Melatonin z mikroorganismů, řas a rostlin jako možné alternativy k syntetickému melatoninu, část 1

Abstraktní: Doplňky stravy s melatoninem jsou široce konzumovány po celém světě, přičemž největšími spotřebiteli jsou rozvinuté země s odhadovaným ročním tempem růstu přibližně 10 procent do roku 2027, zejména v rozvojových zemích. Široké použití melatoninu proti poruchám spánku a konkrétním problémům, jako je jet lag, se přidalo k dalším aplikacím, jako je anti-aging, antistres, aktivace imunitního systému, protirakovinné a další, které vyvolaly jeho použití, obecně bez předpisu. Chemický průmysl v současnosti pokrývá 100 procent potřeb trhu s melatoninem. Motivováni odvětvími s přirozenějšími spotřebitelskými návyky se před několika lety objevila možnost získat melatonin z rostlin, nazývaný fytomelatonin. V poslední době farmaceutický průmysl vyvinul geneticky modifikované mikroorganismy, jejichž schopnost produkovat přirozený melatonin v bioreaktorech byla zvýšena. Tato práce shrnuje aspekty chemické a biologické syntézy melatoninu pro lidskou spotřebu, zejména jako potravinového doplňku. Jsou analyzovány výhody a nevýhody získávání melatoninu z mikroorganismů a fytomelatoninu z rostlin a řas a také výhody přírodního melatoninu, který zabraňuje nežádoucím chemickým vedlejším produktům z chemické syntézy melatoninu. Nakonec jsou analyzovány ekonomické a kvalitativní aspekty těchto nových produktů, z nichž některé jsou již uvedeny na trh.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a dokáže vychytávat reaktivní formy kyslíku, bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na Cistanche Side Effects Reddit

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slova: doplňky stravy; GMO; melatonin; mikroorganismy; fytomelatonin; rostlinná surovina

1. Úvod

Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is widely used around the world as a  dietary supplement. In general, melatonin is used as a sleep aid supplement, a mild tranquilizer, a generalist antioxidant, and an anticancer and anti-aging component, among others [1]. According to the American Psychiatric Association (APA), approximately one-third of adults suffer from insomnia during their lifetime [2]. It manifests itself in ongoing problems falling asleep and staying asleep. Therefore, it is very likely that the use of synthetic melatonin will spread. In 2019, the global production of synthetic melatonin,  which was around 4000 tons, accounted for around 1.3 billion USD. This vast market is fully assisted by the chemical melatonin, whose synthesis process is very cheap, effective, and,  therefore, lucrative. The melatonin market is expected to grow at a CAGR (compound annual growth rate) of >10 procent během příštích 5 let. S tímto značným nárůstem poptávky byly problémy s nespavostí způsobené pandemií COVID-19 velmi důležité [3]. Zdaleka nejvyšší spotřebu má Severní Amerika, následovaná Evropou. Globální trh s melatoninem je řízen především několika významnými společnostmi, jako jsou BASF, Aspen Pharmacare Australia, Nature's Bounty, Pfizer Inc., Natrol LLC, Aurobindo Pharma a Biotics Research Co. Upozorňujeme, že spotřeba melatoninu pro lékařské účely zahrnuje přibližně 50 procent vyrobeného syntetického melatoninu; zbytek má chemické a průmyslové aplikace [2,4].

