Melatonin zabraňuje infiltraci T lymfocytů do ledvin hypertenzních potkanů, vyvolané dietou s vysokým obsahem soli, tím, že zabraňuje expresi chemokinů ligandu CXCR3

Další informace:{0}}

Ariel Bier¹, Rawan Khashab², Yehonatan Sharabi^1,2,3, Ehud Grossman^1,2,3a Avshalom Leibowitz^1,2,3,*

¹Medicine D, The Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Izrael; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)² Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com³Sacklerova lékařská fakulta, Tel-Aviv University, Tel-Aviv 6997801, Izrael*

Abstrakt: V předchozí studii jsme to prokázalimelatoninbráníledvinapoškození v modelu hypertenze vyvolané solí snížením oxidačního stresu. Předpokládali jsme, že tento účinek zahrnuje imunomodulační vlastnosti melatoninu. Studie in vivo – Dahlovo krysy citlivé na sůl (DSS) dostávaly normální potravu, dietu s vysokým obsahem soli (HSD) nebo HSD amelatonin(30 mg/kg/den) ve vodě po dobu 8 týdnů.Ledvinybyly odebrány pro okamžitou izolaci a charakterizaci lymfocytů průtokovou cytometrií (CD3 plus CD4 plus a CD3 plus CD8 plus) a pro chemoatraktant lymfocytů (hlavně CXCLchemokiny) studie genové exprese. In vitro studie na potkanech, mezangiální buňky (RMC) byly kultivovány v médiu s vysokým obsahem soli bez a smelatonin. HSD byla spojena s významnou renální infiltrací CD4 plus a CD8 plus T lymfocytů ve srovnání s kontrolou. Melatonin významně redukoval infiltraci ledvinných lymfocytů. HSD významně zvýšila expresi mRNA CXCLchemokinyPřidání melatoninu k HSD tento efekt zrušilo. Ošetření buněk RMC solí zvýšilo expresi CXCL10 a CXCL11, ale ne CXCL9. Přidávánímelatonindo kulturních médií tomuto nárůstu zabránily. Léčba potkanů ​​krmených HSD melatoninem snížila expresi chemoatraktantu mRNA renálních lymfocytů a je spojena s významným snížením infiltrace renálních T lymfocytů. Sůl může mít přímý účinek na renální buňky produkující chemokiny, což je otupeno léčbou melatoninem.

klíčová slova:melatonin; sůl; T-lymfocyty; hypertenze;ledvina; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11

1. Úvod

Hypertenze (HTN) je hlavním ovlivnitelným kardiovaskulárním rizikovým faktorem. V důsledku stárnutí populace se prevalence HTN neustále zvyšuje, u pokročilého věku dosahuje až 30 procent [1]. Navzdory různým léčebným terapeutickým možnostem je celosvětová kontrola HTN špatná. Důsledky nekontrolované HTN jsou zničující a mají obrovský negativní dopad na veřejné zdraví [2].

Na patogenezi HTN se podílejí různé behaviorální, environmentální a genetické faktory. Vysoký obsah soli v západní stravě je považován za hlavní přispěvatel k HTN a je spojen se zvýšenou nemocností a mortalitou. Směrnice a veřejné iniciativy doporučují snížit příjem soli u běžné populace. Ne každý jedinec však může mít prospěch z tohoto omezení, protože patofyziologie spojující citlivost na sůl s HTN není plně pochopena a vyžaduje lepší pochopení mechanismu [3]. Nové strategie jsou tedy klíčové pro lepší pochopení a kontrolu HTN, takže nová výzkumná paradigmata jsou okamžitou potřebou.

Bylo zjištěno, že zánět a oxidační stres se podílejí na patogenezi esenciálních HTN. Při výzkumu spouštěčů, které tyto procesy spouštějí a pokračují, mnoho experimentálních modelů HTN naznačuje zapojení adaptivní imunitní odpovědi [4].

Klikněte naPřínosy a vedlejší účinky Cistanche pro funkci ledvin

Vodítka spojující adaptivní imunitu s HTN existují již od 60. let 20. století. Avšak teprve v poslední době, s lepším pochopením imunitního systému, bylo možné v tomto směru dosáhnout pokroku. Průkopnická studie Guzika et al. prokázali, že angiotenzin (Ang) II nebo deoxykortikosteronová (DOC) sůl HTN byla otupena u rag1−/− myší, které mají deficit T a B lymfocytů, a adoptivní přenos T, ale ne B buněk, by mohl obnovit BP odpověď [5]. Od tohoto článku bylo zjištěno, že různé složky adoptivní imunity jsou relevantní pro patogenezi HTN u většiny běžných zvířecích modelů. Role T buněk v modelu HTN indukovaném solí byla také rozsáhle studována. Studie in vitro ukazují, že sůl může tlačit diferenciaci naivních T buněk na TH17 buňky [6]. Četné práce in vivo na modelech HTN indukovaných dietou s vysokým obsahem soli (HSD), jako jsou potkani in Dhal citliví na sůl (DSS), prokázali rozsáhlou infiltraci T-buněk ledvinami [7–9].

Mezi mnoha fyziologickými procesy, např.melatoninuzapojení do regulace krevního tlaku je poněkud intuitivní. Cirkadiánní vzorec krevního tlaku podporuje extenzivní výzkum týkající se melatoninu a HTN. Mnoho prací v minulosti na lidech a na experimentálních modelech spojovalo nízké hladiny melatoninu s HTN [10]. Některé klinické údaje naznačují, že suplementace melatoninem může léčit HTN, zejména u pacientů s noční HTN [11]. Nekonzistentnost těchto údajů však vyvolává otázky, zda se na regulaci krevního tlaku podílejí i necirkadiánní vlastnosti melatoninu.

