Metaanalýza výsledků kvantifikace NAD(P)(H) ukazuje variabilitu napříč savčími tkáněmi
Jun 01, 2023
Nikotinamid adenin dinukleotid (NAD plus ) hraje důležitou roli v energetickém metabolismu a signálních drahách řídících klíčové buněčné funkce. Thezvýšený zájem o NAD plus metabolismusaNAD plus - posilující terapieposílila nutnost přesné NAD plus kvantifikace. Abychom prozkoumali publikovaná měření NAD(P)(H) napříč tkáněmi savců, provedli jsme ametaanalýza existujících dat. Vyhledávání v databázi Ovid MEDLINE identifikovalo články s výsledky kvantifikace NAD(P)(H) získanými ze savčích tkání publikovaných v letech 1961 až 2021. Prověřili jsme 4890 záznamů a extrahovali kvantitativní data, stejně jakokvantifikační metody, předanalytické podmínky a charakteristiky předmětu. Extrahované fyziologické koncentrace NAD(P)(H) vrůzné tkáněz myší, krys a lidí, odhalily důležitou inter- a intra-metodovou variabilitu, která se rozšířila na nedávné publikace. To zdůrazňuje relativně slabý potenciál pro křížové experimentální analýzy pro kvantitativní data NAD(P)(H) a důležitost standardizace pro kvantifikační metody NAD(P)(H).předanalytické postupypro budoucí preklinické aklinické studie.
Kliknutím sem získáte antioxidační vlastnosti Cistanche a produkty proti stárnutí
Nikotinamid adenindinukleotid hraje dvojí roli jako aredukce-oxidace (redox)koenzym, ve svém oxidovaném (NAD(P) plus ) aredukované (NAD(P)H) formya jako ako-substrát (NAD(P) plus ) pro enzymy zapojené do deacylace1mono- a poly-ADP-ribosylace2,3 a vytvoření druhých poslů na bázi adeninu4–7. Poměr Te NAD(P) plus /NAD(P)H je důležitým indikátorem intracelulárního redoxního stavu a hraje klíčovou roli v regulaci klíčových metabolických drah8,9. Například NAD plus je nezbytný pro glykolýzu spolu s cyklem trikarboxylových kyselin (TCA), aby poskytl redukční ekvivalenty během tvorby adenosintrifosfátu (ATP), hlavního zdroje energie pro buňku8,9. Když je NAD plus omezený, může být také regenerován z NADH fermentací pyruvátu za vzniku laktátu v savčích buňkách, čímž se udržuje buněčná redoxní rovnováha25. NAD plus a NADH mohou být také fosforylovány na NADP a NADPH pomocí NAD plus kináz (NADK)10,11. NADPH je nezbytný pro redukční biosyntézu, signální transdukci, buněčné antioxidační reakce a zejména redukci glutathionu12–14. V cytosolu je NADP plus mimo jiné redukován na NADPH glukózo-6-fosfátdehydrogenázou a 6-fosfoglukonátdehydrogenázou pentózofosfátové dráhy (PPP)13. Zatímco v mitochondriích je produkce NADPH udržována různými reakcemi, včetně těch, které jsou závislé na aktivitě enzymu nikotinamid nukleotid transhydrogenázy (NNT) a izocitrát dehydrogenázy (IDH2)15. V důsledku toho bylo prokázáno, že stav NAD(P)(H) ovlivňuje buněčnou signalizaci a metabolismus, energetickou homeostázu, mitochondriální biogenezi, reakce na oxidační stres a údržbu a opravy DNA16–18. Dále, protože progrese onemocnění souvisejících s věkem, jako je obezita19, nealkoholické ztučnění jater20,21, neurodegenerace22, mitochondriální23 a kardiovaskulární24 onemocnění a svalová atrofie nebo dystrofie25, je spojena se změnami metabolitů souvisejících s NAD plus, zaměřené na udržení NAD plus homeostázy jsou v současné době předmětem vyšetřování.
