynaptické kompakty, aby prozkoumal možný mechanismus GC.(glykosidycistanche)ovlivnění synaptické morfologické plasticity hipokampálních neuronů u rychle stárnoucích myší s ohledem na léčbu související s ADcistancheglykosidy(GCs) Poškození prostorového učení a paměti poskytuje teoretický a experimentální základ.
1 Materiál a metody
1.1 Experimentální zvířata a seskupení 40 samců 10-měsíců starých myší SAMP8 (zakoupeno na Tianjinské univerzitě tradiční čínské medicíny), chovaných v čistém prostředí, okolní teplotě (240 ±). 1.0) stupeň, vlhkost (50,0 ± 5,0) procent, jídlo a voda zdarma. Pro zahájení experimentu byla zvířata vychována do věku 11 měsíců. Zvířata byla náhodně rozdělena do 5 skupin (8 zvířat/skupina): slepá kontrolní skupina (kontrolní skupina), kontrolní skupina s rozpouštědlem (vehikulum),cistanche celkové glykosidy(GC) skupina s nízkou dávkou [2,5 mg / (kg ·d)], skupina se střední dávkou [5. 0 mg / (kg · d)], skupina s vysokou dávkou [10.0 mg / (kg · d)]. Zvířatům v kontrolní skupině nebyl poskytnut žádný zásah. Zvířatům ve skupině s nízkou dávkou bylo podáváno GC 2,5 mg / (kg ·d), zvířatům ve skupině se střední dávkou bylo podáváno GC 5.0 mg / (kg ·d) a zvířatům v skupině s vysokou dávkou byly podávány GC. 0 mg/(kg ·d), zvířatům ve skupině s vehikulem bylo podáno stejné množství normálního fyziologického roztoku. Kontinuální intraperitoneální injekce léků nebo fyziologického roztoku po dobu 30 dnů, 0,5 ml/d.
1.2 Příprava a zpracování vzorků Zvířata byla usmrcena 24 hodin po posledním podání, anestetizována a krk byl utracen. Prořízněte hrudní dutinu, abyste obnažili srdce, přeřízněte úpon pravé síně, aby krev vytekla, a zaveďte perfuzní jehlu do levé komory. Po infuzi 100 ml normálního fyziologického roztoku se pokračovalo v infuzi 4% paraformaldehydu, dokud nebyly končetiny myší ztuhlé. Vezměte mozek a umístěte jej do 4procentního paraformaldehydu na více než 24 hodin.
1.3 Léčiva a činidla GC(glykosidycistanche) byly zakoupeny od China Academy of Traditional Chinese Medicine, postsynaptická hustota -95, PSD -95 byly zakoupeny od Epitomic, Coomassie Brilliant Blue CBBG 250 kit byl zakoupen od Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd. Engineering Institute, DAB imunohistochemický kit byl zakoupen od Biotechnologická společnost Peking Zhongshan Jinqiao.
1.4 Barvení Nissl a počet buněk Fixace mozkové tkáně 4 procenty paraformaldehydem na více než 24 hodin, oříznutí a dehydratace gradientovým alkoholem, transparentní xylen, ponoření do vosku, zalití konvenčním parafínem, sériový řez o tloušťce 5 μm. Plátky nakrájíme a odvoskujeme do vody, barvíme 1% toluidinovou modří při 37 stupních po dobu 60 min, 5 min x 3x pereme, odlišíme 95% alkoholem, 100% alkoholem Dehydratujeme, průhledný xylen, připevníme neutrální gumou, pozorujeme pod mikroskop. Oblast CA1 stejného hipokampálního řezu každé skupiny byla náhodně vybrána ze 3 pozorovacích polí (x100), byl spočítán počet normálních pyramidálních buněk v rámci 1 mm a pro analýzu byl vzat průměr.
1.5 Modifikované Golgiho barvení Vložte opravenou mozkovou tkáň do Golgi-Coxova barvícího roztoku, chraňte před světlem po dobu 14 dnů a každé 2 dny vyměňte roztok; umístěte mozkovou tkáň do 30 procent sacharózy a umístěte ji do chladničky při teplotě 4 stupňů. Tkáň může být rozdělena po poklesu na dno; vibrační mikrotom pro krájení a barvení; řešení ustalovače pro vývoj; sušení montážní desky, pozorování a počítání pod mikroskopem. Pozorujte změny v dendritické páteři neuronového apexu hippocampu CA1 a CA3 každé skupiny myší a vypočítejte hustotu dendritické páteře.
