Neuroprotektivní účinek extraktu Bu-Shen-Huo-Xue proti apoptóze vyvolané vysokou glukózou v buňkách PC12

Pro více informací:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Výzkumné studio integrace tradiční a západní medicíny, První nemocnice, Pekingská univerzita, Peking, Čína.

2 Státní klíčová laboratoř přírodních a biomimetických léčiv, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Peking, Čína.

Zvýraznění

Neurotoxicita vyvolaná vysokou glukózou (HG) se podílí na patologiidiabetikencefalopatie (DE). V naší studii extrakt Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), polybylinný vzorec, vykazujeneuroprotektivníaktivita na HG-indukovaných buňkách PC12 a možné mechanismy mohou být spojeny se supresí tvorby reaktivních forem kyslíku (ROS), stejně jako mitochondriemi zprostředkované kaspázy a signálních drah JNK/p38 MAPK. Tato studie poskytuje slibný prostředek pro léčbu DE v klinických aplikacích.

Kliknutím zobrazíte výhody extraktu cistanche a cistanche pro ledviny

Cistancheje známá tonická bylina, která dokáže vyživovat a chránitledviny. V teorii tradiční čínské medicíny,Cistancheje tou nejlepší bylinkouledviny.Cistancheje bohatý na echinakosid, akteosid a flavonoidy.Tyto účinné složky vCistanchemůže snížitledvinaapoptóza buněk a zvýšeníledvinabuněčná proliferace. Proto,Cistanchejepřírodní doplněk ledvin.

Abstraktní

Cíl: Zkoumat neuroprotektivní účinek extraktu Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), polybylinné formule, proti neurotoxicitě vyvolané vysokou glukózou (HG) u buněk PC12. Metody: Byly provedeny testy buněčné životaschopnosti, test laktátdehydrogenázy (LDH), detekce reaktivních druhů kyslíku (ROS), Hoechst 33258, dvojité barvení akridinová oranž (AO)/Ethidium bromid (EB) a test mitochondriálního membránového potenciálu (MMP). Kromě toho byly pomocí Western blotu detekovány Bax, Bcl-2, kaspáza-3, štěpená kaspáza-3, PARP, štěpená PARP, cytochrom c a mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK). Výsledky: Extrakt BSHX zvýšil životaschopnost buněk a snížil únik LDH způsobem závislým na koncentraci v buňkách PC12 indukovaných HG. Extrakt BSHX navíc snížil hladinu intracelulárního ROS, zvýšil potenciál mitochondriální membrány, reguloval expresi Bax a Bcl-2 a inhiboval uvolňování cytochromu c z mitochondrií. Kromě toho extrakt BSHX zeslabil aktivaci kaspázy-3 a PARP a inhiboval fosforylaci c-Jun N-terminální kinázy (JNK) a p38 MAPK. Závěr: Extrakt BSHX vykazoval významný neuroprotektivní účinek na HG-indukovanou apoptózu v buňkách PC12. Tento účinek může být spojen se supresí tvorby ROS a také mitochondrií zprostředkovaných kaspázových a JNK/p38 MAPK signálních drah.

klíčová slova:diabetická encefalopatie, tradiční čínská medicína, extrakt Bu-Shen-Huo-Xue,neuroprotektivní, vysoká hladina glukózy

Zkratka: AO: akridinová oranž; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Diabetická encefalopatie; DM: Diabetes Mellitus; DMSO: dimethylsulfoxid; EB: ethidium bromid; ERK: Extracelulárně regulované proteinkinázy; HG: Vysoká hladina glukózy; JNK: c-Jun N-terminální kináza; LDH: laktátdehydrogenáza; MAPK: mitogenem aktivované proteinkinázy; MWP: předpis Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-difenyltetrazoliumbromid; PBS: fyziologický roztok s fosfátovým pufrem; PBST: Phosphate-Buffered Saline, 0,1 procenta Tween 20; ROS: Druhy reaktivního kyslíku; T2DM: Diabetes Mellitus typu 2; TCM: Tradiční čínská medicína

Pozadí

V posledních letech získala široká pozornost diabetická encefalopatie (DE), komplikace diabetu mellitu (DM), která se vyskytuje v centrálním nervovém systému (CNS). DE může být spojeno s několika rizikovými faktory, jako je věk, trvání a glykemická kontrola diabetu [1, 2]. Klinickými projevy DE jsou morfologické a fyziologické změny v mozku a výsledná kognitivní dysfunkce. Hyperglykémie, oxidační stres a chronický zánět mohou být důležitými patogenními příčinami DE [3]. Ačkoli rostoucí počet experimentů ukázal, že dlouhodobá trvalá hyperglykémie může urychlit stárnutí mozku, přesná patogeneze DE není prozkoumána.