Kromě běžných redoxních přechodů může být NADP plus spotřebován výměnou své nikotinamidové skupiny za kyselinu nikotinovou v reakci katalyzované cADPR syntázami, jako je CD38, za vzniku druhého posla NAADP, který se podílí na mobilizaci vápníku, sekreci hormonů a imunitních buňkách. proliferace6,7,26. NAD plus lze také konzumovat, když působí jako ko-substrát za vzniku nikotinamidu (NAM), který může být použit jako substrát k regeneraci NAD plus cestou záchrany NAM. NAM lze také methylovat za vzniku 1-methyl NAM (meNAM), který lze dále oxidovat na produkty degradace N1-methyl-2-pyridon-5-karboxamid (2py) a N1-methyl-4-pyridon-3-karboxamid (4py). Nakonec mohou být methylované katabolity odstraněny z těla močí27,28. Skupina NAD plus může být také snížena spotřebou NADP plus prostřednictvím reakce výměny bází pro vytvoření druhého posla NAADP14. Udržování poolu NAD plus proto vyžaduje biosyntézu přes Preiss-Handlerovu dráhu (počínaje běžnou molekulou vitaminu B3 niacinem (NA; kyselina nikotinová)), biosyntézou de novo (počínaje aminokyselinou tryptofan (Trp)) nebo regenerace z konverze NAM cestou záchrany na NMN a poté na NAD plus. A konečně, záchranná cesta je také důležitá pro biosyntézu NAD plus z nikotinamidu ribosidu (NR), alternativní formy vitamínu B3 nacházejícího se v potravinách, po jeho fosforylaci nikotinamid ribosid kinázou na NMN a poté přeměně na NAD plus prostřednictvím záchranné dráhy .
Pochopení dynamiky NAD plus metabolomu se proto stalo nezbytným a nakonec vyžaduje přísnou kvantifikaci metabolitů, aby bylo možné lépe porozumět fluxu NAD plus metabolitů během normální fyziologie nebo s progresí onemocnění nebo zdravého stárnutí. Jasný obraz těchto změn je nezbytný pro spojení změn v NAD plus metabolomu s downstream enzymatickými nebo redoxními reakcemi, které jsou klíčem ke změnám ve fenotypech tkání. Vzhledem k značnému množství dříve hlášených kvantitativních údajů o NAD plus metabolitech u savců, včetně rostoucího počtu zpráv u lidí, je nezbytné a včasné shrnout tyto změny během zdraví a nemoci. Četné studie zkoumaly složky NAD plus metabolomu u hlodavců a lidí v různých metabolických stavech, věku a onemocněních, ale spoléhají na různé metody přípravy nebo kvantifikace vzorků. Příprava vzorku je důležitá pro metabolity zapojené do redoxních reakcí kvůli potenciální degradaci a interkonverzím za určitých podmínek29,30. Pro kvantifikaci se za citlivé a specifické metody považuje kapalinová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (LC–MS) a magnetickou rezonanční spektrometrií (MRS)31–33, zatímco enzymatické cyklické testy jsou běžnější. Kvantitativní metody LC–MS vyžadují komplexní zahrnutí kontrol kvality jednotlivých měřených metabolitů a celkového účinku matrice vzorků, což je účinek, který vysvětluje různé odezvy hmotnostní spektrometrie pro daný analyt při měření v různých roztocích. Bez těchto kontrol je LC–MS v nejlepším případě semikvantitativní. V této studii jsme identifikovali značnou variabilitu měření NAD(P)(H) napříč studiemi na hlodavcích a lidech, přičemž jsme zdůraznili potřebu správných metod podávání zpráv a standardizovaného zpracování vzorků a analytických protokolů. Celkově jsou srovnatelné soubory dat NAD(P)(H) napříč studiemi potřebné pro smysluplnou interpretaci stávajících a budoucích dat v oblasti NAD plus biologie.
Výsledek
Metaanalýza běžných kvantifikačních metod, studovaných druhů, pohlaví a tkání.