Protizánětlivé a antioxidační vlastnosti melatoninu naznačují, že melatonin interaguje s imunitním systémem. Objevující se údaje naznačují roli melatoninové signalizace ve vývoji, aktivaci, diferenciaci a paměti T buněk. Existují důkazy, žemelatoninna T buňkách jsou přítomny membránové a jaderné receptory [12,13].melatoninovlivňuje produkci mnoha cytokinů zapojených do imunitní odpovědi, jako je interferon (IFN) – což je hlavní regulátor Th1 odpovědi [14].

Oxidační stres a reakce T buněk podle některých výzkumníků společně podporují rozvoj HTN a orgánového hypertenzního poškození [15]. V naší předchozí práci jsme to ukázalimelatoninsnižuje lokální (renální) oxidační stres a zabraňuje solím indukované renální fibróze a proteinurii v modelu HTN potkanů ​​citlivých na sůl (model DSS) [16]. Protože oxidační stres má klíčovou roli v adaptivní imunitní odpovědi spojené s HTN, předpokládali jsme, že imunomodulační vlastnosti melatoninu jsou zodpovědné za jeho ochrannou roli v HTN indukované HTN.

Cílem této studie je zhodnotit, zdamelatoninsnižuje sůl indukovanou T buněčnou odpověď a objasňuje mechanismy odpovědné za tento účinek.

2. Materiály a metody

2.1. Zvířata a protokol studie

Protokol studie byl schválen institucionálním výborem pro etiku zvířat v lékařském centru Sheba v Izraeli. Jejich zdravotní stav byl sledován měřením tělesné hmotnosti a každodenním obecným pozorováním pohybu a zdravotních podmínek pro každé zvíře. Samci potkanů ​​Dahl citliví na sůl, čtyři týdny staří (RGD Cat# 1582190, RRID: RGD_1582190), byli umístěna ve zvířecím zařízení v pravidelných klecích (dva krysy na klec) při 22 ◦C s cyklem 14 světlo/10 h tma. Krysy byly udržovány na normální slané dietě a dostávali vodu z vodovodu k pití ad libitum po dobu pěti dnů aklimatizace. Potkani byli poté rozděleni do tří skupin (n=8) podle stravy po dobu 8 týdnů. Podle etické komise měla být utracena zvířata, která vykazovala známky nemoci a utrpení.

Kontrolní skupina byla krmena standardní stravou pro potkany (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) a vodou z vodovodu; skupina s vysokým obsahem soli (HSD) byla krmena odpovídající obohacenou slanou dietou (4 procenta) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) a vodou z vodovodu.melatoninskupina byla krmena stejnou dietou obohacenou solí (4 procenta) s melatoninem (M5250; Sigma, Rehovot, Izrael) (30 mg/kg/den) v pitné vodě. Tělesná hmotnost a spotřeba vody byly pravidelně měřeny. Správné množství melatoninu bylo rozpuštěno v odpovídající vodě potřebné pro každou klec, aby se dodala správná dávka pro každé zvíře. Den nula je definován jako den zahájení spotřeby HSD a melatoninu. Na konci studie byly krysy usmrceny hlubokou anestetizací 3% isofluranem (hloubka anestezie potvrzena stlačením zadní nohy) aledvinybyly sklizeny. Obě ledviny byly odstraněny a hemisovány. Ledviny byly odebrány pro analýzu průtokovou cytometrií s výjimkou několika částí, které byly rychle odebrány a rychle zmraženy v tekutém N2 a skladovány při -80 ◦C. Pro extrakci RNA byly použity zmrazené tkáně.

Příznaky onemocnění ledvin Cistanche

2.2. Kvantitativní reverzní transkripční PCR v reálném čase

Hladiny exprese mRNA genů byly zjištěny vledvinatkáně pomocí kvantitativní PCR s reverzní transkriptázou v reálném čase (qRT-PCR). Celková RNA byla extrahována z ledvinové tkáně pomocí soupravy NucleoSpin RNA Kit (MACHERY-NAGEL, Düren, Německo). Reverzní transkripce byla provedena pomocí sady Applied Biosystems High-Capacity cDNAReverse Transscription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Reakce qRT-PCR byly provedeny pomocí Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) a Applied Biosystems 7500 systému PCR v reálném čase. Podmínky cyklování byly: první jediný krok 95 ◦C po dobu 0,20 min a poté 40 cyklů fáze tání po dobu 3 s při 95 ◦C a prodloužená fáze 30 s při 60 ◦C. Na konci 40 cyklů byla provedena fáze křivky tání. Jako vnitřní kontrola byla použita mRNA podjednotky PO (Rplp0) ribozomálního proteinu. Primery jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1. Seznam potkaních primerů použitých v této studii.

