Abstraktní:Fytochemické zkoumání semen egyptské mandarinky (Citrus reticulata Blanco, F. Rutaceae) poskytlo třináct známých sloučenin, 1–13. Struktury izolovaných sloučenin byly přiřazeny pomocí 1D a 2D NMR a HRESIMS analýz. K charakterizaci farmakologické aktivity těchto sloučenin bylo použito několik integrovaných experimentů založených na virtuálním screeningu a na simulaci molekulární dynamiky. V důsledku toho byly sloučeniny 2, 3 a 5 domněle identifikovány jako inhibitory hyaluronidázy, xanthinoxidázy a tyrosinázy. Následné testování in vitro bylo provedeno za účelem ověření experimentů na bázi in silico s cílem zdůraznit potenciál těchto flavonoidů jako slibných inhibitorů hyaluronidázy, xanthinoxidázy a tyrosinázy s hodnotami IC50 v rozmezí od 6,39 ± 0,36 do 73,7 ± 2,33 µM . Tato studie vrhla světlo na potenciál odpadního produktu egyptské mandarinky (tj. jejích semen) jako přírodního prostředku podporujícího zdraví pokožky. Navíc odhalila použitelnost integrovaného virtuálního screeningu založeného na inverzním dokování a experimentů založených na MDS při účinném předpovídání biologického potenciálu přírodních produktů.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a má schopnost vychytávat reaktivní formy kyslíku a bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na Výhody tablet Cistanche

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

1. Úvod

Mandarinky, C. reticulata, jsou jedny z nejpozoruhodnějších citrusových plodin pro čerstvé využití [1]. Často jsou uváděny jako 'mandarinky;' nicméně, 'Mandarin' je populárnější jméno. V přírodě je rozšířeno několik hybridů a odrůd mandarinek [1]. Nejznámějšími, sofistikovanými druhy jsou C. unshiu Marcovitch, C. nobilis Loureiro, C. deliciosa Tenore a C. reticulata Blanco [1,2]. Mandarinky patří mezi hlavní citrusové plody sklízené v mnoha zemích. Přestože se tyto plodiny používají hlavně jako dezert, mají značný komerční význam díky svým esenciálním olejům [3]. Citrusové příchutě se používají v nápojích, cukrovinkách, sušenkách a dezertech [4]. K ochucení likéru se také používá kůra C. reticulata [4].

Inverzní dokování je typ virtuální screeningové metody, kterou lze manipulovat tak, aby se předvídaly potenciální molekulární cíle pro danou strukturu sloučeniny. Dříve jsme tuto účinnou virtuální screeningovou metodu používali k určení nejlepších proteinových cílů pro několik izolovaných přírodních produktů [5]. Skóre dokování, které vyplynulo z tohoto předběžného screeningového kroku, však poskytuje pouze určité informace o strukturální komplementaritě mezi cílovými proteiny a strukturou dotazované sloučeniny [6]. V souladu s tím poskytují experimenty molekulární dynamiky (MDS) včetně absolutní volné vazebné energie (∆Gbinding) přesnější a důvěryhodnější výsledky, které lze vybrat pro testování in vitro. Zde jsme podrobili semena C. reticulata postupné chromatografické izolaci, abychom získali určitou představu o hlavní fytochemikálii v tomto odpadním produktu. Následně jsme zkoumali, zda tyto fytochemikálie mají určité farmakologické účinky tím, že jsme je podrobili postupné analýze na bázi in silico, která byla zahájena komplexním inverzním dokováním a ukončena několika experimenty MDS. Potenciál bioaktivních fytochemikálií pocházejících ze semen C. reticulata vrhá světlo na vysokou kapacitu odpadních produktů jedlého ovoce jako obrovského rezervoáru pro zdraví prospěšné látky.

2. Materiály a metody

2.1. Přírodní materiál

Plody C. reticulata byly shromážděny v lednu 2021 z místní oblasti v Beni-Suef v Egyptě a ověřeny starším botanikem, prof. Dr. Výzkumný ústav zahradnický; dokki; Káhira; Egypt). Exemplář plodů byl uchováván pod číslem voucheru 2021-BuPD 80 v oddělení farmakognosie; Farmaceutická škola; Univerzita Beni-Suef; Egypt).