Apoptóza je programovaná buněčná smrt řízená geny k udržení stability mikroprostředí. Mezi proteiny podílející se na apoptóze patří rodina Bcl{0}}, kaspázy, p53 atd. Rodina Bcl{2}} je rozdělena do dvou kategorií, jedna podporuje buněčnou smrt, jako je Bax, a druhá odolává apoptóze, jako je Bcl-2. Mohou regulovat apoptózu prostřednictvím kaspázové signální dráhy, což je kaskádová amplifikační reakce ireverzibilního konečného hydrolyzačního substrátu kaspázy [4-6]. Studie navíc ukázaly, že apoptóza vyvolaná vysokou glukózou (HG) je spojena s mitochondriální dysfunkcí, poškozením DNA a nadměrnou produkcí reaktivních druhů kyslíku (ROS) [7]. Studie na diabetických myších ukázala, že adenosin 5'-monofosfátem (AMP)-aktivovaná proteinkináza (AMPK), intracelulární energetický a stresový receptor, může inhibovat apoptózu zprostředkovanou ROS. Navíc stále více důkazů prokázalo, že inhibice mitogenem aktivovaných proteinkináz (MAPK) by mohla být prospěšná pro inhibici neuronální apoptózy. Další zpráva ukázala, že c-Jun N-terminální kináza (JNK), extracelulárně regulované proteinové kinázy (ERK), signální dráhy p38 MAPK mohou potenciálně regulovat apoptózu neuronů [8,9].

Na základě teorie tradiční čínské medicíny,ledvinanedostatek esence a krevní stáze jsou považovány za základní patogenezi DE. Proto strategie vyživováníledvinya aktivační krev se běžně používá v klinických aplikacích pro DE. Předchozí studie mohly potvrdit, že upravený předpis Wu-Zi-Yan-Zong (MWP), předpis zaměřený na výživuledviny, může zlepšit kognitivní poruchy a chránit neurony snížením toxicity A [10, 11]. Předpis Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), do kterého se pijavice přidává na základě MWP, je speciálně formulován tak, abyživitledvinya aktivovat krev. Nedávné studie ukázaly, že předepisování BSHX může zlepšit syndrom zhoršení paměti pacientů s DM, což naznačuje silné neuroprotektivní vlastnosti [12]. Podrobný farmakologický mechanismus pro BSHX však zůstává nejasný. V této studii se zaměřujeme na pozorování ochranného účinku extraktu BSHX na HG-indukované buňky PC12 a prozkoumání potenciálních molekulárních mechanismů.

Metody

Materiály a činidla

Všechny byliny byly zakoupeny od Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Peking, Čína) a ověřeny Dr. PF Tu, farmakognozikem, podle čínského lékopisu (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5-dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-difenyltetrazolium bromid (MTT) byl od Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA). Testovací souprava laktátdehydrogenázy (LDH) byla zakoupena od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. (Nanjing, Jiangsu, Čína). Dvojitá barvicí souprava akridinová oranž (AO)/ethidiumbromid (EB) a Hoechst 33258 byly získány od společnosti Solar Co., Ltd. (Peking, Čína). Souprava pro stanovení mitochondriálního membránového potenciálu s JC-1,2,7-dichlorfluorescein diacetátem (DCFH-DA) byla zakoupena od Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Čína). Primární protilátky pro kaspázu-3, štěpenou kaspázu-3, PARP, štěpenou PARP, cytochrom C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK a -tubulin byly získány od Cell signaling Technology (Boston, MA, USA).

Příprava extraktu BSHX

BSHX se skládá ze sedmi léčivých složek (tabulka 1). Pro přípravu extraktu BSHX Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) a Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) byly smíchány v poměru 8:8:4:1:2:1:8 a ponořeny do celkového objemu 10krát (v/w) destilované vody na 30 minut , poté vařeno 1 h a znovu 1 h vařeno v celkovém objemu 5x (v/w) destilované vody. Supernatanty byly spojeny a sušeny lyofilizací. Konečný sušený extrakt představoval 25 procent (w/w) hmotnosti surových bylin a vzorek poukázky byl uložen v Moderním výzkumném centru tradiční čínské medicíny, Peking University Health Science Center, Peking, Čína.