Historicky se rané metody používané pro kvantifikaci NAD(P)(H) spoléhaly na spektrofotometrické nebo fluorometrické vlastnosti těchto metabolitů34,35. V poslední době se k rozlišení hladin koenzymu NAD(P)(H) častěji používají metody cyklování enzymů spojené se spektrofotometrickou nebo fluorometrickou detekcí36–38. Rostoucí potřeba vysoké citlivosti a rozlišení při kvantifikaci těchto koenzymů spolu s nutností měřit další metabolity související s NAD plus vedly k použití technik vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a LC–MS. Z těchto přístupů se LC–MS stala preferovanou metodou, protože hmotnostní spektrometrie kombinovaná s kapalinovou chromatografií umožňuje specifickou identifikaci eluovaných sloučenin spolu s přidanou výhodou zahrnutí izotopových metabolitů NAD(P)(H) jako vnitřní kvality spike-in. řízení. Navzdory jejich výhodám oproti klasickým spektrofotometrickým nebo fluorometrickým testům zůstávají HPLC a LC–MS drahé a časově náročné, což vysvětluje, proč testy enzymového cyklování přetrvávají v nedávných studiích.
Pomocí systematického přístupu bylo z 241 vhodných studií (doplňkový materiál 2) vybráno pro další analýzu 205 studií, které zahrnovaly kvantitativní metaanalýzu koncentrací NAD(P)(H) v myších, potkaních a lidských tkáních. Z těchto studií 46,7 procenta použilo testy cyklování enzymů, z nichž zahrnovaly kolorimetrickou (40,9 procenta) nebo fluorometrickou (5,8 procenta) detekci, zatímco 17,8 procenta použilo metody HPLC (spojené s UV nebo fluorescenčními detektory) a 13,2 procenta použilo testy LC–MS ( Obr. 1a). Většina studií nezahrnovala podrobný popis postupů extrakce metabolitů. Běžně používané extrakční postupy však sestávaly buď z extrakčních pufrů s povrchově aktivními látkami nebo bez nich (Triton®, Tris, Dodecyl trimethylamonium bromid), nebo polárních organických rozpouštědel, jako je acetonitril, methanol, ethanol nebo chloroform. Předchozí studie ukázaly, že inaktivace enzymů a optimální pH a teplotní podmínky byly účinné při zachování stability různých NAD(P)(H) forem30,39,40. Při zveřejnění byly vzorky zpracovány za podmínek nízké teploty a v zahrnutých studiích nebyly zmíněny žádné redoxní přísady. Redoxní reakce byly omezeny inaktivací enzymů ve vzorcích před měřením metabolitů NAD(P)(H), obvykle srážením rozpouštědly, jako je ethanol, methanol, acetonitril nebo kyselina chloristá (PCA). Použití PCA však bylo vzácné kvůli acidolabilní povaze redukovaných forem (tj. NADH a NADPH) a také kvůli nutnosti dalšího kroku neutralizace. Tus ze studií uvádějících použití PCA během extrakce metabolitů (5,4 procenta), 3,7 procenta uvedlo pouze výsledky NAD(P) plus nebo použilo druhou nekyselou extrakční metodu pro správnou kvantifikaci NAD(P)H. Pouze 1,7 procenta studií uvádělo výsledky NADH, celkový NAD(H) a/nebo NAD plus /NADH s použitím pouze extrakce PCA. Potenciální zkreslení z těchto studií nebylo možné analyzovat kvůli omezeným údajům.
Srovnání středních fyziologických hladin NAD(P)(H) napříč tkáněmi pro hlodavce a lidi.
Abychom pomohli identifikovat očekávané střední fyziologické hladiny NAD(P)(H) pro nejčastěji studované myší, potkaní a lidské tkáně, sestavili jsme údaje ze všech kontrolních a divokých kohort z každé ze zahrnutých studií (doplňkový materiál 2 ). Konkrétně jsme zaznamenali průměrné hladiny NAD(P)(H) normalizované na hmotnost tkáně nebo v případě krve na objem. Údaje ze studií, které normalizovaly hladiny metabolitů na obsah bílkovin, byly zahrnuty do našeho kompilovaného souboru dat (doplňkový materiál 2), ale nebyly použity pro další analýzu vzhledem k nízkému počtu hlášených výsledků. Navíc, pokud to bylo možné, vypočítali jsme poměry NAD(P) plus /NAD(P)H jako odraz redoxního stavu a také celkové úrovně NAD(P)(H) (NAD(P) plus plus NAD (P)(H)), což jsou běžné výstupy hlášení pro opravy NAD(P)(H). Extrahovaná data také zahrnovala druh, kmeny, věk, pohlaví, kvantifikační metodu, dietu a rozvrh krmení, typ vzorku, metodu odběru vzorků a dobu sklizně (pre- nebo post mortem).