2.2. Chemikálie a činidla

Ethylacetát (EtOAc), methanol (MeOH), n-hexan (n-Hex), ethanol (EtOH), dichlormethan (DCM) a n-butanol (n-BuOH) byly získány od El-Nasr Company, Egypt. Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, USA, poskytla deuterovaná rozpouštědla pro NMR analýzu a také vysoce čistá rozpouštědla pro HPLC, spektroskopické a chromatografické analýzy (např. methanol-d4 (CD3OD), dimethylsulfoxid-d6 (DMSO), chloroform -d (CDCI3), methanol pro HPLC, voda čistoty pro HPLC a acetonitril čistoty pro HPLC). Pro chromatografickou izolaci Sephadex LH20 (0,25–0,1 mm, GE Healthcare, Sigma-Aldrich; CA, USA) a silikagel (E-Merck, Sigma-Aldrich, CA, USA) byly použity. Pro vakuovou kapalinovou chromatografii byl použit silikagel pro TLC (Pharmaceuticals and Chemicals; El-Nasr Company; Cairo, Egypt) (VLC). Pro studie TLC byl použit předem potažený silikagel (E-Merck, Darmstadt, Německo). Vzniklé skvrny byly identifikovány para anisaldehydem po zahřátí na 110 ◦C [7]. Všechny materiály pro biologické výzkumy pocházely od Sigma Chemical Company (SCC; CA, USA).

2.3. Spektrální analýzy

NMR signály byly získány při 400 °C pro 1H-NMR a 100 MHz pro 13C-NMR. Jako referenční signály byly použity píky rozpouštědel CDCI3-d, CD3OD-d4 a DMSO-d6. NMR signál byl získán pomocí NMR přístroje Bruker Advance-III 400 MHz (Bruker AG-Billerica, Kalifornie, MA, USA).

Hmotnostní data s vysokým rozlišením byla shromážděna pomocí Acquity-Ultra-Performance-Liquid Chromatography-machine spojeného s Quadrupole-Time-of-Flight-Hybrid-Mass-Spectrometer (Waters, Milford, MA, USA). K dosažení HPLC chromatografických separací byla použita Agilent/1260-Infinity-preparative-HPLC.

2.4. Příprava extraktu ze semen C. reticulata

Semena C. reticulata (1 kilogram) byla zakoupena čerstvá a poté sušena na vzduchu ve stínu. Poté byla semena nastrouhána pomocí mlýnku (Henan, pevninská Čína). Práškový produkt byl poté důkladně extrahován 70procentním EtOH (1 1 x 5). Výsledný kapalný extrakt byl zakoncentrován pomocí rotační odparky (Buchi-Rotavapor-R-300, ColeParmer, Vernon Hills, IL, USA) ve vakuu při 45 ◦C za vzniku 100 g surového suchého extraktu, který byl poté rozdělen za použití řady rozpouštědel se zvyšující se polaritou: n-Hex-DCMEtOAc-n-BuOH. Frakce I (24{21}} g), II (5,0 g), III (3,0 g) a IV (6,0 g) byly získány odpařením oddělené organické fáze za sníženého tlaku. Všechny extrakty a frakce byly skladovány při 4 ◦C pro následnou fytochemickou a biochemickou analýzu.

2.5. Izolace hlavních přírodních produktů semen C. reticulata 

TLC-silikagelová kolona byla použita k vystavení frakce I (20 g) normální VLC. Byla použita postupná eluce EtOAc a n-Hex (0–100 procent, 5 procent rostoucí). Tři subfrakce (I1–I3) byly získány shromážděním identických frakcí a jejich odpařením za sníženého tlaku. Na další koloně silikagelu byla podfrakce 11 (1,0 g) rozsáhle frakcionována. Chromatografická eluce byla prováděna pomocí n-Hex až EtOAc, gradientové směsi (0–10 procent, 1 procento rostoucí, 100 ml každé) za poskytnutí sloučeniny 13 (10 mg).

Subfrakce I2 (50 mg) byla dále chromatografována na silikagelu-60 (100 x 1 cm, 20 g). Chromatografický postup byl proveden s použitím DCM:MeOH, isokratická směs (0,5 procenta, 500 ml), čímž byly získány sloučeniny 8 (20 mg) a 9 (15 mg). Subfrakce I3 byla poněkud frakcionována na silikagelu 60 (100 x 1 cm, 20 g). Eluce produkovala za použití DCM:MeOH, izokratická směs (0,5 procenta, 500 ml) za získání 10 (20 mg).