2.3. Izolace T buněk z ledvin

Po odstranění ledvinového pouzdra, dvaledvinybyly rozemlety a dráždeny pístem 2ml injekční stříkačky přes 100 um buněčné síto v RPMI 1640 obsahujícím 2 mML-glutaminu, 10 procent FBS, 10 ug/ml DNázy 1 (Stem Cells technologies, Cambridge, MA , USA) a 0,1 procenta kolagenázy typu IV (CLS 4, Worthington Decatur, AL, USA). Roztok byl inkubován po dobu 25 minut při 37 °C. Promývací roztok (DPBS/2 procenta FBS/2 mM EDTA) byl poté přidán k ledvinovému homogenátu do objemu 45 ml a byl zfiltrován přes 70 um buněčný filtr. Roztok byl centrifugován při 400 x g/7 min. a peleta byla suspendována v 5 ml promývacího roztoku a přefiltrována přes 40 um buněčné síto a znovu odstředěna při 400 x g/7 min. Peleta byla resuspendována ve 3 ml FBS (10 mM EDTA) a navrstvena na Histopaque-1083 (Sigma, Rehovot, Izrael) a centrifugována při 20 °C při 400 x g/30 min s vypnutým brzděním. Vrstva mononukleárních buněk spočívající nad Histopaque byla odstraněna, dvakrát promyta promývacím roztokem a suspendována v 5 ml promývacího roztoku pro průtokovou cytometrickou analýzu.

2.4. Průtoková cytometrie

Z každé skupiny,ledvinybylo analyzováno 5–7 krys. Pro každý vzorek bylo odebráno 1 × 106 buněk. Izolované mononukleární buňky byly inkubovány s extracelulárními markery: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) a její izotypová kontrola (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) a jeho izotypová kontrola (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) a jeho izotypová kontrola (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRID: AB_657914). Všechny buňky byly analyzovány průtokovou cytometrií (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401) pomocí softwaru FlowJo (FlowJo, RRID: SCR-008520).

Cistanche-funkce ledvin

2.5. Buněčná kultura

Buněčná linie mesangiálních potkanů, RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506), byla získána od ATCC®. Buňka byla kultivována v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (01-055-1A, biologický průmysl, Beit HaEmek, Izrael) se 4 mM L-glutaminem upraveným tak, aby obsahoval 1,5 g/l hydrogenuhličitanu sodného a 4,5 g/l glukózy a doplněným 0,4 mg/mLG418 a 15 procent fetálního hovězího séra. Melatonin byl získán od Sigma (M5250 Rehovot, Izrael). A 250 mMmelatoninzásobní roztok byl vyroben v ethanolu. Buňky byly kultivovány v normálních podmínkách nebo za podmínek s vysokým obsahem soli (s přidáním 80 mM NaCl do média) bez nebo s melatoninem (0,5 mM). Ošetření melatoninem bylo načasováno 45 minut před přidáním NaCl do média. Všechny experimenty byly v 6jamkových destičkách s 3 x 105 buňkami na jamku a byly prováděny 6 nezávislými zkouškami.

2.6. Statistická analýza

Data jsou prezentována jako průměr ± SEM Statistické analýzy byly provedeny pomocí IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. Jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA) a posthoc Tukeyova metoda zkoumaly rozdíly mezi skupinami. Data qPCR v reálném čase byla analyzována pomocí DataAssist, RRID: SCR_014969.

3. Výsledky

3.1. Melatonin chrání krysy konzumující HSD

Věk potkanů ​​během této studie byl 4–13 týdnů. V tomto věku je zdraví potkanů ​​indikováno přírůstkem hmotnosti, který vykazovala kontrolní skupina [17]. Skupina HSD však dosáhla plató v den 30 a přidánímelatoninHSD tento jev zlepšil (obrázek 1A). Skupina HSD vykazovala vysokou úmrtnost, kde 50 procent krys během experimentálního období zemřelo nebo mělo klinický stav, který vyžadoval eutanazii podle pravidel zvířecí etické komise. Doplňky melatoninu významně zabránily úmrtnosti potkanů, kde pouze jeden z osmi potkanů ​​zemřel v den 58, na konci experimentálního období (obrázek 1B).

Obrázek 1.melatoninzlepšení krevního tlaku a přežití u HSD. DSS potkani byli léčeni po dobu 9 týdnů HSD s melatoninem a bez melatoninu. Dieta s vysokým obsahem soli snížila tělesnou hmotnost od 36. dne a melatonin tento účinek zmírnil (A). HSD zvýšila úmrtnost od 4. dne0. Léčba HSD-fedratů melatoninem zlepšuje jejich přežití. (B). (n=8) *-p Menší nebo rovno 0,05 sůl a sůl plus melatonin versus kontrola. #-p Menší nebo rovno 0,05 soli oproti kontrole a soli plus melatoninu. HSD – dieta s vysokým obsahem soli.

3.2. Melatonin zabraňuje infiltraci T-buněk ledvin indukované HSD

Izolovali jsme buňky zledvinaa přidělil je k T buněčnému markeru, CD3. Buňky CD3 plus byly přiřazeny k CD4 a CD8. Jak CD3 plus CD4 plus, tak CD3 plus CD8 plus byly významně vyšší v HSD (5,18 ± 1,62 a 4,6 ± 0,75 procent, v tomto pořadí) ve srovnání s kontrolou (0,16 ± {{18} }.{{20}}2 a 0,95 ± 0,15 procenta) amelatoninsuplementace k HSD snížila buňky CD3 plus CD4 plus a CD3 plus CD8 plus zpět na kontrolní úrovně (0,68 ± 0,21 a 1,37 ± 0,45, v tomto pořadí) (obr. 2A–D).

Obrázek 2. Melatonin zabraňuje infiltraci T buněk doledvina. T buňky byly izolovány z ledvin krys a byly testovány na CD3. CD3-pozitivní buňky byly bráněny na CD4 a CD8. Melatonin (C) redukoval jak CD3 plus CD4 plus, tak CD3 plus CD8 plus ve srovnání s HSD bez melatoninu (B) bez rozdílu od kontrolní skupiny (A). Analýza pro všechny krysy je uvedena v (D) (n=7–8). HSD – dieta s vysokým obsahem soli. *-p Menší nebo rovno 0.05 versus kontrola. #-p Menší nebo rovno 0,05 oproti soli plus melatoninu.

