Metaanalýza výsledků kvantifikace NAD(P)(H) ukazuje variabilitu napříč savčími tkáněmi Ⅱ
Jun 01, 2023
Účinek odběru tkáně před posmrtným a posmrtným odběrem na hladiny NAD(P)(H).
Předpověděli jsme, že může existovat určitý pozorovatelný rozdíl v redoxním stavu NAD(P)(H), který je závislý na postupech odběru tkáně. Abychom na tuto otázku odpověděli, zkoumali jsme vliv postupů odběru tkáně před a po posmrtném stavu na redoxní stav NAD(P)(H). Pro tuto analýzu jsme porovnávali hodnoty z jaterních tkání potkana vzhledem k většímu počtu studií definujících protokol jejich oběti. Když byly zveřejněny, všechny recenzované studie uváděly, že vzorky tkáně byly před měřením NAD(P)(H) udržovány v chladu a okamžitě extrahovány na ledu nebo zmraženy na -80 stupňů. Tato analýza určila, že neexistuje žádný významný rozdíl v koncentracích NAD plus v krysích játrech (obr. 6a) mezi tkáněmi extrahovanými před nebo po eutanazii. Uváděné hladiny NADH v krysích játrech jsou však významně vyšší ve vzorcích post mortem (obr. 6b). Nebyly pozorovány žádné rozdíly v celkových hladinách NAD(H) (obr. 6c), ale poměr NAD plus/NADH byl nižší ve tkáních odebraných po eutanazii (obr. 6d), což je v souladu s variací pozorovanou u hladin NADH. Výsledky NADP plus, NADPH a poměru NADP plus/NADPH v krysích játrech seskupených podle časového bodu odběru tkáně jsou ukázány na doplňkovém obrázku 9; nedostatečný počet posmrtných vzorků nám však neumožňuje interpretovat vliv časového bodu odběru tkáně na hladiny NADP(H). V myších játrech nebyl žádný rozdíl mezi hladinami NAD plus před posmrtnou a posmrtnou zkouškou, nicméně počet hlášení studií byl limitující (obr. 6e). NeNADH,NADP plusneboNADPHposmrtná data vmyší játrabyl k dispozici pro srovnání.
Kliknutím sem získáte Hebrs Cistanche
Diskuse
Mnoho nedávných studií prokázalo, že regulace NAD(P)(H) je nezbytná pro buněčnou homeostázu a redoxní stav. Údaje získané od hlodavců vedly ke studiím zkoumajícím hladinu NAD plus v lidské krvi jako méně invazivní indikátor hladiny NAD plus v celém těle. Nedávné klinické studie prokázaly, že hladiny NAD plus byly sníženy u chorobných stavů23,47 a zvýšeny po strategiích NAD plus boosting23,44,48,49. Provedli jsme metaanalýzu všech studií publikovaných v letech 1946 až 20. června 2021, které obsahovaly kvantitativní údaje o hladinách NAD(P)(H) u savců se zvláštním zaměřením na myši, krysy a lidi, protože představují nejvíce studované druhy v biomedicínské oblasti. Tato analýza byla provedena zčásti za účelem stanovení průměrné standardní úrovně koncentrací NAD(P)(H) v normálních savčích tkáních vzhledem k dobře známému rozptylu v těchto měřeních napříč studiemi. Doufáme, že tato data mohou být použita ke stimulaci standardizovaných protokolů v oblasti NAD plus výzkumu a k podpoře používání hladin NAD(P)(H) a redoxních poměrů jako spolehlivých biomarkerů pro onemocnění a léčebné režimy.
Navzdory značné variabilitě měření napříč tkáněmi hlodavců tato metaanalýza vykazovala podobné průměrné hladiny NAD plus napříč tkáněmi s některými výjimkami. Je zajímavé, že myší kosterní sval vykazoval nižší střední hodnoty NAD plus (obr. 2a) než jiné vysoce metabolické tkáně (tj. játra, ledviny, srdce a mozek). To může naznačovat různé redoxní stavy NAD(H) v kosterním svalstvu nebo může poukazovat na větší problémy s extrakcí metabolitů ve vláknitých tkáních. Tato pozorování však nemohla být ověřena u lidí kvůli nedostatku odebraných tkání mimo krev a svaly.
Existuje mnoho potenciálních faktorů, které by mohly ovlivnit přesnost fyziologických měření NAD(P)(H) ve vzorcích tkání. Když byly hlášeny, všechny studie popisovaly tkáně jako sklizené a přímo ponořené do kapalného dusíku nebo uchovávané na ledu před zmrazením nebo zpracováním, aby se zachovaly frakce citlivé na teplo (NAD plus a NADP plus). Účinek pH na různé frakce NAD(P)(H), jako je acidolabilní povaha redukovaných forem NAD(P)H, vedl ve většině studií k použití extrakčních rozpouštědel s neutrálním pH. . Vzhledem k rychlé vzájemné konverzi redukovaných a oxidovaných metabolitů a účinku anoxie na NAD(H)50–53 je však také důležité zajistit rychlou extrakci tkáňových metabolitů a vhodné postupy pro zhášení buněčného NAD(P)(H )-redoxní/spotřební enzymy, například prostřednictvím deproteinizace. V tomto smyslu naše analýza odběru tkáně před a po posmrtném stavu ukazuje, že analýza po porážce podporuje snížení NAD plus. Snížení tkáňového NAD plus bylo dříve popsáno in vivo v mozku, srdci a játrech krys vystavených prodloužené 2{10}}h hypoxické atmosféře54, což je prostředí, které může být částečně rekapitulováno prodlouženými obdobími po obětovat odběr tkáně před rychlým zmrazením. To může naznačovat, že k získání reprezentativních měření NAD(P)(H) by mělo dojít k extrakci tkání v anestezii nebo upřednostnění okamžitého odběru tkání určených k použití pro analýzu metabolitů po oběti.