K expozici frakce II (2,5 g) byla použita TLC kolona silikagelu. DCM: K eluci vzorků byl použit EtOAc (0–100 procent, nárůst o 5 procent). Produkované odpadní vody byly přijímány v 250 ml částech. Byly získány identické frakce a redukovány na dvě podfrakce (II1–II2) za sníženého tlaku. Na další koloně silikagelu byla podfrakce 11 (1,0 g) rozsáhle frakcionována. Sloučenina 5 byla eluována pomocí DCM: EtOAc (0-10 procent, 1 procento rostoucí, 100 ml každý) (10 mg).

Subfrakce I2 (50 mg) byla dále chromatografována na silikagelu 60 (100 x 1 cm, 20 g). Byla aplikována chromatografická eluce s použitím DCM k MeOH (izokratická eluce; 0,5 procenta, 500 ml) za poskytnutí sloučenin 11 (20 mg) a 12 (15 mg).

Na normální VLC byla frakce IV (6{1}} g) oddělena pomocí silikagelu. DCM: EtOAc (0-100 procent, 5 procent rostoucí, 250 ml každý) byl použit k eluci vzorků. Chromatografické efluenty byly přijímány po 250 ml přírůstcích.

Identické frakce byly seskupeny a redukovány za sníženého tlaku za získání pěti podfrakcí (IV1–V5); podfrakce IV1, IV2, IV3 a IV4 byly pouze mírně chromatografovány na koloně Sephadex-LH20 eluované MeOH za získání 4 (30 mg), 6 (50 mg), 7 (70 mg) a 1 (15 mg, v tomto pořadí, zatímco subfrakce IV5 byla významně pur (10 mg).

2.6. In Silico Study

2.6.1. Inverzní dokování

Pravděpodobné molekulární cíle pro separované flavonoidy byly uzavřeny podrobením jejich struktur virtuálnímu screeningu v závislosti na inverzním dokování proti téměř všem proteinům rozdávaným v Protein-Data-Bank; PNR.

K tomuto kroku byla použita online platforma IdTarget. Tento program pro screening mizerné virtuální struktury využívá zvláštní metodu inverzního dokování, jmenovitě DivideConquer-Docking, která vytváří omezené překrývající se sítě, díky čemuž je zkoumání proteinu více omezeno. Díky tomu může provést velké množství dokování v krátkém čase [8]. Výsledné skóre bylo popsáno jako seznam hodnocení od nejhoršího po nejlepší. K identifikaci optimálních proteinových cílů pro každou danou strukturu jsme použili skóre afinity −10 kcal/mol jako mezní hodnotu (tabulka 1).

Experimenty se simulací molekulární dynamiky (MDS) byly provedeny, jak již dříve uvedli Alhadrami et al. 2021 [6]. Pro provozování MDS experimentů byl použit MDS stroj softwaru Maestro (tj. Desmond v. 2.2; Hamburg, Německo) [9–11]. Pro simulační běhy bylo použito OPLS-Force-Field.

Příprava proteinových struktur byla provedena pomocí algoritmu System-Builder, ve kterém byly zabaleny do ortorombické vodní krabice (20 Å3 ) pomocí vodního modelu TIP3P společně s ionty Na plus a Cl−, {{ 16}}.15 M pro každý z nich. Poté byly optimalizované modelované struktury podrobeny předběžné ekvilibraci po dobu 10 ns. Ligandové struktury byly automaticky parametrizovány během kroku přípravy struktury podle OPLSForce-Field. Proteiny obsahující kov, jako jsou MMP, které zahrnují komplex histidin-Zn plus 2 v účinném místě, by měly být parametrizovány během kroku tvorby proteinu. Abychom pokračovali, měl by být nastaven hetero stav pro heteroatomy jako Zn (Generate Hetero States). Tato funkce je součástí maestrova průvodce tvorbou bílkovin. Tento krok usnadní vývoj správného hetero stavu nebo koordinovaného kovalentního stavu pro heteroatom (tj. Zn plus 2) v síti s proteinem, takže silová pole jako OPLS mohou rychle pozorovat atom zinku. Pro reprodukce provedené softwarem Nano-scale Molecular Dynamics (NAMD 3.0) [12] byly topologie a parametry modelovaných struktur určeny online platformou Ligand Reader and Modeler. Harmonické síly Tcl byly použity k udržení Zn plus 2 na místě.

