Nano-mléčné proteinovo-slizové komplexy: Charakterizace a protirakovinný účinek Část 1

Pro více informací kontaktujtetina.xiang@wecistanche.com

Abstraktní: TheprotirakovinnéAktivita přírodních sloučenin v poslední době přitahuje multidisciplinární výzkum. V této studii byla zkoumána komplexace mléčných proteinů (MP) s isabgolovým slizem (IHM) a slizem Ziziphus Spina Christi (NabM). V této souvislosti byly měřeny fyzikálně-chemické vlastnosti slizových komplexů mléčné bílkoviny (MPMC) včetně pH, Carrova indexu, rozpustnosti ve vodě a indexů absorpce vody a bylo studováno tokové chování. Navíc aminokyselinový profil, stravitelnost bílkovin a fenolické aflavonoidyObsah MPMC byl zkoumán a mikrostruktura komplexů byla vizualizována pomocí transmisní elektronové mikroskopie. Theantioxidanta protirakovinné účinnosti MPMC proti dvěma rakovinným buněčným liniím, lidskému karcinomu jater HEPG-2 a karcinomu prsu MCF-7, ve srovnání se dvěma normálními buněčnými liniemi, jmenovitě Bj-1 a MCF{{ 3}}F, byly testovány pomocí testu příjmu neutrální červené. Výsledky odhalily, že MPMC má vychytávající aktivitu proti radikálům DPPH, ABTS a HS. Kromě toho má MPMC potenciál zabránit poškození DNA vyvolanému oxidačním stresem v reakci typu Fenton. Výsledky testu neutrální červeně ukázaly významnou inhibici růstu jak HEPG-2, tak MCF-7, zatímco proti Bj-1 a MCF-12F nebyl zjištěn žádný významný cytotoxický účinek. Výsledky RT-qPCR naznačovaly apoptózu stimulovanou MPMC, jak se ukázalo pomocí upregulace markerů genu pro apoptózu Caspase{11}}, p53, Bax. Mezitím byl anti-apoptózový Bcl-2 gen downregulován. U normálních buněčných linií léčených MPMC však nebyl pozorován žádný významný rozdíl. Závěrem lze říci, že MPMC lze považovat za slibnou protirakovinnou entitu, kterou lze použít při vývoji nových protinádorových léčiv se srovnatelnou aktivitou a minimálními vedlejšími účinky ve srovnání s konvenčními chemoterapiemi rakoviny .

Klíčová slova: mléčné bílkoviny; isabgolský sliz z plev; Nabeq sliz; mléčné proteiny, slizové komplexy; protirakovinná aktivita

Kliknutím se dozvíte více o produktech

1. Úvod

Rakovinaje hlavní příčinou úmrtí na celém světě s přibližně 10 miliony úmrtí v roce 2020 [1]. Včasná diagnostika a vývoj nových terapeutik je jedinou nadějí, jak rakovinu porazit. Konvenční léčba rakoviny, jako je chemoterapie a ozařování, je poměrně drahá a doprovázená významnými vedlejšími účinky.

Proto vědecký a výzkumný zájem směřuje k využívání přírodních sloučenin (tj. proteinů, polysacharidů a polyfenolů) z jejich zdrojů, které mají antikarcinogenní potenciál, protože se u nich ve srovnání s konvenčními způsoby léčby předpokládá, že mají méně toxické vedlejší účinky.

Polysacharidyz rostlinných zdrojů je v poslední době věnována zvýšená pozornost kvůli jejich bioaktivním vlastnostem [2,3]. Řada studií se zajímala o izolaci bioaktivních polysacharidů a polyfenolů z přírodních rostlinných zdrojů, jako je ovoce, zelenina, obiloviny a bylinky, kvůli jejich příznivým farmakologickým účinkům [4].