Buněčná kultura

Potkaní feochromocytomové buněčné linie (PC12 buňky) byly získány z Peking Union Medical College Cell Bank (Peking, Čína) a pěstovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM) (Macgene, Peking, Čína) doplněném 10 procenty fetálního hovězího séra (Biowest, Francie ) a 1 procento penicilin-streptomycinu (100×, Macgene, Peking, Čína) ve zvlhčeném inkubátoru obsahujícím 95 procent vzduchu a 5 procent CO2 při 37 stupních.

Vzorová léčba

V předběžném testu byly buňky PC12 ošetřeny samotným extraktem BSHX (20, 50, 100 mg/l) po dobu 48 hodin, aby se vyhodnotila cytotoxicita. Pro analýzu neuroprotektivního účinku extraktu BSHX proti neurotoxicitě vyvolané vysokou glukózou (HG) byly buňky PC12 společně ošetřeny extraktem BSHX (20, 50, 100 mg/l) a HG (75 mM) po dobu 48 hodin, po čemž následoval test MTT pro životaschopnost buněk. Všechny ostatní testy byly provedeny za stejných podmínek s rozsahem koncentrace extraktu BSHX od 20 do 100 mg/l.

Test životaschopnosti buněk

Buňky PC12 byly nasazeny do 96-jamkových destiček v hustotě 3,5 × 103 buněk na jamku. Po inkubaci s extraktem BSHX (s nebo bez HG) po dobu 48 hodin byl supernatant odstraněn a byl přidán roztok MTT (0,5 mg/ml). Po inkubaci při 37 stupních po dobu 4 hodin byl MTT roztok odstraněn a buňky byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) pro třepání po dobu 5 minut. Optická hustota (OD) byla měřena při 570 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Životaschopnost buněk (procenta)=[OD (léčba) – OD (prázdná)/ [OD (neléčená kontrola) – OD (slepá)] × 100 procent.

LDH test

Buňky PC12 byly kultivovány a stimulovány k ošetření extraktem HG a BSHX, jak bylo popsáno dříve. Poté byla LDH uvolněná z buněk detekována pomocí komerční LDH soupravy podle instrukcí výrobce. Absorbance byla měřena při 450 nm. LDH (U/L)=[OD (léčba) – OD (slepý)] / [OD (standardní) – OD (slepý)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Barvení Hoechst 33258 a barvení AO/EB

Pro barvení Hoechst 33258 byly buňky fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 30 minut. Poté byly buňky třikrát promyty fyziologickým roztokem s fosfátovým pufrem (PBS) a inkubovány s pracovním roztokem Hoechst 33258 (1 ug/ml) ve tmě po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Snímky byly zachyceny pomocí fluorescenčního mikroskopu (IX73, Olympus, Japonsko) při excitační vlnové délce 352 nm/emisní vlnové délce 461 nm. Pro barvení AO/EB odstraňte médium z 96-jamkových destiček a přidejte směs AO/EB (100 ug/ml AO a 100 ug/ml EB smíchané) po dobu 5 minut ve tmě při pokojové teplotě. Poté byly buňky 3krát promyty PBS. Buňky byly vizualizovány pomocí fluorescenčního mikroskopu při excitační vlnové délce 490 nm/emisní vlnové délce 530 nm pro AO barvení a excitační vlnové délce 520 nm/emisní vlnové délce 590 nm pro EB barvení.

Intracelulární detekce ROS

Pro intracelulární detekci ROS byly buňky PC12 nasazeny do 6-jamkových destiček v hustotě 5 x 105 a podrobeny působení extraktu HG a BSHX po dobu 24 hodin. Po inkubaci 24 hodin byly buňky PC12 třikrát promyty bezsérovým Dulbeccem modifikovaným eagle médiem a přidány do 10μΜ 2',7'-dichlorofluorescein diacetátu (DCF-DA), který je oxidován na fluorescenční 2',7'-dichlorfluorescein (DCF) hydroperoxidy při 37 stupních po dobu 30 minut ve tmě. Poté byly buňky 3krát promyty studeným PBS a resuspendovány v PBS. Intracelulární hladina ROS byla detekována měřením průměrné intenzity fluorescence průtokovou cytometrií (BD FACSCaliburTM, USA). Vlnové délky excitace/emise byly 488/525 nm. Na jeden vzorek bylo započítáno minimálně 10000 událostí. Hodnoty byly vyjádřeny jako průměrná absorbance normalizovaná na procento kontrolní hodnoty.