1.6 Imunohistochemické řezy byly zbaveny parafinu ve vodě, inkubovány s 3% H2O2 po dobu 10 minut, aby se eliminovala aktivita endogenní peroxidázy, promyty destilovanou vodou po dobu 5 minut × 3krát, opraveny vysokotlakou mikrovlnnou troubou, promyty PBS po dobu 5 minut × 3krát bylo kozí sérum blokováno po dobu 30 minut při pokojové teplotě, po kapkách byla přidána králičí anti-myší PSD-95 primární protilátka, přes noc při 4 stupních, promývána PBS po dobu 5 minut× 3krát byla po kapkách přidána sekundární protilátka značená biotinem, inkubována při 37 stupních po dobu 2 hodin, promyta PBS po dobu 5 minut × 3krát, přikapána křenovou peroxidázou značený streptavidin, promyta PBS po dobu 5 minut × 3krát, promyta DAB po dobu 2 minut, kontrastně obarveno hematoxylinem, dehydratováno gradientovým alkoholem, transparentní xylenem a namontováno. 1.7 Zpracování obrazu a statistická analýza. Pro pozorování byly vybrány stejné hipokampální průřezy každé skupiny. Tři zorná pole (×100) byla náhodně vybrána v oblasti CA1, aby se spočítal počet normálních pyramidálních buněk do 1 mm, a analyzoval se průměr. Výsledky imunohistochemie byly měřeny softwarem pro analýzu obrazu IPP 7.0. Experimentální data byla analyzována softwarem SPSS 17.0 a jednocestná ANOVA byla použita pro vícevzorkové párové porovnání průměrů. P<0.05 was="" considered="" statistically="">
Anti-Alzheimerova nemoc
2 výsledky
2.1 Účinek celkových glykosidů zcistanchena počtu normálních pyramidálních buněk v hipokampu myší SAMP8 Nissl barvení Výsledky Nissl barvení ukázaly, že počet neuronů v oblasti CA1 kontrolní skupiny se snížil, uspořádání bylo neuspořádané a většina buněk byla abnormální v morfologii a lýza a nekróza. Morfologie buněk v GC(glykosidycistanche)skupina byla relativně jasná a úplná, s velkým počtem viditelných výčnělků, tělo Nissl bylo fialové, jadérka byla hluboce zbarvená, čirá a centrovaná a jádra nebyla obarvená. Buněčná morfologie skupiny s vehikulem je podobná jako u kontrolní skupiny. Počet buněk ukázal, že počet normálních pyramidálních neuronů v oblasti CA1 skupiny, které byla podávána, se zvýšil (P<0.05); the="" difference="" between="" the="" medium="" and="" high="" dose="" groups="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), the number of normal pyramidal neurons To a certain extent, it shows an upward trend with increasing dose. There was no significant difference in the number of normal pyramidal cells between the vehicle group and the control group (P>0.05). Viz tabulka 1.
Tabulka 1 Účinek glykosidů cistanche na barvení hippocampu u myši SAMP8, normální počet pyramidálních buněk a počet dendritických trnů (ks)
a je porovnáno s kontrolní skupinou t=0.193, P=0.582; b je porovnáno s kontrolní skupinou t=13.621, P=0.008; c je porovnáno s kontrolní skupinou t=21.798 , P=0.005; d je porovnáno s kontrolní skupinou t=18.326, P=0.006; e je porovnáno s kontrolní skupinou t=0.244, P=0.463; f je ve srovnání s kontrolní skupinou V porovnání s t=10.903, P=0.010; g je porovnáno s kontrolní skupinou t=21.817, P=0.005; h je porovnáno s kontrolní skupinou t=15.572, P=0. 007.
2.2účinek celkových glykosidůcistanche na hustotě dendritických trnů u myší SAMP8 Golgiho barvení ukázalo, že počet dendritických trnů v kontrolní skupině se snížil a hustota se snížila. Po podání GC zvířatům se zvýšil počet a hustota dendritických trnů a bylo vidět velké množství výčnělků (P=0,048). Mezi skupinou se střední dávkou a skupinou s vysokou dávkou nebyl žádný statisticky významný rozdíl (P=0,853). Počet a hustota dendritické páteře Stupeň vykazuje vzestupnou tendenci s rostoucí dávkou. skupina vozidel a kontrola
Počet a hustota dendritických trnů ve skupině nemají statistickou významnost (P=0,764). Viz tabulka 1.
2.3 ÚčinekCistancheglykosidy na expresi PSD-95 u myší SAMP8 Imunohistochemická kvalitativní detekce PSD-95 ukázala, že kontrolní skupina měla nižší expresi PSD-95, barvení buněk bylo světlejší a míra pozitivní exprese byla nižší. Po suplementaci GC in vitro se buněčné tělo zbarvilo hlouběji a exprese a pozitivní míra PSD-95 se zvýšila (t=5.751, P<0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" the="" middle-dose="" group="" and="" the="" high-dose="" group="" (t="1.077," p="">0.05). Do určité míry vykazovala exprese PSD-95 stoupající trend se zvyšujícími se dávkami. vozidlo
There was no statistically significant difference in PSD-95 expression between the control group and the control group (t = 0.585, P>0.05).