Plantago ovata (Psyllium nebo Isabgol) a Ziziphus Spina-Christi (Nabeg nebo Sidr) jsou známými zdroji bioaktivních polysacharidů. IHM a NabM byly vybrány jako slibné bioaktivní materiály. Předchozí studie ukázaly, že komplexy IHM a NabM s mléčnými proteiny zlepšily funkci jater a snížily riziko kardiovaskulárních onemocnění[5]. Slupka isabgolu se ukázala jako účinná při léčbě průjmu, zácpy, ulcerózní kolitidy, syndromu dráždivého tračníku, hypercholesterolémie a cukrovky. Navíc protirakovinný účinek slupky isabgolu proti kolorektálnímu karcinomu byl připisován obsahu vlákniny, která snižuje jeho účinky zkrácením doby průchodu. To povede ke snížení metabolismu žluči střevní mikroflórou, zředění žlučových kyselin objemovým objemem stolice, ke změně metabolismu mikrobiálních žlučových kyselin v důsledku fermentace vlákniny, snížení pH a produkci mastných kyselin s krátkým řetězcem nebo přímou vazbou na žlučových kyselin a tím brání jejich metabolismu [6]. Hlavními biologicky aktivními složkami Ziziphus Spina-Christi jsou vitamín C, fenoly, flavonoidy a triterpenové kyseliny. Jeho bioaktivity zahrnují protirakovinné, antibakteriální, antidiabetické, antiproliferativní a antioxidační aktivity [7. Slupka isabgolu a plody Nabeq se používají k výrobě slizu slupek Isabgol (IHM) a slizu Nabeq (NabM) [5].

Na druhou stranu, terapie rakoviny na bázi proteinů získaly stále větší zájem kvůli klíčovým vlastnostem, jako je nízká cytotoxicita, silná specificita a snadná modifikace [8]. Kromě zajištění nutričních potřeb esenciálních aminokyselin patří mléčné proteiny mezi biologické makromolekuly, které mají mnoho funkčních vlastností, jako jsou antioxidační, imunomodulační, antidiabetické, antimikrobiální a protirakovinné vlastnosti [9,10]. Například protirakovinná aktivita peptidů získaných z mléka (tj. -kasomorfinů izolovaných z -kaseinu a 1-fragmentů kaseinu 90-95 a 90-96[Arg90-Tyr-Leu -Gly-Tyr-Leu95-(Glu96)]) identifikované v hovězím mléce podporují předpoklad, že mléčné bílkoviny mají nejen nutriční hodnotu, ale mají také potenciál pro prevenci a léčbu rakoviny [11,12]

Komplexace mezi mléčnými proteiny a polysacharidy, jako je komplex mléčných proteinů a chitosanu, byla dříve vyráběna jako pokus o zlepšení funkčních vlastností jejich přirozených složek [13]. Vzhledem k dostupnosti a snadné přípravě mají takové komplexy potenciál pro použití při vývoji levnějších protirakovinných terapií. Taková terapeutika budou levnější a budou vykazovat srovnatelnou aktivitu jako v současnosti používaná chemoterapeutika.

Nekovalentní vazba prostřednictvím hydrofobních a elektrostatických interakcí je primárním faktorem asociace mléčných bílkovin spolysacharidy[14]. Proteiny navíc vykazují překvapivou odolnost vůči interakci s jinými složkami v rozmezí pH od 2 do 11. Při specifickém pH se povrchová reaktivita proteinu zvyšuje prostřednictvím rozvinutí proteinové struktury [15].

V této souvislosti se naše skupina nedávno zaměřila na funkční roli komplexů mléčných bílkovin na lidské zdraví. Komplexy mléčné bílkoviny s IHM nebo NabM však vykazují antihyperlipidemické a jaterní ochranné vlastnosti [9]. Na základě předchozích studií se tedy předpokládalo, že komplexy mléčných proteinů a polysacharidů mohou mít zajímavou protirakovinnou aktivitu. Kromě toho žádná publikace neprovedla studii protirakovinné aktivity komplexů mléčných proteinů s IHM a NabM. Hlavním cílem této studie proto bylo charakterizovat fyzikálně-chemické vlastnosti nově vyrobených slizových komplexů mléčné bílkoviny, včetně profilu aminokyselin a funkčních vlastností těchto komplexů. Kromě toho byla zkoumána protirakovinná aktivita komplexů mléčných proteinů s IHM a NabM slizem proti dvěma lidským rakovinným buňkám (MCF7 a HEPG2) ve srovnání s nerakovinnými buněčnými liniemi (Bi-1 a MCF-12F ). Osvětlili jsme také způsob působení produkovaných slizových komplexů mléčných proteinů.