Test potenciálu mitochondriální membrány

Mitochondriální depolarizace byla hodnocena pomocí komerční testovací soupravy JC{0}}. Po ošetření extraktem HG a BSHX byly buňky inkubovány s pracovním roztokem JC-1 (1x) při 37 stupních po dobu 15 minut ve tmě. Poté odstraňte supernatant a promyjte buňky 2krát roztokem JC-1 pufru (1×). Buňky byly vizualizovány pomocí fluorescenčního mikroskopu při excitační vlnové délce 460 nm/emisní vlnové délce 530 nm pro monomer JC-1 (detekován v buňkách s depolarizovanými mitochondriemi) a excitační vlnové délce 520 nm/emisní vlnové délce 590 nm pro JC{{13 }} polymer (přítomný v polarizovaných mitochondriích). Buňky se zelenou (monomerní) fluorescencí byly považovány za buňky s depolarizovanými mitochondriemi; buňky s červenou (polymerní) fluorescencí byly považovány za buňky s normálními mitochondriemi.

Western blot analýza

Buňky PC12 byly shromážděny a lyžovány ve studeném RIPA pufru s 1x koktejlovým inhibitorem proteázy. Supernatant byl shromážděn vysokorychlostní centrifugací při 12,000 otáčkách za minutu po dobu 10 min při 4 stupních. Koncentrace proteinu byly stanoveny Bradfordovým testem. Cytosol a frakce obohacené o mitochondrie byly izolovány pomocí sady Mitochondria Isolation Kit (Pierce, Rockford, USA) pro analýzu cytochromu c. Pro jiné proteiny byly celkové buněčné lyzáty separovány pomocí SDS-PAGE (10 procent -15 procent) a přeneseny na membrány z polyvinylidenfluoridu (PVDF). Polyvinylidenfluoridové membrány pak byly blokovány 5% odtučněným mlékem a inkubovány s uvedenými primárními protilátkami při 4 stupních přes noc. Membrány byly třikrát promyty PBST (fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, 0,1 procenta Tween 20) a inkubovány se sekundárními protilátkami při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Potom byly membrány promyty PBST ještě třikrát a vizualizovány pomocí vylepšeného chemiluminiscenčního substrátu a skenovány pomocí Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, USA).

Statistická analýza

Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka (SD). Významnost rozdílů mezi středními hodnotami byla stanovena jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím softwaru Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.0). P < 0,05="" ve="" srovnání="" s="" kontrolní="" skupinou="" bylo="" považováno="" za="" statisticky="">

Výsledek

Extrakt BSHX chrání buňky PC12 před poškozením buněk vyvolaným HG

Abychom zjistili, zda extrakt BSHX může chránit buňky PC12 před poškozením HG, ošetřili jsme buňky PC12 řadou koncentrací extraktu BSHX (20, 50 a 100 mg/l) po dobu 48 hodin za podmínek HG (75 mM). Hodnocení viability buněk pomocí testu MTT ukázalo, že poškození HG způsobilo významné snížení životaschopnosti buněk PC12 (životaschopnost buněk byla přibližně 56,9 ± 6,7 procent) a že ošetření extraktem BSHX významně zabránilo buněčné smrti způsobem závislým na koncentraci. Životaschopnost buněk se zvýšila na 87,8 ± 9,2 procent, když byly buňky současně ošetřeny extraktem BSHX (100 mg/l) (obr. 1A). Laktátdehydrogenáza (LDH) se uvolňuje z poškozených buněk a lze ji proto použít také jako indikátor buněčné toxicity. V souladu s výsledky testu MTT jsme zjistili, že poškození HG významně zvýšilo uvolňování LDH z buněk PC12 a že ošetření extraktem BSHX zabránilo uvolňování LDH způsobem závislým na koncentraci (obrázek 1B). Tyto výsledky naznačují, že extrakt BSHX zvyšuje životaschopnost buněk v buňkách PC12 indukovaných HG.

Extrakt BSHX inhibuje apoptózu buněk PC12 prostřednictvím dráhy závislé na kaspáze-9/3-