3.3. Melatonin redukuje určité ledvinové chemokiny, které byly upregulovány u HSD

Nábor T buněk do zánětlivých tkání je regulován lokální expresí chemokinů. Proto jsme měřili expresi dvou chemokinových rodin u krysledviny: rodina chemokinových (CXC motiv) ligandů (CXCL) a chemokinových (C-Cmotif) ligandů (CCL).

Pro rodinu CXCL, CXCL 9, 10 a 11, které přitahují T buňky k jejich cílové tkáni pomocí CXCR3 receptoru na T buňkách, byly významně upregulovány u HSD potkanů. DoplněnímelatoninStejný vzorec byl detekován pro CXCL 1 a 16. Avšak pro CXCL12 nebyla detekována žádná upregulace v HSD (obrázek 3A).

U CCL rodiny CCL 2, 4, 12, 17, 19 a CX3CL1 nevykázaly žádnou upregulaci u HSD. CCL3 byl upregulován u HSD, ale nebyla detekována žádná významná změna po přidání melatoninu do stravy. U CCL7 došlo k výraznému zvýšení regulace HSD a výraznému snížení regulace s přidánímmelatonink HSD (obrázek 3B).

Obrázek 3. Upregulaceledvinychemokinyu HSD s melatoninem a bez melatoninu. U krys byla stanovena exprese chemokinu (motiv CXC) ligandu (CXCL) rodiny (A), chemokinu (motiv CC) ligandové rodiny a CX3CL1 (B). (n=7–8) *-p Menší nebo rovno 0.05 versus kontrola. #-p Menší nebo rovno 0,05 oproti soli plus melatoning. HSD – dieta s vysokým obsahem soli.

3.4. Přímý účinek melatoninu na RMC mesangiální buněčnou linii

Poté jsme se zaměřili na CXCL9, 10 a 11, které přitahují T buňky vazbou na receptor CXCR3. Určili jsme jejich výrazchemokinyv buňkách RMC, které jsou krysí mezangiální buněčnou linií.

Buňky jsme ošetřili 80 mM NaCl bez as 0,5 mMmelatonin. Tato koncentrace NaCl významně zvýšila expresi CXCR10 o 2,4 ± 0.26-krát ve srovnání s kontrolou a přidání 0,5 mM melatoninu významně snížilo tento výraz na 1,4 ± 0.{{10}}krát ve srovnání s kontrolou (obrázek 4A). Pro CXCL11 80 mM NaCl významně zvýšilo expresi o 3 ± 0.{16}}krát ve srovnání s kontrolou a přidání 0,5 mM melatoninu významně snížilo tuto expresi na 1,8 ± 0.{22 }}násobek ve srovnání s kontrolou (obrázek 4B). CXCL9 nebyl detekován v buňkách RMC.

Obrázek 4. Sůl upregulovala expresi CXCL10 a CXCL11 v mesangiální buněčné linii, kde léčba melatonem snížila její expresi. RMC (krysí mesangiální buněčná linie) byly ošetřeny solí 80 mM s a bez 0,5 mM melatoninu. CXCL10 (A) a CXCL11 (B) byly zvýšeny úpravou solí a přidánímmelatoninsnížit tuto regulaci. Grafy představují 6 nezávislých pokusů. *-p Menší nebo rovno 0.{5}}01 versus kontrola #-p Menší nebo rovno 0.005 versus sůl 80 mM a melatonin 0,5 mM. $-p Menší nebo rovno 0,05 oproti soli 80 mM a melatoninu 0,5 mM.

4. Diskuze

Příznivý účinekmelatoninna HTN byla prokázána v předchozích studiích a byla navržena jako možný postup u HTN rezistentní na léčbu [18]. V naší první studii jsme se zaměřili na oxidační stres a odhalili jsme, že melatonin snižuje oxidační stres vyvolaný HSD. V této studii jsme se zaměřili na adaptivní imunitní efekt a ukázali jsme, že melatonin zlepšuje přežití potkanů ​​krmených HSD. Tento účinek je spojen se snížením počtu T buněk infiltrujících ledviny a downregulacíledvinaexprese chemokinů.

Historické údaje ukazují, že u DSS potkanů ​​konzumujících HSD se vyvine závažná HTN a vykazují vyšší úmrtnost [19]. Sám Dahl při vytváření modelu uvedl, že když byli potkani DSS umístěni na HSD (8 procent NaCl) při odstavení (ve věku 21–23 dnů), rychle se u nich rozvinula HTN a všichni zemřeli do 16. týdne krmení solí [20]. Lateron, po některých modifikacích kmene, Rapp et al. uvedli, že všechny krysy byly mrtvé do osmi týdnů po HSD (8 procent NaCl) [21]. Potkani v naší studii měli vysokou míru úmrtnosti, ale nedosáhli 100 procent, pravděpodobně kvůli nižšímu procentu (4 procenta) soli v jejich stravě. Přesto je zřejmé, žemelatoninsuplementace významně zabránila úmrtnosti potkanů.

Přibývání na váze je ukazatelem pohody potkanů ​​ve věku 4–13 týdnů. DSS ratsoriginate ze Sprague Dawley, což je dobře charakterizovaný kmen. Ve věku krys, které jsme použili v našich experimentech, se předpokládá, že krysy trvale přibírají na váze [22]. V mnoha studiích na zvířatech je redukce hmotnosti považována za jeden z „koncových bodů“ experimentů [23]. Z několika studií je zřejmé, že HSD u DSS potkanů ​​vede k nižšímu přírůstku hmotnosti ve srovnání s kontrolami [24,25]. V souladu s těmito studiemi jsme také pozorovali váhové rozdíly mezi skupinami. Zde krysy nepřibraly na váze po čtyřech týdnech HSD. Melatonin také zastavil tento účinek HSD, protože krysy, které byly léčeny melatoninem, nadále přibývaly na váze, i když méně než kontroly.