3 Diskuse
PSD-95 je hlavní složkou postsynaptických a souvisí s různými synaptickými funkcemi zahrnujícími iontové kanály, synaptickou aktivitu, intracelulární dráhy přenosu signálu atd. [3]. PSD-95 shlukuje příbuzné proteiny v signální dráze receptoru NMDA za vzniku komplexu receptor-signální molekula-regulační molekula-cílí molekulu [4], který hraje klíčovou roli v dráze přenosu signálu. NMDA receptory se podílejí na indukci dlouhodobé potenciace (LTP) v oblasti CA1 hipokampu a procesu učení a paměti [5]. PSD-95 hraje v tomto procesu klíčovou regulační roli a jeho proteinový obsah lze použít jako Další molekulární marker pro měření synaptické plasticity. V našich předchozích studiích jsme dokázali, že GC(glykosidycistanche)může zlepšit poruchu učení a kognitivních funkcí u myší SAMP8, ale neobjasnili jsme její možný buněčný morfologický mechanismus. Tento experiment si klade za cíl studovat jeho možný buněčný morfologický mechanismus.
V tomto experimentu došlo ke zlepšení rychlosti přežití pyramidálních buněk a synaptické plasticity v GC(glykosidycistanche)skupina byla lepší než skupina s vehikulem a kontrolní skupina. Je vidět, že GC zlepšily morfologii pyramidálních buněk výrazněji. Experimentální výsledky ukazují, že vyšší dávky GC mohou mít lepší účinek. Ze srovnání mezi skupinou se střední dávkou a skupinou s vysokou dávkou je vidět, že když dávka dosáhne určité koncentrace, účinek se významně nemění. Proto, aby se zabránilo plýtvání a vedlejším účinkům GC při použití GC, měla by být zvolena nejvhodnější koncentrace [6].
Předchozí studie ukázaly, že GC(glykosidycistanche)může zlepšit poruchu učení a kognitivních funkcí u myší SAMP8 zlepšením míry přežití pyramidálních buněk [7]. Existují také údaje, které naznačují, že GC mohou zlepšit neurodegenerativní onemocnění podporou proliferace a diferenciace nervových kmenových buněk [8-10]. Autor se domnívá, že mechanismu GC ke zlepšení AD lze dosáhnout zlepšením plasticity synaptické morfologie a zachováním počtu pyramidálních buněk, což pokládá základ pro konečné použití GC v prevenci a léčbě klinické AD.
Reference
[1] Chen Juluo, Chen Xingui, Hu Panpan atd. Pacienti s Alzheimerovou chorobou využívají funkce Předběžný výzkum [J]. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science, 2013, 22 (10): 889-891.
[2] Jin Chunhui, Liu Xiaowei, Yuan Jianmin a kol. Jednonukleosidový gen pro třídění receptoru 1 Korelace mezi kyselým polymorfismem a sporadickou Alzheimerovou chorobou［J］. Chinese Journal of Behavioral Medicine and Brain Science, 2014, 23 (5): 427-429.
[3] Schliebs R, Arendt T. Význam cholinergního systému v mozku během stárnutí a při Alzheimerově chorobě［J］. Neural Transm, 2006, 113 (11): 1625-1644.
[4] Soriano FX. Specifické zacílení signálů pro-smrti NMDA receptorů s různou závislostí na NR2B PDZ ligandu［J］［. J Neurosci, 2008, 28 (42): 10696-10710.
[5] Selkoe DJ. Rozpustné oligomery amyloidního beta-proteinu zhoršují synaptickou plasticitu a chování ［J］［. Behav Brain Res, 2008, 192 (1): 106 -113.
[6] Huang Zonghui, Chen Guanmin, Zhao Kangtao a kol. Studie o toxicitě Cistanche ［J］. China Journal of Hygiene Inspection, 2014, 24 (8): 1098 -1100.
[7] Jia Jianxin, Song Wei, Yan Xusheng a kol. Celkové glykosidy cistanche mají účinek na myši SAMP8. Vliv a mechanismus vzájemného učení a paměti［J］. Journal of Baotou Medical College, 2014, 30 (6): 6-8.
[8] Xiao Q, Yan P, Ma X a kol. Posílení biogeneze astrocytárních lysozomů usnadňuje clearance A a zmírňuje patogenezi amyloidních plaků［J］［. J Neurosci, 2014, 34 (29): 9607-9620.
[9] Li QJ, Tang YM, Liu J a kol. Léčba Parkinsonovy choroby nervovými kmenovými buňkami C172 nadměrně exprimujícími NURR1 s rekombinovaným adenovirem s deficitem republiky obsahujícím gen NURR1［J］. Synapse, 2007, 61 (12): 971-977.
[10] Qin Wei, Wei Wei, Xu Qian a kol. Cistanche na proliferaci neurálních kmenových buněk C172 Vliv [J]. Strait Pharmacy, 2015, 27 (12): 263-265.