Ke stanovení účinku extraktu BSHX na buněčnou apoptózu jsme použili barvivo DNA Hoechst 33258 jako citlivý test na apoptózu. Jádra normálních buněk barvená Hoechst 33258 vykazovala jednotnou modrou fluorescenci, zatímco apoptotické buňky, které pyknózou jaderného chromatinu oblakaly, vykazovaly hyperchromatické a husté fluorescenční částice. Procento apoptózy bylo vypočteno podle počtu apoptotických buněk proti celkovému počtu buněk. Naše data odhalila, že urážka HG (75 mM) dramaticky zvýšila podíl apoptotických buněk (51,7 ± 4,3 procenta) a ošetření extraktem BSHX významně chránilo proti apoptóze vyvolané HG v buňkách PC12 (obr. 2A). Tyto výsledky byly dále podpořeny analýzou dvojitého barvení AO/EB. AO vstupuje do normálních i apoptotických buněk a vyzařuje zelenou fluorescenci, zatímco EB vstupuje pouze do apoptotických buněk a emituje červenou fluorescenci [13]. Test AO/EB ukázal, že procento apoptotických buněk se významně zvýšilo po poškození HG (75 mM) (47,8,7 ± 2,6 procenta) a snížilo se po ošetření extraktem BSHX v buňkách PC12 (obrázek 2B), což naznačuje, že extrakt BSHX by mohl účinně inhibují apoptózu buněk PC12 indukovanou HG.

Poté jsme zkoumali účinek extraktu BSHX na dráhu kaspázy-3/PARP, což je důležitá dráha pro apoptózu související s mitochondriemi [14]. Western blot odhalil, že inzult HG (75 mM) významně zvýšil expresi aktivních forem kaspázy-3 a PARP a snížil expresi celkové kaspázy-3 a PARP v buňkách PC12 a tento účinek byl výrazně obrácen ošetřením extraktem BSHX (obrázek 2C), což naznačuje, že extrakt BSHX účinně chránil buňky PC12 proti apoptóze prostřednictvím regulace mitochondriálně závislé kaspázové{10}}/PARP dráhy.

Extrakt BSHX inhibuje intracelulární produkci ROS v buňkách PC12 indukovaných HG

Protože HG mohl zvýšit tvorbu intracelulárních ROS [15], testovali jsme hladinu intracelulárních ROS, abychom určili, zda extrakt BSHX může inhibovat tvorbu ROS. V buňkách PC12, které byly vystaveny 75 mM HG po dobu 48 hodin, bylo ve srovnání s kontrolou pozorováno 3{2}}násobné zvýšení průměrné intenzity fluorescence. Naproti tomu společná léčba extraktem BSHX významně snížila průměrnou intenzitu fluorescence na přibližně 0.76-, 0.{{10}} a 0.{101} {12}}násobek modelové skupiny, v tomto pořadí, což ukazuje, že extrakt BSHX by mohl inhibovat produkci ROS indukovanou HG (obr. 3A, B).

Extrakt BSHX udržuje mitochondriální homeostázu v buňkách PC12 indukovaných HG regulací exprese Bax a Bcl{2}}

Potenciál mitochondriální membrány je důležitým parametrem mitochondriální funkce používaným jako indikátor buněčného zdraví. JC-1 je lipofilní kationtové barvivo, které může selektivně vstupovat do mitochondrií a reverzibilně měnit barvu ze zelené na červenou, jak se zvyšuje membránový potenciál. Ve zdravých buňkách s vysokým mitochondriálním membránovým potenciálem JC-1 spontánně tvoří komplexy známé jako J-agregáty s intenzivní červenou fluorescencí. Na druhou stranu v apoptotických buňkách s nízkým mitochondriálním membránovým potenciálem zůstává JC-1 v monomerní formě, která vykazuje pouze zelenou fluorescenci [16, 17]. Poměr zelené fluorescence k červené fluorescenci tedy může odrážet mitochondriální depolarizaci. V naší studii byl počet buněk s depolarizovanými mitochondriemi (zelená fluorescence) významně zvýšen po HG (75 mM) po dobu 48 hodin a toto zvýšení bylo zvráceno ošetřením extraktem BSHX způsobem závislým na koncentraci (obr. 4A).

Dále jsme detekovali mitochondriální a cytoplazmatické distribuce cytochromu c, klíčového hráče v aktivační dráze apoptózy závislé na kaspáze. Zjistili jsme, že inzult HG (75 mM) po dobu 48 hodin vyvolal dramatickou translokaci cytochromu c z mitochondrií do cytoplazmy a tomuto přemístění bylo významně zabráněno ošetřením extraktem BSHX (obr. 4B), což naznačuje, že extrakt BSHX by mohl inhibovat uvolňování cytochrom c z mitochondrií.