Biologicky je melatonin molekulou široce rozšířenou ve všech říších živých organismů [5]. Byla objevena v roce 1958 v epifýze krávy [6] a později u člověka [7], je jednou z nejvíce prozkoumaných biomolekul a je známa jeho mnohonásobná funkce, zejména u savců [8,9], ale také u ryb. [10–12], drůbež [13,14] a bezobratlí [15]. Ve zvířecích a lidských buňkách působí melatonin jako antioxidant – relevantní role mu byla přisouzena v roce 1993 [16–18]. Melatonin působí jako zajímavý buněčný ochránce ve stresových situacích, v různých fyziologických aspektech u lidí a podle mnoha studií přispívá ke zlepšení různých onemocnění a dysfunkcí. Obrázek 1 ukazuje některé ochranné a regulační účinky melatoninu u lidí a představuje melatonin jako zajímavou pleiotropní molekulu, která vyniká svým významem, rolí melatoninu v regulaci metabolismu lipidů a glukózy, indukcí noční inzulínové rezistence a denního inzulínu citlivost. Zdá se, že tento účinek souvisí s nočním hladověním a denním krmením, což brání nadměrnému přírůstku hmotnosti [19]. Zdůrazňujeme také jeho roli jako antionkogenního činidla, které inhibuje růst, proliferaci a metastázy několika nádorů. Léčba nádorů melatoninem zlepšila citlivost na chemoterapii a radioterapii a působila jako synergická molekula při kontrole rakovinných buněk. Kromě toho melatonin zmírňuje akutní poškození normálních buněk a chrání je před toxicitou léků, pravděpodobně posílením imunitních odpovědí [20–22]. Mezi dysfunkcemi a nemocemi, kde byly studovány příznivé účinky melatoninu, patří neurologické, jako je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, fibromyalgie, deprese, porucha pozornosti spojená s hyperaktivitou, autismus a migrény; kardiovaskulární zdravotní problémy, včetně hypercholesterolémie, hypertenze, metabolického syndromu a glykemické nerovnováhy; gastrointestinální zdravotní problémy, jako je gastroezofageální reflux, vředy a syndrom dráždivého tračníku; imunologické zdravotní problémy, jako je roztroušená skleróza, autoimunitní reakce (atletický stres, toxický stres, psoriáza atd.), sepse, COVID-19 atd. [3,23–26]; a mimo jiné také osteopenie [27], sarkopenie [28], preeklampsie, fertilita, syndrom polycystických ovarií a menopauza [29–32]. I když je melatonin molekulou, která je široce studována již od 50. let 20. století, provedené studie vyžadují více klinických a rozsáhlejších dvojitě zaslepených studií k objasnění jeho někdy matoucího pleiotropního účinku [33,34].

Nicméně melatonin je dobře známý jako hormon, který reguluje spánek. Jeho oscilující hladiny v krevním toku podle období světla a tmy (cirkadiánní rytmy) v důsledku uvolňování melatoninu epifýzou je jedním z nejvíce prostudovaných a známých aspektů této molekuly. Zvýšení hladiny melatoninu v krvi během první fáze spánku na přibližně 150–220 pólů/ml působí na iniciaci spánku, snižuje latenci a fragmentaci spánku a zvyšuje délku a kvalitu spánku [1,35,36]. Melatonin působí jako vnitřní synchronizátor cirkadiánního cyklu spánek-bdění a sezónní rytmicity. V tomto smyslu bylo melatoninem léčeno mnoho poruch spánku, včetně syndromu opožděné spánkové fáze, poruchy spánku při práci na noční směny, sezónní afektivní poruchy, poruchy spánku u nevidomých a stárnoucích a patofyziologické poruchy dětí, s pozoruhodným zlepšením kvality spánku. 37–41]. Nejrozšířenější poruchou léčenou melatoninem je jet lag – rozfázování rytmů spánku a bdění po transoceánských letech [42–45]. Důraz ve studiích na jeho roli jako regulátoru spánku pravděpodobně způsobil nedostatek studií o jeho možné roli v mnoha dalších fyziologických a klinických aspektech.

Melatonin v rostlinách, tzv. fytomelatonin, byl objeven současně třemi výzkumnými skupinami v různorodém rostlinném materiálu v roce 1995 [46–48]. Termín fytomelatonin, který označuje melatonin rostlinného původu (rostliny a řasy), se používá k jeho odlišení od melatoninu živočišného a/nebo syntetického. Tento termín je velmi rozšířený a neustále se používá ve studiích fytochemie, fyziologie rostlin, botaniky, chemie potravin atd. o rostlinném melatoninu. V rostlinách je fytomelatonin také pleiotropní molekulou, která má více rolí v různých fyziologických reakcích (obrázek 1). Regulace melatoninem aspektů, jako je fotosyntéza, včetně stomatálního příjmu CO2 a hospodaření s vodou, metabolismus sacharidů, lipidů, dusíku a síry a metabolismus jednoduchých fenolů, flavonoidů a terpenoidů, prokázala zásadní zájem o základní a technické procesy vegetativního (klíčení, růst rostlin, zakořeňování, větvení atd.) a reprodukční vývoj, včetně plodnosti, partenokarpie, vývoje semen a plodů, zrání, stárnutí a konzervace plodů a řezaných květin [49–53]. Obecně melatonin reguluje tyto procesy působením sítě rostlinných hormonů, up/downreguluje několik biosyntézních, katabolických a transkripčních faktorů, které s rostlinnými hormony souvisí [54–56]. Jedním z aspektů největšího agronomického a biotechnologického zájmu je úloha fytomelatoninu jako promotoru tolerance vůči biotickým a abiotickým stresům [57–68] (obrázek 1). V současné době je fytomelatonin prezentován jako zajímavý ekologický nástroj pro kontrolu biologických chorob a pro usnadnění odolnosti/adaptace rostlin na/proti změně klimatu.