Schopnostmelatoninke snížení krevního tlaku na zvířecích modelech byl objeven koncem sedmdesátých let 20. století [26–28]. Od té doby to bylo hlášeno v několika dalších modelech, jako například, že dieta s vysokým obsahem fruktózy indukuje metabolický syndrom u spontánně hypertenzních potkanů ​​[29,30]. Naše studie v této oblasti jsou první, které ukazují, že melatonin hraje roli v HTN indukovaném solí tím, že zabraňuje poškození orgánů a snižuje úmrtnost.

V této studii jsme ukázali, že HSD indukuje infiltraci T lymfocytů doledvina, proces, který byl popsán u DSS potkanů ​​hlavně Mattsonovou skupinou [31–33]. Klíčová role tohoto infiltračního procesu v modelu DSS byla prokázána nedávnou studií, která pozorovala, že DSS potkani s deficitem T-buněk jsou chráněni před HTN indukovaná HSD a přenosem splenocytů exacerbuje HTN citlivou na sůl [34].

Melatonin může ovlivnit T buňky v různých aspektech (přehled viz [35]). Tato studie to poprvé ukázalamelatoninsnižuje přitažlivost CD4 plus i CD8 plus T-buněk kledvinav HSD. Tento účinek melatoninu může být mechanismem podtrhujícím jeho prospěšný účinek v tomto modelu.

Schopnost melatoninu snižovat infiltraci T buněk byla popsána na myším modelu experimentální autoimunitní encefalomyelitidy (EAE). U EAE bylo prokázáno, že melatonin snižuje infiltraci CD4 plus T buněk a Th17 buněk do CNS [36,37].

Přitažlivost T lymfocytů ke specifické tkáni je regulována především místními vysokými koncentracemichemokinycož jsou chemotaktické cytokiny, které řídí migrační vzorce a umístění imunitních buněk. Dvě velké rodiny chemokinů, které indukují infiltraci T lymfocytů, jsou rodiny chemokinů s motivem CXC (CXCL) a ligandy s motivem CC (CCL) [38].

Cistanche pro zlepšení dysfunkce ledvin

V naší studii jsme nenašli konstantní vzorec v reakci rodiny CCL na HSD a namelatonin. Z devítichemokinyv této rodině byly pozorovány pouze CCL7 a CLL21 ke zvýšení jejich exprese v důsledku HSD a suplementace melatoninu ji snižovala. HSD zvýšila expresi CCL3, ale u krys ošetřených melatoninem nebyla detekována žádná redukce. Nedávná studie na stejném modelu ukázala, že HSD upreguluje CCL2 intheledvinapomocí metody RNA-Seq [39]. Tato studie však testovala hladiny ve dnech 3 a 21 po zahájení diety. V naší studii jsme hladiny testovali po osmi týdnech. Je možné, že se exprese chemokinů během období HSD mění.

Naopak hladiny většiny z rodiny CXCL, včetně CXCL 1, 9, 10, 11 a 16, se zvýšily u potkanů ​​léčených HSD amelatoninsuplementace tento přírůstek zrušila. Pouze CXCL12 nevykazoval žádné zvýšení odpovědi na HSD.

CXCL9, CXCL10 a CXCL11, nazývané "interferonem indukovatelné ligandy CXC chemokinového receptoru 3", jsou indukovány IFN- a jsou ligandy CXC chemokinového receptoru 3 (CXCR3). Studie in vivo prokázaly jejich význam při aktivaci a náboru T lymfocytů do cílového orgánu [40–42]. Youn a kol. ukázaly u lidských hypertenzních pacientů jak renální infiltraci T buněk, tak zvýšené cirkulující hladiny všech tří CXCR3chemokiny, což naznačuje, že CXCR3 a jeho ligandy jsou relevantní pro T buňky zapojené do lidské HTN [43]. Jiná studie prokázala, že CXCL10 je u hypertoniků zvýšený a jeho hladiny korelují s jejich hodnotami krevního tlaku [44].

Kvůli těmto studiím jsme se zaměřili na CXCL9, CXCL10 a CXCL11. Kultivovali jsme buněčnou linii mesangiálních potkanů ​​a ošetřili jsme je 80 mM NaCl a 0,5 mM melatoninu. Zjistili jsme, že CXCL 10 a 11 jsou v buňkách upregulovány a melatonin toto zvýšení ruší. Naše výsledky ukazují, že účinek soli na zvýšení CXCL 10 a 11 a opačný účinekmelatonin, byly oba přímo detekovány v mezangiálních buňkách. Naproti tomu CXCL9 nebyl v těchto buňkách detekován.

Naše studie má omezení. V našich výsledcích FACS bylo mnoho CD3 plus dvojitě negativních pro CD4 i CD8. Stejné výsledky byly vidět v Mattsonově studii z roku 2010 [31]. V novějších studiích Mattsonovy skupiny však bylo buněk CD3 plus CD4-CD8- velmi málo [32,33,45,46]. Významný pokles dvojitě negativních buněk CD3 mohl být důsledkem přidání markeru CD45 a pouze analýzou buněk, které byly CD45 pozitivní, což bylo provedeno v pozdějších studiích Mattsona. Je možné, že velká část CD3 plus CD4-CD8- je artefakt. Pro buněčnou populaci CD3 plus CD4 plus a CD3 plus CD8 plus však není znám žádný artefakt.