Existuje také potenciál pro různé kvantifikační metody, z nichž každá má různá omezení, aby přispěly k celkové variabilitě měření NAD(P)(H) v rámci studie. V posledních dvou desetiletích byly nejčastěji používanými metodami enzymatické cyklování, LC–MS a HPLC. Každá z těchto metod je ovlivněna technikami extrakce metabolitů, kvantifikačními parametry a implementací správných kontrol kvality. Pomocí LC–MS, Lu et al. ukázali, že k vzájemné přeměně mezi redukovanými a oxidovanými formami metabolitů NAD(P)(H) dochází různou rychlostí v různých extrakčních pufrech nebo rozpouštědlech, přičemž směs acetonitril:methanol:voda s 0.1M kyselinou mravenčí poskytuje nejvyšší výtěžnost s nejmenším počtem vzájemných konverzí31. Při použití LC–MS však lze tuto vzájemnou konverzi monitorovat mezi jednotlivými vzorky studie přidáním vnitřních kontrol, jako jsou izotopy NAD(P)(H), což je výhoda techniky LC–MS oproti HPLC a enzymu. cyklické testy31,33,55. Nicméně i při dobře řízených technikách LC–MS mohou různé faktory interferovat s měřeným signálem, včetně matricových efektů a změn v účinnosti ionizace. Některé studie například používají kvasinkové extrakty značené 13C jako vnitřní standardy v metabolomice založené na LC–MS. Avšak přidání matrice metabolitu extrahovaného vzorku matricí metabolitu kvasinkového extraktu značeného 13C může mít různé důsledky, jako je potlačení iontů, které snižuje signál značených a/nebo neznačených metabolitů, a může vést k chybám v absolutní kvantifikaci, pokud tomu tak není. zjištěno důkladným hodnocením kvality56. Také, ačkoli techniky LC–MS teoreticky umožňují měření více metabolitů NAD(P)(H) v jednom experimentu, stále existují omezení, protože pokud mají sledované metabolity velké rozdíly v koncentracích, musí být provedeno optimální ředění. Navzdory jejich výhodám oproti jednodušším enzymovým cyklickým testům tedy složitost metod LC–MS vyžaduje důkladnou optimalizaci. Nedávno byly vyvinuty nové analytické metody, jako jsou NAD plus biosenzory a hmotnostní spektrometrie založená na zobrazování, ale stále není k dispozici dostatek kvantitativních dat generovaných těmito technikami pro zahrnutí do metaanalýzy. Jedna studie zahrnutá do naší metaanalýzy však použila bioluminiscenční biosenzor na bázi papíru k měření hladin NAD plus v myších játrech a jiných typech vzorků57. Tato studie byla zařazena do skupiny bioluminiscenčních testů kvůli podobné metodě detekce (obr. 1a).
Metody
Extrakce dat.
Numerická data pro metabolity NAD(P)(H) byla získána buď přímo z článků nebo extrahována z obrázků článků pomocí poloautomatického softwaru pro extrakci dat (WebPlotDigitizer58). Kromě toho byly tam, kde to bylo možné, zaznamenány časové body odběru tkáně ve vztahu k usmrcení a/nebo metodám odběru vzorků tkáně/krve (tj. metoda anestezie a/nebo eutanazie, manipulace s tkání a teplota skladování). U zvířecích modelů byly zaznamenány druhy, charakteristiky (např. kmen, genotyp, věk a hmotnost) a podmínky prostředí (např. spánkový cyklus, typ stravy, frekvence krmení a stav krmení ve vztahu k odběru vzorků tkáně). Kromě toho byla pro všechny studie extrahována léčba (např. farmakologická léčba, chirurgické zákroky, ozařování, indukce nádoru a další postupy aplikované na subjekty studie) a všechny informace o studijních skupinách (např. skupiny léčby nebo onemocnění a odpovídající kontroly). Konečně metoda kvantifikační metody NAD(P)(H) (např. enzymatické testy, na bázi hmotnostní spektrometrie, HPLC, NMR, bioluminiscence) a specifika publikace (tj. název publikace, referenční kód [DOI, Medline UI, PMID] nebo hypertextový odkaz a rok vydání) byly zaznamenány (doplňkový materiál 2).
Analýza dat. Před analýzou byly všechny koncentrace převedeny na nmol/g tkáně nebo nmol/g proteinů pro vzorky tkáně nebo nmol/ml pro krevní frakce. Vzhledem k nízkému počtu výsledků normalizovaných na obsah bílkovin zobrazujeme pouze výsledky normalizované na hmotnost tkáně a objem krve. Statistická analýza byla provedena pomocí GraphPad Prism verze 9.3.1 (GraphPad Sofware Inc., San Diego, Kalifornie, USA,Dostupnost datVšechna data extrahovaná a analyzovaná během této studie jsou zahrnuta v tomto publikovaném článku a jeho dodatcíchinformační fleky.Přijato: 29. dubna 2022; Přijato: 7. února 2023
Reference
10. Láska, NR a kol. NAD kináza řídí biosyntézu NADP u zvířat a je modulována prostřednictvím evolučně odlišných mechanismů závislých na kalmodulinu. Proč. Natl. Akad. Sci. 112, 1386–1391 (2015).
Požádat o víc:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950