Výpočet volné vazebné energie (∆Gbinding) byl proveden tak, jak bylo dříve popsáno Alhadrami et al. 2021 [6]. ∆Mletí bylo provedeno pomocí procedury perturbace volné energie (FEP) [12], která je podrobně popsána v publikaci Kim et al. Stručně řečeno, tato technika vypočítá požadovanou dostupnou energii ∆Gvazba pomocí rovnice ∆Gvazba=∆GKomplex − ∆GLigand. Hodnota každého ∆broušení se vypočítá pomocí programu NAMD v samostatných experimentech.

Všechny vstupní soubory lze připravit prostřednictvím webové stránky CharmmGUI. Soubory byly poté použity k vytvoření plánovaných výpočtů ∆Gbinding s využitím protokolu FEP v NAMD. Rovnováha byla později nastavena v NPT (300 K, 1 atm, Langevin-Piston-Pressure "Complex" - "Ligand") v existenci vodního modelu TIP3P. Později byly pro každou konstrukci vytvořeny 10 ns FEP simulace a posledních 5 ns dostupných množství energie bylo vypočteno pro hotové míry volné energie [12]. Nakonec byly vazebné pozice předvídány a vyhodnoceny pomocí programu VMD [13].

2.7. In vitro test aktivity hyaluronidázy

Aktivita inhibice hyaluronidázy byla vytvořena podle dříve zavedeného postupu uděleného Chaiyana et al. 2019 [14]. Inhibiční účinek na aktivitu hyaluronidázy byl odhadnut z následující rovnice: inhibice hyaluronidázy ( procenta )=(1 − A/B) × 100, kde A a B jsou charakter kyseliny hyaluronové po léčbě v přítomnosti nebo nedostatku vzorek, samostatně. Jako pozitivní kontrola byla použita 6-kyselina O-palmitoyl-lasskorbová. Experiment byl proveden trojmo.

2.8. In vitro test aktivity xanthinové oxidázy

Potenciál inhibice xanthinoxidázy (XO) byl stanoven podle dříve popsané metody [15]. Barva vytvořená v důsledku uvolňování peroxidu vodíku během procesu oxidace XO byla měřena při 570 nm pomocí čtečky destiček EPOCH™ "MICROPLATE READER (BIOTEK)". 44 mikrolitrů xanthinoxidázového pufru bylo smícháno s 2 ul roztoku xanthinového substrátu a 2 ul XO. L-mimosin byl aplikován jako pozitivní kontrola. Tento experiment byl proveden v triplikátech.

2.9. In vitro test aktivity tyrosinázy

Aktivita inhibice tyrosinázy každého flavonoidu byla pozorována za použití procesu DOPAchrome podle schématu Momtaz et al. 2008 [16], který byl upraven z Nerya et al. 2003 [17] a Curto et al. 1999 [18]. Inhibiční aktivita tyrosinázy byla měřena z následující rovnice: inhibiční aktivita ( procenta )=(1 − A/B) × 100, (9) kde A a B jsou absorbance směsi v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaný flavonoid, resp. Každý experiment byl proveden trojmo.

3. Výsledky a diskuse

3.1. Fytochemický výzkum semen C. reticulata

Pomocí UV, 1H a DEPT-Q NMR, kromě srovnání s literaturou a použitím některých autentických vzorků, byly známé sloučeniny kaempferol 1 [19], kaempferol-40 -O- -Dglukopyranosid 2 [19], kaempferol -7-O- -D-glukopyranosid 3 [19], 2-hydroxygenistein 4 [19], hesperetin 5 [19], 3000 (1000-O- - D-glukopyranosyl)-sacharóza 6 [20], 6(1000 -O- -Dfruktofuranosy)-30 (1"-O- -D-glukopyranosyl)-sacharóza 7 [20 [ 21], (E)-3-((4-methylheptyloxy)karbonyl)akrylová kyselina 11 [23], (E)-3-((6-methylnonyloxy) kyselina karbonyl)akrylová 12 [23] a -sitosterol 13 [24] (obrázek 1) byly identifikovány ze surového ethanolového extraktu semen C. reticulata. Všechny identifikované sloučeniny 11 a 12 byly zde poprvé odděleny od rodu Citrus ( Obrázky 1 a S1–S28) Stojí za zmínku, že na rozdíl od široce rozšířených flavanonů a flavonů v nadzemních částech C. reticulata, včetně plodů, se flavonoly jevily jako převládající typ flavonoidů v semenech.