5. Závěry

Závěrem lze říci, že dieta s vysokým obsahem soli je spojena s infiltrací T buněk doledvinyDSS krys. Sůl také zvýšila expresi specifických chemoatraktantů T buněk v ledvinách. Léčba smelatonin(30 mg/kg/den) odstranil tyto účinky (melatoninsnižuje HSD-indukovanou infiltraci T buněk do ledvin spolu se snížením exprese chemokinu ligandu CXCL3).

Naše studie in vitro ukazuje, že sůl a melatonin mohou regulovat expresi chemoatraktantu přímým ovlivněnímledvinabuňky.

Autorské příspěvky: Conceptualization, AL; formální analýza, AB a RK; vyšetřování, RK;metodika, AB a AL; psaní – původní návrh, AB a AL; psaní – recenze a úpravy, YSand EG Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ní.

Financování: Tento výzkum neobdržel žádné externí financování.

Prohlášení institucionální revizní komise: Protokol studie byl schválen institucionální komisí pro etiku zvířat v lékařském centru Sheba, protokol č. 1219/19/ANIM a protokol Ministerstva zdravotnictví č. 16418.

Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se.

Prohlášení o dostupnosti dat: Údaje uvedené v této studii jsou k dispozici na vyžádání u příslušného autora.

Poděkování: Autoři děkují Zehava Shabtai za její vynikající technickou podporu a Michaelu Kanovskému za jeho redakční služby.

Střet zájmů: Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Olsen, MH; Angell, SY; Asma, S.; Boutouyrie, P.; Burger, D.; Chirinos, JA; Damasceno, A.; Delles, C.; Gimenez-Roqueplo, AP;Hering, D.; a kol. Výzva k akci a strategie životního běhu k řešení globální zátěže zvýšeného krevního tlaku na současné a budoucí generace: The Lancet Commission on hypertension. Lancet 2016, 388, 2665–2712. [CrossRef]

2. O'Brien, E. The Lancet Commission on hypertension: Řešení globální zátěže zvýšeného krevního tlaku na současné a budoucí generace. J. Clin. Hypertens 2017, 19, 564–568. [CrossRef]

3. O'Donnell, M.; Mente, A.; Yusuf, S. Příjem sodíku a kardiovaskulární zdraví. Circ. Res. 2015, 116, 1046–1057. [CrossRef]

4. Schiffrin, EL Mechanismy remodelace malých tepen, antihypertenzní terapie a imunitní systém u hypertenze.Clin. Vyšetřování. Med. 2015, 38, E394–E402. [CrossRef]

5. Guzik, TJ; Hoch, NE; Brown, KA; McCann, LA; Rahman, A.; Dikalov, S.; Goronzy, J.; Weyand, C.; Harrison, DG Role T-buňky v genezi angiotensinem II indukované hypertenze a vaskulární dysfunkce. J. Exp. Med. 2007, 204, 2449–2460. [CrossRef][PubMed]

6. Kleinewietfeld, M.; Manzel, A.; Titze, J.; Kvakan, H.; Yosef, N.; Linker, RA; Muller, DN; Hafler, DA Chlorid sodný pohání autoimunitní onemocnění indukcí patogenních buněk TH17. Příroda 2013, 496, 518–522. [CrossRef]

7. Mattson, DL; Lund, H.; Guo, C.; Rudemiller, N.; Geurts, AM; Jacob, H. Genetická mutace genu 1 aktivujícího rekombinaci u potkanů ​​citlivých na sůl Dahl zmírňuje hypertenzi a poškození ledvin. Dopoledne. J. Physiol. Regul. Celé číslo. Comp. Physiol. 2013, 304, 407–414.[CrossRef]

8. Mattson, DL Infiltrace imunitních buněk vledvinau hypertenze citlivé na sůl a poškození ledvin. Dopoledne. J. Physiol. Ren. Physiol.2014, 307. [CrossRef] [PubMed]

9. Lu, X.; Crowley, SD zánět u hypertenze citlivé na sůl a poškození ledvin. Curr. Hypertens Rep. 2018, 20. [CrossRef][PubMed]

10. Baker, J.; Kempinski, K. Role ofmelatoninpři regulaci krevního tlaku: Doplňkové antihypertenzní činidlo. Clin. Exp. Pharm.Physiol. 2018, 45, 755–766. [CrossRef] [PubMed]

11. Grossman, E.; Laudon, M.; Zisapel, N. Vliv melatoninu na noční krevní tlak: Metaanalýza randomizovaných kontrolovaných studií. Vasc. Správa zdravotních rizik. 2011, 7, 577–584. [CrossRef] [PubMed]

12. Pozo, D.; Delgado, M.; Fernandez-Santos, JM; Calvo, JR; Gomariz, RP; Martin-Lacave, I.; Ortiz, GG; Guerrero, JM Exprese mRNA receptoru Mella-melatoninu v podskupinách T a B lymfocytů z brzlíku a sleziny potkana. Faseb J. Off. Publ. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 1997, 11, 466–473. [CrossRef]

13. Guerrero, JM; Pozo, D.; García-Mauriño, S.; Osuna, C.; Molinero, P.; Calvo, JR Zapojení jaderných receptorů do zvýšené produkce IL-2 melatoninem v buňkách Jurkat. Ann. NY Acad. Sci. 2000, 917, 397–403. [CrossRef] [PubMed]