Kromě toho jsou proteiny rodiny Bcl{0}} důležitými regulátory různých apoptotických drah. Bcl-2 může inhibovat buněčnou apoptózu způsobenou řadou cytotoxických faktorů a je inhibitorem uvolňování cytochromu c z mitochondrií do cytoplazmy. Bax jako člen rodiny Bcl-2 je však proapoptózním faktorem. Když je indukována apoptóza, Bax migruje z cytoplazmy do mitochondrií a ničí integritu mitochondrií [5, 18]. V naší studii byla hladina proteinu Bcl-2 downregulována a Bax byl upregulován inzultem HG (75 mM) po dobu 48 hodin, tento účinek byl v závislosti na koncentraci zvrácen extraktem BSHX (obr. 4C). Všechny tyto výsledky výše naznačovaly, že extrakt BSHX chránil buňky PC12 proti mitochondriální depolarizaci vyvolané HG regulací exprese Bax a Bcl-2.

Účinek extraktu BSHX na buněčnou apoptózu prostřednictvím signálních drah JNK/p38 MAPK

Některé studie ukázaly, že zvýšená produkce ROS byla spojena s aktivací MAPK drah, ke spuštění buněčné apoptózy9 [19, 20]. Zkoumali jsme tedy účinek extraktu BSHX na signální dráhu mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK), abychom určili, zda extrakt BSHX může zmírnit apoptózu indukovanou HG. Jak je znázorněno na obrázku 5, inzult HG (75 mM) po dobu 48 hodin zvýšil fosforylace c-Jun NH{9}}terminální kinázy (JNK) a p38 v buňkách PC12, které byly významně inhibovány extraktem BSHX v koncentraci- závislým způsobem. Podobný výsledek však nebyl pozorován s extracelulárně regulovanou proteinkinázou (ERK) MAPK. Výsledky naznačují, že extrakt BSHX by mohl inhibovat apoptózu buněk indukovanou HG prostřednictvím signálních drah JNK/p38 MAPK.

Diskuse

Diabetická encefalopatie (DE) je častou komplikací diabetes mellitus 2. typu (T2DM). Může způsobit kognitivní poškození mozku a je významným rizikovým faktorem mortality a invalidity u pacientů s diabetes mellitus 2. typu na celém světě [3]. Proto je důležité studovat mechanismus DE, stejně jako jeho preventivní a léčebné strategie.

V Číně se tradiční čínská medicína (TCM) používá k léčbě DM již řadu let a vykazuje léčebný účinek. Některé klinické studie naznačují, že TCM založené na vyživování ledvin a aktivaci krevních strategií mohou snižovat hladinu glukózy v krvi, podporovat oběh a zlepšovat kognitivní dysfunkci mozku. Předpis BSHX je zástupcem těchto TCM. Naše předběžná klinická studie ukázala, že předepisování BSHX by mohlo účinně zlepšit hladinu glukózy v krvi, homocystein (HCY) a vysoce citlivý C-reaktivní protein (hs-CPR) v séru a zlepšit kognitivní funkce diabetických pacientů s mírnou kognitivní poruchou (MCI). [12]. Dosud však chybí důkazy, které by prokázaly účinnost a farmakologický mechanismus.

V této studii jsme zjistili, že extrakt BSHX by mohl zmírnit snížení životaschopnosti buněk vyvolané HG, jak bylo měřeno pomocí MTT, LDH testu. Abychom dále prozkoumali ochranný účinek extraktu BSHX na životaschopnost buněk, studovali jsme apoptózu pomocí Hoechst 33258 a analýzu barvení AO/EB. Výsledky ukázaly, že extrakt BSHX by mohl významně snížit apoptózu indukovanou HG. Jako marker apoptózy byly kaspáza-3 a PARP významně zvýšeny po léčbě HG, ale aktivace těchto proapoptotických faktorů byla inhibována extraktem BSHX způsobem závislým na koncentraci. Výše uvedené výsledky ukázaly, že extrakt BSHX měl ochranný účinek na poškození buněk PC12 vyvolané HG.

ROS vzniká při procesu oxidativní fosforylace buněk a jeho zvýšení produkce nebo poškození antioxidačních systémů může vést k oxidativnímu stresu v buňkách [21]. Studie ukázaly, že vysoká hladina glukózy by mohla vést k akumulaci intracelulárních ROS a nakonec k aktivní apoptotické signální dráze. A společným mechanismem diabetických komplikací je oxidační stres [22, 23]. Naše výsledky ukázaly, že vysoká hladina glukózy by mohla vést ke zvýšení ROS v buňkách PC12, což bylo v souladu s předchozími studiemi [24]. Spekuluje se, že toxicity vysoké hladiny glukózy pro buňky lze dosáhnout apoptózou indukovanou ROS. Mitochondrie jsou hlavními místy intracelulární produkce ROS a také hlavním cílovým orgánem pro útok ROS [25]. Za patologických podmínek může rychlý nárůst ROS vyústit v mitochondriální dysfunkci, kolaps potenciálu mitochondriální membrány a případně vést k buněčné apoptóze [26]. Takže jsme detekovali integritu mitochondrií. Naše výsledky ukázaly, že vysoká hladina glukózy významně snížila potenciál mitochondriální membrány, zvýšila poměr Bax/Bcl-2, který kontroloval přepnutí pórů přechodu mitochondriální permeability (MPTP), a podpořil únik cytochromu c, zatímco extrakt BSHX mohl zvrátit tyto změny. Ty naznačují, že neuroprotektivum extraktu BSHX proti buňkám PC12 indukovaným HG může být výsledkem zachování integrity mitochondrií.