Metaanalýza dat NAD(H) identifikovala průměrné fyziologické koncentrace pro NAD plus a NADH v myších (obr. 2a,b, doplňkový obr. 1a,b) a potkaních (doplňkový obr. 2a,b) tkáních ze zvířat mladší než 14 měsíců u myší a 18 měsíců u potkanů. Extrahovaný rozsah hodnot fyziologického poměru NAD plus/NADH a celkové hladiny NAD(H) (NAD plus plus NADH) byly vyneseny do grafu pro myši (obr. 2c, d) a potkany (doplňkový obr. 2c, d). Na rozdíl od studií na myších většina uváděných údajů u potkanů nezahrnovala věk zvířat; rozhodli jsme se však zahrnout tato data za předpokladu, že studie neklasifikovala jejich kohorty jako věkové. Z nejvýznamnějších studovaných tkání tato metaanalýza ukazuje, že střední hodnota NAD plus pro játra (596 nmol/g, n=26) je vyšší než u všech ostatních tkání u myší, zatímco překvapivě kosterní svaly (162,8 nmol /g, n=9) vykazuje jednu z nejnižších středních hodnot na gram tkáně (obr. 2a). Tyto výsledky mohou buď naznačovat sníženou účinnost v NAD plus extrakci metabolitů, kvůli vysoce vláknité povaze svalu, nebo že existují důležité rozdíly ve svalové NAD plus metabolismus ve srovnání s jinými vysoce metabolickými tkáněmi, jako jsou játra a ledviny.
Navzdory několika kvantitativním studiím stárnutí byly hladiny NAD plus u starých myší v průměru sníženy v játrech, svalech a retinálním pigmentovém epitelu (RPE) ve srovnání s jejich mladými kohortami a ve srovnání s průměrem všech studií provedených s mladšími myšmi. než 14 měsíců věku (doplňkový obr. 3). Metaanalýza NADH a poměru NAD plus/NADH u starých zvířat nebyla možná vzhledem k tomu, že tato měření prováděla pouze jedna z těchto kvantitativních studií.
Tato data ukazují nedostatek kvantitativních NAD(H) dat u stárnoucích zvířat.
U údajů získaných ze studií na zdravých lidech se věková rozmezí napříč studiemi značně lišila (od 15 do 92,3 let) a ve většině případů data nebyla stratifikována napříč těmito věky. Mezi nejčastěji měřené lidské tkáně patřily kosterní svaly a složky krve vzhledem k jejich méně invazivnímu charakteru odběru (obr. 3a–d). Výsledky z jiných lidských tkání (n= 1–2) jsou zobrazeny na doplňkovém obrázku 4. Tato analýza vykazovala střední koncentraci NAD plus koncentraci 44,62 nmol/ml (n=23) v plné krvi, s podobným NAD plus koncentrace hlášené pro červené krvinky při 46,96 nmol/ml (n=7) (obr. 3a; doplňková tabulka 1). Hladiny NAD plus v krevní plazmě však byly podstatně nižší s mediánem 0,37 nmol/ml (n=8) (obr. 3a). Střední hodnoty NAD plus nalezené v kosterním svalstvu lidí byly 191,9 (n=4) nmol/g v preparátech vlhkého svalstva oproti 1713 (n=3) nmol/g v preparátech sušených mrazem, nízká teplota dehydratační proces, který pravděpodobně koncentruje metabolity (obr. 3a). V běžněji zkoumaných tkáních pro měření NADH byly střední hladiny v lidských červených krvinkách, plazmě a lyofilizovaném kosterním svalu 1,75 nmol/ml (n =7), 0,39 nmol/ml (n=8) a 136,8 nmol/g (n=6), v tomto pořadí (obr. 3b). Odpovídající střední poměry NAD plus/NADH byly 23,65 (n=8), 1,57 (n=7) a 12,7 (n=3) (obr. 3c). Je zajímavé, že střední poměr NAD plus / NADH pro červené krvinky (23,65) a lyofilizovaný kosterní sval (12,7) (obr. 3c) byl několikanásobně vyšší než u většiny myší a potkaních tkání (obr. 2c a doplňkový obr. 2c) , což ukazuje na vysoce oxidační redoxní stav s množstvím dostupného NAD plus v těchto lidských tkáních. V případě svalové tkáně by to mohlo mít důsledky při zvažování translačního potenciálu studií na hlodavcích, které identifikovaly výhody zvýšení hladiny NAD plus ve svalu. Zvýšený poměr NAD plus/NADH ve svalu však může být také výsledkem opožděných postupů zmrazování vzorků v klinickém prostředí, což může vést k nefyziologickým změnám v redoxním stavu vzorku.