2. Biosyntéza melatoninu

Melatonin je acetylovaná sloučenina odvozená od serotoninu. Oba indolové aminy jsou syntetizovány z aminokyseliny tryptofan biosyntetickou cestou, která byla rozsáhle studována u zvířat i rostlin [69,70]. V rostlinách je tryptofan přeměněn na tryptamin enzymem tryptofan dekarboxylázou (TDC) (obrázek 2). Tryptamin je poté přeměněn na 5-hydroxytryptamin (serotonin) tryptaminovou 5-hydroxylázou (T5H), enzymem, který byl rozsáhle studován v rýži a který by mohl působit s mnoha substráty, ačkoli to nebylo studováno do hloubky. Serotonin je N-acetylován serotonin-N-acetyltransferázou (SNAT). N-acetylserotonin je poté methylován acetylserotoninmethyltransferázou (ASMT) – hydroxyindol-O-methyltransferázou – která vytváří melatonin. V rostlinách může být methylace N-acetylserotoninu také provedena pomocí O-methyltransferázy kyseliny kávové (COMT), třídy enzymů, které mohou působit na různé substráty, včetně kyseliny kávové a kvercetinu [71]. Serotonin může být také transformován na 5-methoxytryptamin pomocí ASMT/COMT za vzniku melatoninu po působení SNAT. Tato cesta by nastala v senescenci a/nebo stresových situacích [70,72]. Kromě toho může být melatonin generován tvorbou N-acetyltryptaminu pomocí SNAT, který by byl přeměněn na N-acetylserotonin pomocí T5H [73], ačkoli tato cesta nebyla prokázána, pravděpodobně proto, že T5H je nejméně prozkoumaný enzym této dráhy. (Obrázek 2). Zajímavé je, že v rostlinách rýže byly identifikovány až čtyři geny kódující histondeacetylázy (DAC), které dokážou zvrátit kroky ze serotoninu na N-acetylserotonin az 5-methoxytryptaminu na melatonin. DAC, exprimovaný v chloroplastech, vykazoval enzymatickou aktivitu vůči N-acetylserotoninu, N-acetyltryptaminu a melatoninu, s nejvyšší deacetylázovou aktivitou pro N-acetyltyramin [74].

V živočišných buňkách se serotonin tvoří z 5-hydroxytryptofanu po sekvenčním působení tryptofanhydroxylázy (TPH) a TDC. Ačkoli TPH nebyl v rostlinách detekován, přítomnost 5-hydroxytryptofanu naznačuje, že určitá enzymatická aktivita, jako je aktivita TPH, působí v rostlinných buňkách v menší míře. Kromě toho může být melatonin generován tvorbou 5-methoxytryptaminu, zejména za stresových podmínek, jak navrhuje několik autorů, což naznačuje, že cesta biosyntézy melatoninu může sledovat různé alternativní cesty ve srovnání se zvířecími buňkami, s větší schopností adaptace. k metabolickým změnám v rostlinách [72,75]. Všechny jmenované enzymy byly detekovány a charakterizovány v rýži a Arabidopsis, kromě TPH, který je dobře známý u zvířat, ale ne u rostlin. Někteří autoři nicméně navrhli, že T5H může působit jako hydroxyláza s nízkou substrátovou specificitou a je schopna působit ve všech popsaných hydroxylačních krocích [70,76–79]. Tuto stejnou širokou substrátovou specifitu lze také připsat enzymům SNAT, ASMT a COMT. Meziprodukty melatoninu jsou produkovány v různých subcelulárních kompartmentech, jako je cytoplazma, endoplazmatické retikulum, mitochondrie a chloroplasty, které určují následné enzymatické kroky [80,81].