2. Výsledky a diskuse

2.1. Fourier-Transform Infrared (FTIR) spektroskopie

Infračervená spektra IHM, MP a MP/IHM jsou znázorněna na obrázku 1A. Spektrum IHM ukázalo charakteristický pás arabinoxylanů při 100-1200 cm-1 a pásy pro skupiny amidu I a amidu II při 1550 a 1650 cm-1, v daném pořadí. MP spektrum ukazuje pásy při 1700-1600 a 1200-900 cm-I odpovídající amidu I (hlavně C=O napínání proteinů) a mléčných sacharidů, v daném pořadí [16]. Výše uvedené píky IHM a MP byly rezervovány ve spektru komplexu IHM/MP. Podobně byly charakteristické pásy kyseliny galakturonové v NabM zachovány ve spektru komplexu NabM/MP (obrázek 1B). To by naznačovalo absenci chemické interakce mezi polysacharidovým slizem a MP a potvrdilo by tak navrhovaný mechanismus elektrostatické přitažlivosti mezi MP a polysacharidy (IHM a NabM). Taková pozorování jsou v souladu s pozorováními Vukica et al, kteří uvedli tvorbu komplexu mezi bílkovinami syrovátkového mléka a pektinem prostřednictvím elektrostatických a hydrofobních interakcí, které vedly k dobré konzistenci komplexu [17].

2.2. Fyzikálně-chemické a funkční vlastnosti MP a MPMC

Hodnoty sypné hmotnosti (BD), setřesné hmotnosti (TD), Carrova indexu a měření pH jsou uvedeny v tabulce 1. BD a TD MP byly vyšší než IHM a IHM měly nejnižší objemovou a setřesnou hustotu z testovaných vzorků. . Podobně měl komplex MP/IHM významně (str<0.05) lower="" bulk="" and="" tapped="" density="" compared="" to="" mp/nabm.="" the="" obtained="" results="" indicated="" that="" the="" distribution="" and="" solubility="" of="" mp="" have="" been="" improved="" by="" complexation="" with="" the="" ihm.="" carr's="" index="" is="" frequently="" used="" as="" an="" indication="" of="" the="" flowability="" of="" powders.="" the="" results="" in="" table="" 1="" show="" that="" carr's="" index="" of="" mpmc="" was="" significantly="" lower="" than="" ihm="" which="" indicated="" that="" nabm="" improved="" the="" flowability="" of="" mp.="" this="" was="" probably="" due="" to="" the="" lower="" carr's="" index="" value="" of="" mp(30.6±="" 0.10%)="" compared="" to="" ihm="" and="" nabm="" (57.58±0.14="" and="" 53.97±0.11%,="" respectively)which="" are="" vicious.ihm="" is="" alkaline="" (7.79="" ph)="" while="" mp="" and="" the="" complexes="" with="" polysaccharide="" mucilage="" were="" slightly="" acidic="" which="" came="" in="" accordance="" with="" previously="" reported="" results="">

WSI a WAI jsou důležité funkční prvky v potravinářské technologii. Tabulka 1 ukazuje, že WSI a WAI MP se významně zvýšily po komplexaci s IHM a NabM. Nejpravděpodobněji to bylo proto, že materiály na bázi Isabgolu jsou vysoce rozpustné ve vodě se zahušťujícím účinkem po přidání adekvátního množství vody [19]. Navíc Qaisrani et al. uvedli, že arabinoxylany ze slupek Isabgol mají schopnost zadržovat vodu až desetinásobně vyšší než jejich suchá hmotnost [20]. Navíc MP/IHM má vyšší WSI a WAI než MP/NabM, protože IHM má vyšší WSI a WAI než NabM. Navíc zvýšení procenta WSI pro MPMC ve srovnání s MP vedlo ke zvýšení disperzibility cílových aktivních složek při jejich použití v terapeutických otázkách [21]. To bylo zřejmé z protirakovinných výsledků, které prokázaly, že tyto komplexy mají cytotoxický účinek než MP.

2.3. Bioaktivní složky

2.3.1. Fenolické sloučeniny PHM a NabM

Jídlo obsahuje velmi důležité bioaktivní sloučeniny (tj. fenolické a flavonoidy), které působí jako antioxidační a protirakovinné potence. HPLC analýza potvrdila a kvantifikovala přítomnost mnoha fenolických sloučenin v Nab a IHM, jak ukazuje obrázek 2. Výsledky ukazují vysoký obsah různých biologicky aktivních sloučenin, jako je kyselina gallová (177,96 mg/kg), katechol (13,87 mg/kg) Kyselina p-hydroxybenzoová (24,02 mg/kg), katechin (5,93 mg/kg) a rutin (123,70 mg/kg) v extraktu PHM a katechol (410,72 mg/kg) kyselina p-hydroxybenzoová (426,71 mg/kg) chlorogen (72,05 mg/kg) rutinu (1750,57 mg/kg) a rosemarinové (1771,72 mg/kg) v NabM (obrázek 2A,B). Obsah těchto sloučenin je velmi důležitý pro zdravotní přínosy. Již dříve byl popsán protirakovinný účinek fenolických sloučenin. Tento účinek byl připisován především antioxidačnímu účinku těchto sloučenin.