Signální dráha MAPK také hraje důležitou roli v buněčné apoptóze. JNK, ERK a p38 MAPK jsou nejstudovanějšími členy rodiny MAPK. Jejich hlavním způsobem působení je fosforylovat jejich specifická místa, a tím regulovat buněčnou apoptózu [8, 27, 28]. Kromě toho studie prokázaly, že nadměrná produkce ROS může vyvolat fosforylaci p38MAPK [29-31] a ROS může indukovat nebo zprostředkovat aktivaci drah MAPK [32]. Několik buněčných stimulů, které indukují produkci ROS také paralelně, může aktivovat dráhy MAPK ve více typech buněk [32, 33]. Potenciální mechanismy aktivace MAPK pomocí ROS mohou zahrnovat inaktivaci a degradaci fosfatáz MAPK, které udržují dráhu v neaktivním stavu [19]. Na druhé straně, aby se dále potvrdilo, zda byly dráhy MAPK aktivovány generováním ROS, byly buňky předem ošetřeny antioxidanty (např. NAC, ROS scavenger), aby se zabránilo akumulaci ROS. A výsledky ukázaly, že aktivace MAPK byla téměř inhibována po buněčné stimulaci buněčnými stimuly [32, 33], což ukazuje na zapojení ROS inaktivace MAPK drah. Studie navíc ukázaly, že když byly buňky ošetřeny specifickým inhibitorem JNK SP600125, mohla být apoptóza indukovaná kardiotoxinem III blokována [34]. Naše předchozí studie zjistila, že modifikovaný předpis Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) by mohl inhibovat aktivaci ERK/p38 MAPK v mikroglii BV2 aktivované A [10]. V této studii jsme však zjistili, že extrakt BSHX může inhibovat fosforylaci JNK a p38 MAPK a stejného výsledku jsme nedosáhli s p-ERK. Spekulujeme, že pijavice hrají v extraktu BSHX jinou roli. Výsledky naznačují, že dalším ochranným mechanismem BSHX extraktu proti apoptóze v HG-indukovaných buňkách PC12 může být regulace signálních drah JNK/p38 MAPK.

Závěr

Extrakt BSHX, polybylinná formule, vykazuje neuroprotektivní účinky na buňky PC12 proti poškození HG. Extrakt BSHX účinně inhiboval apoptózu buněk PC12 indukovanou HG prostřednictvím snížení intracelulární tvorby ROS, zachování integrity mitochondriální membrány a blokování signálních drah kaspázy-3 a JNK/p38 MAPK (obrázek 6). Naše zjištění společně naznačují, že extrakt BSHX je slibným prostředkem pro léčbu DE v klinických aplikacích.

Autorské příspěvky

Vymyslel a navrhl experimenty: Zeng KW, Wang XM. Provedl experiment: Zhao SY. Analyzovaná data: Zhao SY, Zeng KW a Wang XM. Přispěla činidla/materiály/nástroje pro analýzu: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW a Wang XM. Napsal pater: Zhao SY.