U mikroorganismů existuje jen málo studií o dráze biosyntézy melatoninu [82]. Saccharomyces a bakterie (Geobacillus, Bacillus a Pseudomonas) produkovaly serotonin i melatonin v různých koncentracích [83–89]. Produkci melatoninu navíc doložili jiní autoři v kulturách kvasinek Pichia kluyveri, Saccharomyces cerevisiae a S. uvarum a bakterií (Agrobacterium, Pseudomonas, Variovorax, Bacillus a Oenococcus) [85,90,91] a dříve u fotosyntetických bakterií Rhodospirillum rubrum [92] a Erythrobacter longus [93] a Escherichia coli [94].

U kvasinek Saccharomyces cerevisiae se na rozdíl od rostlin a zvířat zdá, že k biosyntéze 5-hydroxytryptofanu z tryptofanu nedochází. Je zajímavé, že několik popsaných stadií se zdá být u S. cerevisiae reverzibilní, například mezi {{1}hydroxytryptofanem a serotoninem, N-acetylserotoninem a melatoninem a 5-methoxytryptaminem a melatoninem [90,95], jak je podrobně uvedeno na obrázku 2. U Bacillus amyloliquefaciens SB-9 a Pseudomonas fluorescens RG11, 5- hydroxytryptofan, serotonin a N-acetylserotonin, ale nebyl detekován žádný tryptamin [85,86]. K vytvoření kmene Escherichia coli produkujícího melatonin bylo tedy použito několik genů bakteriálního původu. Byly například testovány gen DDC kódující dekarboxylázu aromatických L-aminokyselin z Candidatus Koribacter versatile Ellin 345 a Draconibacterium orientale a gen AANAT kódující alkylamin N-acetyltransferázu ze Streptomyces griseofuscus [96,97]. Nepochybně jsou zapotřebí další studie k objasnění kompletních biosyntetických drah melatoninu u různých prokaryotických a eukaryotických mikrobů [82].

3. Biologický melatonin versus syntetický melatonin

Zpočátku byl melatonin získáván pro experimentální a klinické studie ze zvířecích zdrojů (hlavně z epifýzy a moči), s následným rizikem přenosu viru [98,99]. Tyto techniky byly staženy, když bylo možné získat melatonin chemickou syntézou [100]. V současné době se veškerý melatonin používaný pro průmyslové a lékařské účely získává pomocí metod chemické syntézy. Tyto metody, které v 80. letech představovaly vážné problémy, včetně úmrtí v důsledku přítomnosti vedlejších produktů syntézy z tryptofanu [101], jsou dnes mnohem bezpečnější a účinnější. Melatoninové přípravky však popsaly přítomnost celé řady nežádoucích vedlejších produktů vzhledem k jejich toxické povaze. Obrázek 3 ukazuje tři nejběžněji používané cesty chemické syntézy melatoninu a vedlejších produktů, které vznikají při jeho syntéze [102]. Syntéza melatoninu z derivátů tryptofanu (obrázek 3, schéma A) vytváří toxické vedlejší produkty, které někdy způsobily významná onemocnění, jako je syndrom eozinofilie-myalgie [101,103,104], zatímco nejmodernější metody (obrázek 3, schéma B) syntéza melatoninu z ftalimidu [105] vyvolává důležité pochybnosti o toxicitě několika vedlejších produktů, které vznikají [106]. Navíc Fischerovy indolové reakce z allylaminu (obrázek 3, schéma C) představují nebezpečné a toxické reaktanty [107].

Na druhé straně je získávání melatoninu z jiných než živočišných biologických zdrojů prezentováno jako silný závazek do budoucna, nikoli nahradit syntetický melatonin, ale být přirozenějším doplňkovým a alternativním zdrojem [108].

4. Strategie k získání biologického melatoninu

Melatonin je přítomen ve všech známých biologických druzích, od prokaryot po eukaryota, včetně kvasinek, řas, hub a rostlin, jakož i zvířat [80,109–111]. Níže jsou uvedeny metodiky vyvinuté v mikroorganismech a rostlinách jako možných zdrojích přirozeného melatoninu.