2.3.2. Celková fenolová, flavonoidní a antioxidační aktivita MP a MPMC

Několik zpráv naznačilo, že sloučeniny, které vykazují antioxidační vlastnosti, většinou vykazují protirakovinnou aktivitu[22]. Celkový obsah fenolických (TP) a celkových flavonoidů (TF) byl stanoven v NabM, IHM, MP a jejich komplexech (obrázek 3A, B). Výsledky ukázaly, že TP a TF byly vyšší u NabM a MP/NabM ve srovnání s IHM a MP/IHM. Obsah TP a TF byl však významně nižší v MP ve srovnání s MPC. Tyto výsledky byly v souladu s údaji publikovanými Singhem et al.[23] kteří zjistili, že TP a TF NabM byly 1,6 mg GAE/100 g suché hmotnosti a 47 mg CE/100 g suché hmotnosti. Komplexy MP/NabM a MP/IHM vykázaly významný nárůst o 309 procent a 59 procent u TP a 476 procent a 123 procent u TF ve srovnání s MP. Konjugace MP s IHM a NabM vedla ke ztrátě 23 procent a 36 procent TPC odpovídajících IHM a NabM, v daném pořadí. TF byla snížena o 44 procent u IHM a 46 procent u NabM, když byl komplexován s MP. To bylo s největší pravděpodobností způsobeno nízkým TP a TF MP.

Potenciální aktivita vychytávání radikálů MP/IHM a MP/NabM ve srovnání s MP za použití DPPH, ABTS a HS je znázorněna na obrázku 3C-E. Údaje získané z aktivity tří antioxidantů měly podobný trend, což naznačuje, že NabM vykazoval vyšší antioxidační aktivitu než IHM, a to v kontextu výsledků fenolických a

obsah flavonoidů. Antioxidační kapacita MP byla zvýšena po komplexaci s NabM a IHM. S výjimkou testu ABTS se antioxidační aktivita NabM zvýšila konjugací s MP. Antioxidační aktivita ukázala, že MPMC měla vyšší antioxidační aktivitu ve srovnání s MP. Naše hypotéza ukazuje na možnou interakci mezi MP a polysacharidy, která vede k získání potenciální antioxidační aktivity, jak je popsáno v Li et al. [24]. Již dříve bylo hlášeno, že existuje pozitivní korelace mezi vychytávací kapacitou a obsahem fenolů/flavonoidů 5]. Nemůžeme však vyloučit, že jsou produkovány nové bioaktivní peptidy obohacené o aminokyseliny obsahující síru, což vysvětluje vysokou antioxidační aktivitu MPMC ve srovnání s nekomplexními složkami. Malé peptidy se navíc uvolňují ve frakcích syrovátky, což ovlivňuje vysoké antioxidační vlastnosti [4]. A konečně, obsah fenolů a flavonoidů ovlivňuje různé rakovinné buňky. Navíc byly tyto aktivity a mechanismy pozorovány během in vitro testů na buněčných kulturách. Antioxidační a protirakovinné aktivity fenolických látek jsou připisovány dvojným vazbám a hydroxylovým substitucím na aromatických kruzích [25].

2.4. Aminokyselinový profil MP a MPMC

Aminokyselinové profily MP, NabM, MP/IHM a MP/NabMare znázorněné na obrázku 4. V aminokyselinových profilech MP a jeho komplexů s IHM a NabM nebyly žádné významné rozdíly. To ukazuje, že nekovalentní interakce MP s polysacharidovým slizem nezměnila složení mléčných proteinů. Výsledky ukazují vysoký obsah kyseliny glutamové v MP a MPMC (obrázek 4) [26].