14. Farez, MF; Mascanfroni, ID; Méndez-Huergo, SP; Yeste, A.; Murugaiyan, G.; Garo, LP; Balbuena Aguirre, ME; Patel, B.; Ysrraelit, MC; Zhu, C.; a kol.melatoninPřispívá k sezónnosti relapsů roztroušené sklerózy. Cell 2015, 162, 1338–1352.[CrossRef] [PubMed]

15. Kirabo, A.; Fontána, V.; de Faria, APC; Loperena, R.; Galindo, CL; Wu, J.; Bikinejevová, AT; Dikalov, S.; Xiao, L.; Chen, W.; et al. DC izoketalově modifikované proteiny aktivují T buňky a podporují hypertenzi. J. Clin. Vyšetřování. 2014, 124, 4642–4656. [CrossRef][PubMed]

16. Leibowitz, A.; Volkov, A.; Voloshin, K.; Shemesh, C.; Barshack, I.; Grossman, E. Melatonin zabraňujeledvinazranění v modelu hypertenze vyvolané vysokou slanou dietou snížením oxidačního stresu. J. Pineal Res. 2016, 60, 48–54. [CrossRef] [PubMed]

17. Hawkins, P.; Morton, DB; Burman, O.; Dennison, N.; Honess, P.; Jennings, M.; Lane, S.; Middleton, V.; Roughan, JV; Wells, S.; et al. Návod k definování a implementaci protokolů pro hodnocení welfare laboratorních zvířat: Jedenáctá zpráva společné pracovní skupiny BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW pro zušlechťování. Laboratoř. Anim. 2011, 45, 1–13. [CrossRef]

18. Šimko, F.; Reiter, RJ; Paulis, L.melatoninjako racionální alternativa v konzervativní léčbě rezistentní hypertenze.Hypertens Res. 2019, 42, 1828–1831. [CrossRef] [PubMed]

19. Krysy Rapp, JP Dahl citlivé na sůl a odolné vůči soli. Hypertenze 1982, 4, 753–763. [CrossRef]

20. Dahl, LK; Knudsen, KD; Heine, MA; Leitl, GJ Účinky chronického nadměrného příjmu soli. Modifikace experimentální hypertenze u potkanů ​​změnami stravy. Circ. Res. 1968, 22, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

21. Rapp, JP; Dene, H. Vývoj a charakteristiky inbredních kmenů Dahlových krys citlivých na sůl a odolných vůči soli. Hypertens 1985,7, 340–349. [CrossRef]

22. Brower, M.; Grace, M.; Kotz, CM; Koya, V. Srovnávací analýza růstových charakteristik potkanů ​​Sprague Dawley získaných z různých zdrojů. Laboratoř. Anim Res. 2015, 31, 166–173. [CrossRef]

23. Talbot, SR; Biernat, S.; Bleich, A.; van Dijk, RM; Ernst, L.; Häger, C.; Hilgers, SOA; Koegel, B.; Koska, I.; Kuhla, A.; et al. Definování redukce tělesné hmotnosti jako humánního koncového bodu: kritické hodnocení. Laboratoř. Anim 2020, 54, 99–110. [CrossRef] [PubMed]

24. Geschka, S.; Kretschmer, A.; Sharkovská, Y.; Evgenov, OV; Lawrenz, B.; Hucke, A.; Hocher, B.; Stasch, J.-P. Rozpustná stimulace guanylatecyklázy zabraňuje remodelaci fibrotické tkáně a zlepšuje přežití u potkanů ​​Dahl citlivých na sůl. PLoS ONE 2011, 6,e21853. [CrossRef] [PubMed]

25. Wang, Y.; Mu, JJ; Liu, FQ; Ren, KY; Xiao, HY; Yang, Z.; Yuan, ZY Salt-indukovaný epiteliální-mezenchymální přechod u Dahlsalt-senzitivních potkanů ​​je závislý na zvýšeném krevním tlaku. Braz. J. Med. Biol. Res. Rev. Bras. Pesquisa Med. E Biol. 2014, 47, 223–230.[CrossRef]

26. Holmes, SW; Sugden, D. Sborník: Účinek melatoninu na hypertenzi vyvolanou pinealektomií u potkanů. Br. J. Pharm.1976, 56, 360P–361P.

27. Zanoboni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W. Experimentální hypertenze u pinealektomizovaných potkanů. Life Sci. 1967, 6, 2327–2331. [CrossRef]

28. Zanoboni, A.; Forni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W.; Zanussi, C. Vliv pinealektomie na arteriální krevní tlak a příjem potravy a vody u potkanů. J. Endocrinol. Vyšetřování. 1978, 1, 125–130. [CrossRef] [PubMed]

29. Pechánová, O.; Zicha, J.; Paulis, L.; Zenebe, W.; Dobesová, Z.; Kojsová, S.; Jendeková, L.; Sládková, M.; Dovinová, I.; Šimko, F.; et al. Účinek N-acetylcysteinu a melatoninu u dospělých spontánně hypertenzních potkanů ​​s prokázanou hypertenzí. Eur. J.Pharmcol. 2007, 561, 129–136. [CrossRef] [PubMed]

30. Leibowitz, A.; Peleg, E.; Sharabi, Y.; Shabtai, Z.; Shamiss, A.; Grossman, E. Role ofmelatoninv patogenezi hypertenze u potkanů ​​s metabolickým syndromem. Dopoledne. J. Hypertens 2008, 21. [CrossRef] [PubMed]