3.2. In Silico Investigation

Abychom charakterizovali biologickou aktivitu izolovaných sloučenin, podrobili jsme je sérii in-silico analýz. Nejprve jsme se zaměřili na izolované flavonoidy (1–5) pro náš počáteční krok virtuálního screeningu, protože flavonoidy jsou dobře známé bioaktivní rostlinné sekundární metabolity. Zbývající izolované sloučeniny (6–13) jsou navíc běžné primární metabolity, které pravděpodobně nemají žádnou terapeutickou účinnost.

Struktury flavonoidů 1–5 byly podrobeny virtuálnímu screeningu založenému na dokování proti téměř všem proteinům hostovaným v PDB. Pro tento předběžný úkol virtuálního screeningu byla použita online platforma, konkrétně idTarget [8]. Získaná skóre byla získána jako seznam od největší záporné hodnoty po nejmenší. Nastavili jsme průkazné skóre afinity −10 kcal/mol jako hraniční hodnotu, abychom vybrali dobré cíle pro každý izolovaný flavonoid (1–5). Bylo zjištěno, že několik zajímavých molekulárních cílů je pravděpodobně dobrými cíli pro tyto příbuzné sloučeniny, včetně proteinkináz a syntáz (tabulka 1).

Zajímavé je, že mezi těmito flavonoidy, hyaluronidázou, xantinoxidázou a tyrosinázou byly hlášeny tři společné molekulární cíle. Tyto enzymy souvisejí s udržováním zdravé kůže [25–30], a proto krok předběžného virtuálního screeningu domněle identifikoval tyto flavonoidy jako pravděpodobné látky podporující péči o pleť.

3.3. Simulace molekulární dynamiky a výpočet volné energie absolutní vazby

Abychom dále podpořili krok předběžného screeningu založeného na dokování, odhadli jsme absolutní volné vazebné energie (∆Gbinding) sloučenin 1–5 s enzymy hyaluronidázou, xantinoxidázou a tyrosinázou pomocí metody závislé na MDS, konkrétně metody perturbace volné energie ( RVP) [26,31].

Jak je uvedeno v tabulce 2, pouze sloučeniny 2, 3 a 5 byly schopny dosáhnout nejvyšší afinity k hyaluronidáze, xanthinoxidáze a enzymům tyrosinázy s hodnotami ∆broušení v rozmezí od -8,1 do -9,9 kcal/mol. Zbývající sloučeniny měly hodnoty ∆Gbinding vyšší než -6 kcal/mol.

Další 50 ns MDS experimenty byly provedeny za účelem zkoumání interakcí a vazebné stability sloučenin 2, 3 a 5 s enzymy hyaluronidázou, xanthinoxidázou a tyrosinázou. Jak je znázorněno na obrázku 2, jak sloučenina 3, tak ko-krystalizovaný ligand dosáhly podobné vazebné stability uvnitř vazebného místa enzymu během MDS s RMSD ~2,8 Á z počátečních pozic dokování. Sloučenina 2 0 s RMSD byla také jako u sloučeniny 3 až do 28,7 ns, kdy se začala odchylovat mírně výše od sloučeniny 3 a ko-krystalizovaného ligandu, aby bylo dosaženo průměrné RMSD 3,8 Á v celém MDS. Poslední snímek odvozený z MDS sloučenin 2 a 3 a kokrystalizovaného ligandu ukázal, že TYR-75, ASP-129 a GLU-131 byly běžné interagující aminokyselinové zbytky prostřednictvím H- lepení.

Pokud jde o xanthinoxidázu, sloučenina 3 dosáhla stabilní vazby uvnitř svého aktivního místa během MDS, přičemž zaznamenala průměrnou RMSD 2,6 Á, která byla konvergentní k RMSD -2,4 Á. Taková stabilní vazba sloučeniny 3 byla zjevně způsobena sítí H-vazeb, kterou vytvořila s LYS-771, PHE-798, GLU-802, SER-876, ARG{{ 12}}, PHE-911, ARG-912 a THR-1010 (obrázek 3).

Konečně, sloučenina 5 byla také stabilní uvnitř aktivního místa tyrosinázy během 50 ns MDS s průměrnou hodnotou RMSD 4,9 Á, která byla vyšší než u ko-krystalizovaného inhibitoru (RMSD -3,8 Á). Jak je ukázáno na posledním snímku odvozeném z MDS, sloučenina 5 byla schopna interagovat se dvěma Zn2 plus ionty podobně jako ko-krystalizovaný inhibitor. Kromě toho byl stabilizován několika H-vazbami s LYS-198, GLY-209, TYR-362, ARG-374 a THR-391 (obrázek 4 ).

【Další informace: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】