2.5. Reologické vlastnosti MP a MPMC

2.5.1. Zjevná viskozita

Obrázek S1 ukazuje viskozitu proteinových vzorků při různých hodnotách otáček za minutu. IHM a NabM měly vysokou viskozitu při pomalé rotaci, ale viskozita významně klesala, když se rychlost rotace zvyšovala. Tato zjištění byla ve shodě s Chenem a Che, kteří zaznamenali, že zjevná viskozita ve vodě rozpustného slizu zeleného lavoru (Monostroma iridium) se snižovala zvýšením rychlosti smyku [27].

Výsledky na obrázku S1 také ukazují, že komplexace MP s IHM a NabM vedla k významnému zvýšení (p menší nebo rovno 0,05) zjevné viskozity MP. To lze přičíst jedinečným vlastnostem IHM (hydrokoloidního materiálu), který má účinek zvyšující viskozitu [28].

2.5.2. Chování toku

Chování toku (křivky smykové napětí/rychlost smyku) mléčných proteinů a jejich komplexů je znázorněno na obrázku S2. Se zvýšením smykové rychlosti se zvýšilo smykové napětí. Transformací dat smykového napětí a smykové rychlosti na mocninnou rovnici jsou hodnoty indexu konzistence toku (K) a indexu chování toku (n) uvedeny v tabulce S1. Nejvyšší index konzistence toku měly IHM a MP/IHM. To může být způsobeno vysokou viskozitou ve vodě rozpustného slizu IHM díky jeho vysoké kapacitě zadržování vody a gelovatění ve vodném médiu. Výsledky také ukázaly, že IHIM, NabM a MP/IHM měly chování při ztenčování smykem (nenewtonské tekutiny) s nízkou hodnotou n v rozmezí od 0,25 do 0,64. Tyto výsledky byly v souladu s Thanatchou a Praneem, kteří studovali fyzikálně-chemické vlastnosti Ziziphus mauritiana[29]. Na druhou stranu, hodnota n MP byla přibližně 1 (0,99), což ukazuje na newtonovský tok. Podobně hodnota n pro komplex MP/NabM byla 0,95, jak je uvedeno v tabulce S1.

2.6. Diferenciální skenovací kalorimetrie MP a MPMC

Diferenciální skenovací kalorimetrie byla použita ke zkoumání tepelné stability MP a jeho komplexů s IHIM a NabM. Termogramy MP a MPMC jsou znázorněny na obrázku S3 a parametry DSC jsou uvedeny v tabulce 2. Bylo pozorováno, že na termogramu MP nebyl žádný jasný endotermický pík, ale byl zde výrazný endotermický pík pro MP/IHM a široký endotermický pík pro MP/NabM. To je pravděpodobně způsobeno postupnou eliminací volné vody, teplotou tání NabM, pomalou gelací a denaturací proteinů [30].

Bylo také zaznamenáno, že MPMC byl tepelně stabilnější než protein bez komplexu, jak bylo pozorováno nízkou denaturační teplotou MP (101,44 stupně) ve srovnání s MP/IHM a MP/NabM (148,24 a 121,4 stupně, v tomto pořadí), jak je uvedeno v tabulce 2. Navíc byla zaznamenána teplota degradace MP 302,3 stupně, zatímco při zvýšení teploty až na 350 °C nebyla pozorována žádná degradace MPMC. Tato zjištění byla v souladu s několika studiemi, které zjistily, že tepelná stabilita mléčných proteinů se zvýšila interakcí s fenolickými sloučeninami, které zabraňovaly agregaci proteinů [2,31].

Teplo, které během reakce prochází do systému nebo ze systému, je entalpie (AH). Vyšší entalpie MP/IHM a MP/NabM ve srovnání s nekomplexovaným MP by mohla být způsobena potenciální chemickou reakcí mezi mléčnými proteiny (syrovátkou a kaseinem) a mezi mléčnými proteiny a polysacharidy při vysoké teplotě (Maillardova reakce)[ 31.

2.7. Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) MP a MPMC

Obrázek 5 ukazuje mikrostrukturu IHM, NabM, MP a MPMC. Bylo zjištěno, že velikost částic MPMC byla v nanorozsahu (114-250 nm) a byla menší než velikost částic MP (191-300 nm). Navíc TEM MPMC (obrázek 5D, E) odhalil rozvětvený vzor vytvořených komplexů. To lze přičíst elektrostatické přitažlivosti mezi mléčnými proteiny a polysacharidy Goh, et al. [32]. Navíc větší rozvětvená struktura MP/IHM ve srovnání s MP/NabM může být zodpovědná za jeho vyšší viskozitu, jak je znázorněno na obrázku S1.