4.1. Melatonin z mikroorganismů

A. Saccharomyces

První přístup k produkci biologického melatoninu nedávno učinila skupina dánské farmaceutické společnosti Novo Nordisk pomocí geneticky modifikované Saccharomyces cerevisiae (tabulka 1, produkt #1). Germann a spolupracovníci zkonstruovali rekombinantní melatoninovou dráhu v kmeni kvasinek, který obsahoval heterologní geny kódující několik enzymů biosyntézy melatoninu a dráhy podporující kofaktor [112]. Transgenní kvasinky kodifikovaly různé geny z Rattus norvegicus, Lactobacillus ruminis, Pseudomonas aeruginosa, Homo sapiens, Schistosoma mansoni, Bos Taurus a Salmonella enterica. Při krmení kvasinek pouze glukózou a acetyl Co-A dosáhla produkce melatoninu 14,5 mg·l −1 za 76 hodin. Přesto je podle jiných autorů nutné řešit některé problémy, jako je vysoká akumulace N-acetylserotoninu v kvasinkových buňkách, nevyvážená genová exprese a identifikace některých potenciálních toxických meziproduktů [113].

b. Escherichia coli

Ve druhém přístupu, tentokrát s použitím transgenně modifikované kultury Escherichia coli (tabulka 1, produkt #2), Novo Nordisk uvedl biologickou produkci melatoninu z heterologního kmene konstruovaného z rekombinantní E. coli, včetně několika genů, jako je gen TDC z Candidatus Koribacter versatile, gen SNAT ze Streptomyces griseofuscus a lidský gen ASMT. Navíc byly některé geny související s tryptofanem blokovány nebo deletovány, aby se zabránilo nežádoucí represi, degradaci a exportnímu transportu [96,97]. Po několika vylepšeních kmene a krmení minerálními solemi, vitamíny a antibiotiky, kultivované buňky generovaly melatonin v ~1 g·l −1 s použitím glukózy jako jediného zdroje uhlíku a až 2 g·l −1 v buňkách živených tryptofanem, se zanedbatelným množstvím vedlejších produktů. Tyto GMO kmeny E. coli tedy podle autorů mohou být základem pro budoucí biologicky komerční produkci melatoninu pomocí továren na mikrobiální buňky. Nicméně použití transgenních organismů k výrobě látek pro lidskou spotřebu může být problematické, pokud je cílem přinést přírodní produkt citlivému spotřebiteli nebo spotřebiteli anti-GMO.

C. Bakterie mléčného kvašení

Melatonin byl také produkován průmyslově mikrobiální fermentací, jak je uvedeno v [114]. Biosyntéza melatoninu byla řízena multikmenovými bakteriemi mléčného kvašení, jako je Lactobacillus sp. (L. brevis, acidophilus, bulgaricus, casei subspecies. saké, fermentum, helveticus subspec. jogorti, plantarum); Bifidobacterium sp. (B. breve spp. breve, longum spp. infantis); Enterococcus sp. (E. faecalis TH10); a Streptococcus thermophilus. Produkty vyrobené touto technologií jsou prodávány společností Quantum Nutrition Labs (Texas, USA) jako Melatoninové kapky, Qultured™, obsahující 8 mg kvasinkového melatoninu (tabulka 1, produkt #3).

d. Chlorella

Produktem vyrobeným z řas je Herbatonin® (tabulka 1, produkt č. 4), formulovaný v pilulkách obsahujících 0,3 nebo 3 mg fytomelatoninu, ačkoli v Evropě se prodává v dávkách 0,3 a 1,9 mg podle zákonů EU. Tato formulace obsahuje několik rostlinných druhů, jako je rýže (Oryza sativa L.) a vojtěška (Medicago sativa L.), spolu se zelenou řasou Chlorella pyrenoidosa a C. vulgaris. Naše data ukazují, že tyto mikrořasy neobsahovaly více než 2–15 ng·g DW−1 [115] a doprovodné druhy rostlin obsahují velmi nízké hladiny fytomelatoninu, 1–5 ng·g−1 v rýži a 16 ng·g −1 u vojtěšky [116]. Přítomnost chlorelly naznačuje, že fytomelatonin se získává hlavně kultivací zelených řas v bioreaktorech, případně živených prekurzory, jako je tryptofan, podobným způsobem jako v Achillea millefolium [117], i když neexistují žádné publikované údaje o metodě získání těchto extraktů bohatých na fytomelatonin, pouze jejich biochemická charakterizace [118]. Neexistují ani údaje o kontrole přítomnosti cyanotoxinů v těchto extraktech z důvodu možné kontaminace sinicemi (modrozelené řasy). Tyto cyanotoxiny mají několik nežádoucích účinků souvisejících mimo jiné s karcinogenitou, hepatotoxicitou a neurotoxicitou. Detekce cyanotoxinů v některých doplňcích stravy pro řasy tedy posiluje potřebu lepší kontroly kvality [119,120].

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】