Byly sestaveny fyziologické hladiny NADP(H) v tkáních hlodavců, přičemž nejčastější měření bylo v játrech. Myší játra vykazovala střední hodnotu 124,2 nmol/g NADP plus (n=13) a 140,2 nmol/g NADPH (n=4) (obr. 4a,b ), zatímco krysí játra vykazovala medián 95,11 nmol/g NADP plus (n=10) a 240,7 nmol/g NADPH (n=9) (doplňkový obr. 5a,b). Medián poměru NADP plus/NADPH, odvozený ze studií, které měřily oba metabolity, byl nižší než 1 ve většině myší a potkaních tkání (obr. 4c, doplňkový obr. 5c). Střední hodnoty celkového NADP(H) (NADP plus plus NADPH) v myších a potkaních játrech byly 244,4 (n=3) (obr. 4d) a 342,1 (n=9) (doplňkový obr. 5d) , resp. U lidí byla nejběžnější měření NADP(H) provedena v červených krvinkách vykazujících medián 33,2 nmol/ml pro NADP plus (n=14) a 22,4 nmol/ml pro NADPH (n{{30} }) z neshodných studií, s mediánem poměru NADP plus /NADPH 1,27 a mediánem celkového NADP(H) 52,0 nmol/ml ze studií, které měřily oba metabolity (n=11) (obr. 4e– h). Celkově je množství dostupných údajů pro NADP(H) u všech druhů řídké, což vede k nižší spolehlivosti středních hodnot pro každou tkáň.
Analýza vychýlení a variability v metodách kvantifikace NAD(P)(H).
Vzhledem k tomu, že většina studií zahrnutých do této metaanalýzy zkoumala hladiny NAD plus ve vzorcích jater hlodavců (obr. 1c, e), použili jsme fyziologické hladiny NAD plus v játrech myší i potkanů, abychom identifikovali jakékoli potenciální zkreslení ve výsledcích, které odpovídají ke kvantifikační metodě (obr. 5a,b). Průměrný věk myší zahrnutých v této analýze byl 17,9 týdnů (rozmezí: 2–55 týdnů), přičemž 6 studií nezveřejnilo věk zvířat. U potkanů většina studií nezveřejnila věk zvířat kromě tří, které se pohybovaly od 2 dnů do 8 měsíců. Žádná ze studií neuvedla použití starých zvířat. V myších játrech se velké rozmezí uváděných koncentrací NAD plus pohybovalo od 1,8 do 1132 nmol/g jater s průměrnou hodnotou 596.0 (n=26) (obr. 5a) , zatímco koncentrace NADH se pohybovaly od 0,9 do 109 nmol/g tkáně se střední hodnotou 66,43 (n=6) (doplňkový obr. 6a). Důležité je, že variační koeficient 52,5 procenta a 76,5 procenta byl vypočten pro průměrné fyziologické výsledky NAD plus a NADH v myších játrech, v daném pořadí, jak bylo měřeno více kvantifikačními metodami, což ukazuje rozsah variability napříč studiemi. Jak bylo předpovězeno z těchto výsledků, průměrný poměr NAD plus / NADH v myších játrech (3,41 plus /- 3,16 SD, n=19) prokázal stejně velký rozsah variability s CV 92,7 procent (doplňkový obrázek 6c) . Podobná variabilita měření NAD plus a NADH byla také pozorována v játrech potkana (CV=42,6 procent pro NAD plus a CV=44,4 procenta pro NADH). Odpovídající koncentrace NAD plus a NADH v krysích játrech se pohybovaly od 159 do 796 (n=16) a 65 až 265 (n=12) nmol/g, v daném pořadí (obr. 5b, doplňkový obr. 6b ), zatímco poměry NAD plus /NADH vykazovaly CV 50,1 procenta (průměr: 3,219 plus /- 1,612 SD, n=23) (doplňkový obrázek 6d). Průměrné hodnoty a standardní odchylky pro NAD plus, NADH, celkový NAD(H) a poměr NAD plus/NADH v myších a potkaních