Reference

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS a kol. Diabetický mozek a kognice. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Poranění mozku s diabetes mellitus: důkazy, mechanismy a léčebné důsledky. Expert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. Teorie "metabolické paměti" a včasná léčba hyperglykémie v prevenci diabetických komplikací. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Potenciál mitochondriální membrány (Δψm) v apoptóze; aktualizace. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Propojení mitochondriální dynamiky a událostí života a smrti prostřednictvím proteinů rodiny Bcl-2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, et al. Mitochondrie a buněčná smrt. Mechanistické aspekty a metodologické problémy. Únor J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, a kol. 1,25-(OH)2D3 inhibuje vysokou glukózou indukovanou apoptózu a produkci ROS v lidských peritoneálních mezoteliálních buňkách prostřednictvím MAPK/P38 dráhy. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, et al. Předběžné ošetření nervovým růstovým faktorem zeslabuje nedostatek kyslíku a glukózy indukovanou c-Jun amino-terminální kinázu 1 a aktivaci stresem aktivovaných kináz p38 a p38 a poskytuje neuroprotekci v modelu feochromocytomu PC12. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J a kol. Účast kaspázy-3 a mitogenem aktivované proteinkinázy p38 v apoptóze vyvolané chloridem kobaltnatým v buňkách PC12. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF a kol. Antineurozánětlivé účinky modifikovaného předpisu Wu-Zi-Yan-Zong v mikroglii BV2 stimulované amyloidem prostřednictvím signálních drah NF-κB a ERK/p38 MAPK. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H a kol. Modifikovaný předpis Wu-Zi-Yan-Zong, tradiční čínský polybylinný vzorec, potlačuje neurozánětlivé procesy vyvolané lipopolysacharidy v potkaních astrocytech prostřednictvím signálních drah NF-KB a JNK/p38 MAPK. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, a kol. Účinek předpisu Bushen Huoxue na léčbu mírné kognitivní poruchy u diabetu 2. typu. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P a kol. Analýza cykloheximidem indukované apoptózy v lidských leukocytech: Fluorescenční mikroskopie s použitím annexinu V/propidium jodid versus akridinová oranž/ethidium bromid. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, et al. Kaspázy spojují signalizaci buněčné smrti s homeostázou organismu. Imunita 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Oxid dusnatý: klíčový faktor za dysfunkcí endoteliálních progenitorových buněk u diabetes mellitus typu-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, et al. JC-1: Alternativní excitační vlnové délky usnadňují cytometrii mitochondriálního membránového potenciálu. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Mitochondriální membránové potenciálové sondy a protonový gradient: praktický návod k použití. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Jak BCL-2 proteiny indukují permeabilizaci mitochondriální vnější membrány? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH a kol. Mitogenem aktivované proteinkinázy a reaktivní formy kyslíku: jak může ROS aktivovat dráhy MAPK? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, a kol. Aromatické heterocyklické estery podofylotoxinu vykazují anti-MDR aktivitu v buňkách lidské leukémie K562/ADR prostřednictvím signální dráhy ROS/MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Cílení na glykogensyntázovou kinázu-3 pro terapeutický přínos proti oxidativnímu stresu u Alzheimerovy choroby: zapojení dráhy Nrf2-ARE. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Role oxidačního stresu u diabetické neuropatie: Generace volných radikálů v glykační reakci a genové polymorfismy kódující antioxidační enzymy na genetickou náchylnost k diabetické neuropatii v populaci pacientů s diabetem I. typu. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA a kol. Buněčná smrt, reaktivní formy kyslíku (ROS) a diabetické komplikace. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD a kol. Ginkgolid B inhibuje apoptózu v endoteliálních buňkách lidské pupečníkové žíly stimulovaných vysokým obsahem glukózy. Chinese Pharmacological Bulletin 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Škodlivá role superoxiddismutázy v mitochondriálním mezimembránovém prostoru. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, podlaží KB. Mitogenem aktivované proteinkinázy: nové signální dráhy fungující v buněčných odpovědích na environmentální stres. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, a kol. MiR-125b působí jako onkogen v glioblastomových buňkách a inhibuje buněčnou apoptózu prostřednictvím drah nezávislých na p53 a p38MAPK. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, a kol. Koncové produkty pokročilé glykace indukují apoptózu epiteliálních buněk lidské rohovky prostřednictvím generování reaktivních forem kyslíku a aktivace drah JNK a p38 MAPK. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH a kol. Ghrelin inhibuje apoptózu v hypotalamických neuronových buňkách během nedostatku kyslíku a glukózy. Endokrinologie 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A mění regulační proteiny buněčného cyklu a indukuje apoptózu prostřednictvím aktivace p38MAPK závislé na reaktivních formách kyslíku v buněčné linii MCF lidského karcinomu prsu-7. Biologie nádorů 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L a kol. Oxidativní poškození vyvolané ROS zapojené do patogeneze houbové keratitidy prostřednictvím aktivace p38 MAPK. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Aktivace signálních drah MAP kinázy indukovaná reaktivními druhy kyslíku. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redoxní signalizace a MAP kinázové dráhy. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Kardiotoxin III indukuje apoptózu závislou na c-jun N-terminální kináze v HL-60 lidských leukemických buňkách. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.