2.8. Biologické studie na MP a MPMC

2.8.1. Protirakovinná aktivita MP a MPMC

Cytotoxický účinek různých koncentrací (1, 5, 10 a 20 ug/ml) MP a MPMC na buňky HepG-2 a MCF-7 ve srovnání s MCF-12F a Bij{ {7}} normální buňky jsou znázorněny na obrázcích 6 a 7. MPMC vykazovaly protirakovinný účinek na buňky HepG-2 a MCF-7 Obrázek 6A, respektive B. Křivka závislosti na dávce vykazovala snížení životaschopnosti buněk v reakci na vyšší koncentrace. Na druhé straně nebyl pozorován žádný významný cytotoxický účinek MP a MPMC na normální buňky Bj-1 a MCF-12F (obrázek 6C, D). Naše výsledky také ukázaly, že MP/NabM měl vyšší protirakovinnou aktivitu proti rakovinným buněčným liniím HepG-2 a MCF{18}} s hodnotami IC50 5,13 a 10,07 ug/ml, v daném pořadí. Navíc MP/IHM vykazoval mírný cytotoxický účinek proti rakovinným buněčným liniím ve srovnání s příslušnými kontrolami. Celkově naše cytotoxická data naznačují, že komplexace MP s IHM a NabM významně zvyšuje protirakovinnou aktivitu ve srovnání s nekomplexovanými mléčnými proteiny, jak ukazuje tabulka 3. Bylo také evidentní, že Hep G-2 buňky byly citlivější na MP a MPMC ve srovnání s buňkami MCF-7, což se projevuje nižšími hodnotami IC50.

Protirakovinný účinek protinádorových peptidů odvozených z mléčné bílkoviny byl již dříve popsán. V této souvislosti Jeong a Hong [33] pozorovali, že trypsinové hydrolyzáty -laktalbuminu měly cytotoxický účinek na buněčné linie lidského karcinomu kostí SJSA-1, lidského kolorektálního karcinomu HCT 116 a lidského karcinomu žaludku NCI-N87. Bylo zjištěno, že o-laktalbumin interaguje s modulátory buněčného povrchu a mění rychlost buněčného růstu, intracelulární vápník a rychlost transportu vápníku [34]. Stojí za zmínku, že bovinní laktoferin indukoval apoptózu v buňkách MCF7 způsobem závislým na dávce [35]. Navíc kaseinové a syrovátkové proteinové frakce mléka vykazovaly protinádorové účinky na zvířecím modelu a také antiproliferativní aktivitu in vitro [36]. Navíc Elzoghby a spol.[37] uvedli, že kaseinové nanočástice mohou být použity k zapouzdření hydrofobního protirakovinného léku, flutamidu, ke kontrole uvolňování léku, zlepšení jeho protinádorové aktivity a snížení jeho hepatotoxicity.

Již dříve byl popsán protirakovinný účinek IHIM a NabM [6,38]. Cytotoxický účinek MP a MPMC lze přičíst přítomnosti aminokyselin, jako je glutamin, arginin a cystein, o kterých se uvádí, že vykazují protirakovinnou aktivitu proti kolorektálnímu karcinomu [39]. Tyto výsledky jsou v souladu s vysokým obsahem kyseliny glutamové v MPMC (obrázek 5).

2.8.2. Stanovení hladiny proteinů p53, Bax, kaspázy-3 a Bd{5}}

Aby bylo možné prozkoumat mechanismus cytotoxicity MPMC, byla v HepG-2, MCF-7 stanovena hladina markerových proteinů apoptózy p53, Bax, kaspáza-3 a Bcl-2 , Bj-1 a MCF-12F buněčné linie ošetřené IC0 MPMC (obrázek 8). Hladina pro- a antiapoptotických markerů je spojena s indukcí apoptózy v rakovinných buněčných liniích [40,41]. Výsledky ukázaly, že MP/NabM a MP/IHMenhanced apoptosis v HepG-2 a MCF-7, ale ne v MCF-12F a Bj-1 buněčných liniích. Hladina kaspázy-3, p53, Bax se významně zvýšila ve srovnání s příslušnými kontrolami (obrázek 8), zatímco protein Bcl{20}} byl snížen ve všech léčbách. Je zajímavé, že MP také vykazoval významnou změnu v markerech proteinu apoptózy. To bylo v souladu s výsledky protirakovinné studie a mohlo by to být označováno jako cytotoxický účinek řady peptidů odvozených od mléčné bílkoviny, jak je diskutováno výše (část 2.8.1).