játrech, seskupené podle kvantifikační metody, jsou uvedeny v doplňkové tabulce 2. Pokud jde o hladiny NADP(H) a poměr NADP plus/NADPH, podobná variabilita byla pozorována v jaterních tkáních. Hladiny NADP plus se pohybovaly od 50,4 do 247,4 nmol/g tkáně pro myši (doplňkový obrázek 8a) a od 45,7 do 171 nmol/g tkáně pro potkany (doplňkový obrázek 8b), zatímco hladiny NADPH se pohybovala od 28 do 236,9 nmol/g tkáně pro myši (doplňkový obrázek 8c) a od 90 do 409 nmol/g tkáně pro potkany (doplňkový obrázek 8d). Nakonec se poměr NADP plus/NADPH pohyboval v rozmezí od 0,12 do 0,55 v myších játrech (doplňkový obrázek 8e) a od 0,12 do 1,44 v játrech potkana (doplňkový obrázek 8f).
v největším rozsahu výsledků (1,8 až 1132,3 nmol/g). Dokonce i nejnovější zkoumané studie LC–MS ilustrovaly rozsah těchto hodnot NAD plus, včetně hodnot 1,8 nmol/g41 a 33,8 nmol/g42 a mnohem vyšších hodnot 946,3 nmol/g43 a 1132,3 nmol/g44. Navíc se nezdálo, že by velký rozsah hodnot LC–MS NAD plus koreloval se studiemi, které vylučovaly izotopově značené vnitřní standardy (obr. 5a), což je metoda používaná ke zlepšení identifikace metabolitu a přesnosti kvantifikované hodnoty. . Nicméně dvě identifikované studie LC–MS, které se spoléhaly pouze na externí standardní křivku pro NAD plus kvantifikaci, spíše než aby zahrnovaly vnitřní kontrolu, byly v průměru nižší než průměr všech měření (obr. 5a). Studie využívající normalizaci vnitřních standardů dále používaly různé typy vnitřních standardů, jako je zahrnutí jednoho značeného referenčního metabolitu45,46 nebo extraktů značených metabolitů z kvasinek43,44 nebo buněčných kultur41. Je zajímavé, že tyto studie, které používaly standardy odvozené z kvasnic nebo extraktů z buněčných kultur, poskytly buď nejvyšší, nebo nejnižší hodnoty odvozené od LC–MS pro hladiny NAD plus v játrech. To potenciálně zdůrazňuje, jak mohou buněčné extrakty standardů bohatých na izotopy přispívat k variabilitě měření NAD plus, protože matricový efekt přidaných standardních kvasnic nebo buněčného extraktu by mohl interferovat s účinností ionizace a následně s naměřenými koncentracemi cílových metabolitů.
Omezení této analýzy zkreslení a variability kvantifikace zahrnují potenciální rozdíly v prostředí, genetickém pozadí, obětech, pohlaví a věku. Všechny údaje pro tuto analýzu pocházejí od zvířat na dietě chow, ale mohou se lišit v typu. Po usmrcení jsou hlášeny rozdíly ve stavu nakrmení nebo nalačno zvířete a denní době pro usmrcení. Kromě toho, ačkoli většina studií na myších byla prováděna na pozadí C57BL/6, ve studiích byl použit větší rozsah pozadí pro krysy (Wistar: 38 procent, Albino Wistar: 25 procent a 6 procent pro Hooded Wistar, Sprague–Dawley, Krysy Holtzman, ACI, Long-Evans a Zucker). Ve studiích myších jater nebyly žádné statistické rozdíly mezi mužskými nebo ženskými hodnotami pro hladiny NAD plus, NADH nebo celkové NAD(H) nebo pro poměr NAD plus / NADH (doplňkový obrázek 7). Z důvodu omezeného počtu ženských kohort však nemůžeme dělat závěry.
Požádat o víc:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