31. De Miguel, C.; Das, S.; Lund, H.; Mattson, DL T lymfocyty zprostředkovávají hypertenzi aledvinapoškození u Dahlových potkanů ​​citlivých na sůl. Dopoledne. J. Physiol. Regul. Celé číslo. Comp. Physiol. 2010, 298, R1136–R1142. [CrossRef] [PubMed]

32. Evans, LC; Petrová, G.; Kurth, T.; Yang, C.; Bukowy, JD; Mattson, DL; Cowley, AW Pohon zvýšeného perfuzního tlaku Infiltrace T-buněk u Dahlových krys citlivých na sůl. Hypertenze 2017, 70, 543–551. [CrossRef]

33. Abais-Battad, JM; Alsheikh, AJ; Pan, X.; Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Roberts, ML; Kriegel, AJ; Cowley, AWJ; Kidambi, S.; a kol. Dietary Effects on Dahl salt-sensitive Hypertension, Renal Damage, and the T Lymphocyte Transscriptome.Hypertens 2019, 74, 854–863. [CrossRef] [PubMed]

34. Fehrenbach, DJ; Dasinger, JH; Lund, H.; Zmaj, J.; Mattson, DL Přenos splenocytů zhoršuje u potkanů ​​hypertenze citlivých na sůl. Exp. Physiol. 2020, 105, 864–875. [CrossRef] [PubMed]

35. Ren, W.; Liu, G.; Chen, S.; Yin, J.; Wang, J.; Tan, B.; Wu, G.; Bazer, FW; Peng, Y.; Li, T.; a kol. Melatoninová signalizace v T buňkách: Funkce a aplikace. J. Pineal Res. 2017, 62. [CrossRef]

36. Álvarez-Sánchez, N.; Cruz-Chamorro, I.; López-González, A.; Utrilla, JC; Fernández-Santos, JM; Martínez-López, A.; Lardone, PJ; Guerrero, JM; Carrillo-Vico, A. Melatonin kontroluje experimentální autoimunitní encefalomyelitidu změnou T efektorové/regulační rovnováhy. Chování mozku. Immun. 2015, 50, 101–114. [CrossRef]

37. Chen, S.-J.; Huang, S.-H.; Chen, J.-W.; Wang, K.-C.; Yang, Y.-R.; Liu, P.-F.; Lin, G.-J.; Sytwu, H.-K.melatoninzvyšuje expresi interleukinu 10 a potlačuje chemotaxi pro inhibici zánětu in situ a snižuje závažnost experimentální autoimunitní encefalomyelitidy. Int. Immunopharmacol. 2016, 31, 169–177. [CrossRef] [PubMed]

38. Griffith, JW; Sokol, CL; Luster, ADChemokinya chemokinové receptory: polohovací buňky pro obranu a imunitu hostitele.Annu. Rev. Immunol. 2014, 32, 659–702. [CrossRef] [PubMed]

39. Alsheikh, AJ; Dasinger, JH; Abais-Battad, JM; Fehrenbach, DJ; Yang, C.; Cowley, AWJ; Mattson, DL CCL2 zprostředkovává časnou renální infiltraci leukocytů během hypertenze citlivé na sůl. Dopoledne. J. Physiol. Ren. Physiol. 2020, 318, F982–F993. [CrossRef][PubMed]

40. Liu, L.; Callahan, MK; Huang, D.; Ransohoff, RM Chemokinový receptor CXCR3: Neočekávaná záhada. Curr. Horní. Dev. Biol. 2005, 68, 149–181. [CrossRef] [PubMed]

41. Groom, JR; Luster, AD CXCR3 ligandy: redundantní, kolaborativní a antagonistické funkce. Immunol. Cell Biol. 2011, 89,207–215. [CrossRef] [PubMed]

42. Van Raemdonck, K.; Van den Steen, PE; Liekens, S.; Van Damme, J.; Struyf, S. CXCR3 ligandy v onemocnění a terapii. CytokineGrowth Factor Rev. 2015, 26, 311–327. [CrossRef] [PubMed]

43. Youn, J.-C.; Yu, HT; Lim, BJ; Koh, MJ; Lee, J.; Chang, D.-Y.; Choi, YS; Lee, S.-H.; Kang, S.-M.; Jang, Y.; a kol. Imunosenescentní CD8 plus T buňky a CXC chemokinový receptor typu 3chemokinyjsou zvýšené u lidské hypertenze. Hypertens 2013, 62, 126–133.[CrossRef] [PubMed]

44. Stumpf, C.; Auer, C.; Yilmaz, A.; Lewczuk, P.; Klinghammer, L.; Schneider, M.; Daniel, WG; Schmieder, RE; Garlichs, CDSérové ​​hladiny Th1 chemoatraktantu interferonem-gama-indukovatelného proteinu (IP) 10 jsou zvýšené u pacientů s esenciální hypertenzí. Hypertens Res. 2011, 34, 484–488. [CrossRef] [PubMed]

45. Rudemiller, NP; Lund, H.; Priestley, JRC; Endres, BT; Prokop, JW; Jacob, HJ; Geurts, AM; Cohen, EP; Mattson, DL mutace SH2B3 (LNK), kandidát na celogenomovou asociační studii pro hypertenzi, zmírňuje hypertenzi citlivou na Dahlovu sůl prostřednictvím zánětlivé modulace. Hypertens 2015, 65, 1111–1117. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Wade, B.; Petrová, G.; Mattson, DL Role imunitních faktorů u angiotensinem II-indukované hypertenze a poškození ledvin u Dahlsalt-senzitivních potkanů. Dopoledne. J. Physiol. Regul. Celé číslo. Comp. Physiol. 2018, 314, R323–R333. [CrossRef] [PubMed]