2.8.3. Ochrana před poškozením DNA pomocí MPMC proti oxidativnímu štěpení plazmidu RNH1

Plazmidová DNA RNH1 má při elektroforéze na agarózovém gelu tři formy uspořádané shora dolů jako otevřená kruhová, lineární a nadšroubovicová kruhová DNA. Oxidační stres Fentonovým činidlem vyvolal poškození DNA. Následně je pozměněna hladina forem DNA. Nicméně, otevřené kruhové a lineární formy indikují poškození DNA a supercoiled kruhová DNA značí větší potenciál ochrany. V tomto testu jsme testovali, zda MP a MPMC při jejich IC50 mohou chránit před degradací superspirální kruhové formy v reakci na oxidační stres. Výsledkem bylo, že jak MP/NabM, tak MP/IHM vykazovaly vysokou ochrannou kapacitu podobnou DNA kontrole (dráhy 3 a 4, obrázek 9A). Na druhé straně nebyl pozorován žádný významný rozdíl u DNA ošetřené MP ve srovnání s DNA kontrolou a DNA ošetřené pouze Fentonovým činidlem (dráha 5).

2.8.4. Ochrana před poškozením DNA pomocí MPMC proti oxidativnímu štěpení genomové DNA

Pomocí techniky PCR byly zkoumány ochranné vlastnosti MPMC na poškození genomové DNA indukované Fentonovou reakcí. Obecně platí, že poškození DNA snižuje počet kopií určitých genů, a proto produkuje nižší intenzitu pásů v gelové elektroforéze. Byl testován gen MTHFR pro hustotu pruhů krevní genomové DNA inkubované s Fentonovým činidlem s a bez IC50 MP, MP/NabM a MP/IHM. Bylo zjištěno, že MP/NabM a MP/IHM (dráhy 3 a 4, obrázek 9B) zabránily poškození DNA a následně chránily řezné místo templátu MTHFR. Proto byla produkována vyšší intenzita pásu produktu PCR v elektroforézním gelu ve srovnání s příslušnými kontrolami (obrázek 9B). Tyto výsledky ukázaly, že antioxidační aktivita MPMC inhibovala produkci volných radikálů, které zprostředkovávaly poškození DNA.

2.8.5. Genová exprese

V souladu s údaji získanými z markerů apoptózy, výsledky RT-qPCR odhalily, že inkubace buněk HepG-2, MCF-7 s MP, MP/NabM a MP/IHM vyvolala významnou upregulaci pro- apoptotické mRNA markery, jmenovitě Casp3, p53 a Bax, zatímco hladina exprese antiapoptotického markeru Bcl-2 byla významně snížena (obrázek 10A-D). Kaspázy jsou aktivní proteiny, které hrají zásadní roli při iniciaci a udržení apoptózy. Upregulace proteinu kaspázy 3 však svědčí o provedení hlavní vnitřní dráhy apoptózy (obrázek 10A, B), která je charakterizována kolapsem mitochondriální membrány s Bax-indukovaným uvolňováním cytochromu c a aktivací kaspázy 9 vedoucí k následné zapojení kaspázy 3 [42]. Zvýšená regulace Casp3, p53 a Bax spolu se snížením exprese Bcl{20}} odhalila, že MP, MP/NabM a MP/IHM spouštěly apoptózu. V tomto ohledu upregulace p53 stimulovala expresi Bax, což zase vyvolá uvolnění cytochromu c, následované aktivací kaspázy-9 a -3. Je však známo, že Bcl-2 jako antiapoptóza inhibuje uvolňování cytochromu c [43], léčba vedla k významnému snížení hladin transkriptu mRNA genu antiapoptotického markeru Bcl-2 v důsledku Léčba MP/NabM a MP/IHM, která usnadňuje uvolnění cytochromu c indukované Baxem a následnou apoptózu. V této studii MP/NabM vážně zprostředkovával apoptózu ve srovnání s MP/IHM a MP, jak je pozorováno na (obrázek 10). Pozorované protirakovinné účinky MP/NabMor MP/IHM probíhají prostřednictvím modulace dráhy apoptózy závislé na ap53-, protože hladiny jeho proteinu i transkriptu mRNA byly významně upregulovány.

Kliknutím na odkaz získáte další informace:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049190.html