Peroxidace lysozomálních lipidů reguluje nádorovou imunitu
Sep 19, 2023
Lysozomální inhibice vyvolaná inhibitory palmitoyl-protein thioesterázy 1 (PPT1), jako je DC661, může způsobit buněčnou smrt, ale mechanismus toho není zcela objasněn. K dosažení cytotoxického účinku DC661 nebyly nutné cesty programované buněčné smrti (autofagie, apoptóza, nekroptóza, ferroptóza a pyroptóza). Inhibice katepsinů nebo chelace železa nebo vápníku nezachránily cytotoxicitu indukovanou DC661-. Inhibice PPT1 indukovala peroxidaci lysozomálních lipidů (LLP), která vedla k permeabilizaci lysozomální membrány a buněčné smrti, kterou bylo možné zvrátit antioxidantem N-acetylcysteinem (NAC), ale ne jinými antioxidanty peroxidace lipidů. Lysozomální cysteinový transportér MFSD12 byl vyžadován pro intralysozomální transport NAC a záchranu LLP. Inhibice PPT1 vyvolala imunogenicitu vlastní buňky s povrchovou expresí kalretikulinu, kterou bylo možné zvrátit pouze pomocí NAC. Buňky ošetřené DC661-primovaly naivní T buňky a zvýšily toxicitu zprostředkovanou T buňkami. Myši očkované buňkami ošetřenými DC661-vytvářely adaptivní imunitu a odmítnutí nádoru u „imunitně horkých“ nádorů, ale ne u „imunitně studených“ nádorů. Tato zjištění ukazují, že LLP řídí lysozomální buněčnou smrt, jedinečnou imunogenní formu buněčné smrti, což ukazuje cestu k racionálním kombinacím imunoterapie a lysozomální inhibice, které lze testovat v klinických studiích.
Výhody cistanche tubulosa-Antitumor
Úvod
S povzbudivou aktivitou v klinických studiích, které zahrnují lysozomální inhibitor hydroxychlorochin (HCQ) (1), identifikaci palmitoyl-proteinthioesterázy 1 (PPT1) jako molekulárního cíle derivátů chlorochinu (2) a uvedení nových inhibitorů PPT1 do klinické praxe studií (3, 4), je potřeba pochopit mechanismus, kterým lysozomální inhibitory indukují buněčnou smrt a účinek lysozomální inhibice na nádorovou imunitu. Kanonický mechanismus smrti lysozomálních buněk popsaný pro HCQ zahrnuje permeabilizaci lysozomální membrány (LMP), únik katepsinů a aktivaci apoptózy zprostředkované kaspázou (5, 6). Již dříve jsme ukázali, že lysozomální inhibitor DC661 proniká do buněk v kyselém nádorovém mikroprostředí a lokalizuje se do lysozomu účinněji než HCQ (2, 7). DC661 způsobuje silnou buněčnou smrt napříč mnoha rakovinnými buněčnými liniemi (2). DC661 se váže a inhibuje PPT1, odkyseluje lysozom a inhibuje autofagii. DC661 také indukuje LMP a zvyšuje hladiny štěpené kaspázy 3 (2, 7). V posledních letech byly definovány nové mechanismy buněčné smrti, které mají imunogenní důsledky a zahrnují nekroptózu, ferroptózu a pyroptózu (8). Bylo ukázáno, že autofagie závislá na lysozomech degraduje MHC třídy I (9), stejně jako složky imunoproteazomu (10), což naznačuje, že inhibice autofagie může zlepšit zpracování antigenu. Avšak imunogenní účinky lysozomální inhibice a následné buněčné smrti nebyly plně charakterizovány. Abychom vyřešili tuto mezeru ve znalostech, zkoumali jsme účinky DC661 na kanonické mechanismy buněčné smrti, abychom určili, zda je smrt lysozomálních buněk její formou buněčné smrti nebo jednoduše prekurzorem jednoho z dalších zavedených mechanismů. Zjistili jsme, že HCQ a DC661 vyvolaly významné zvýšení pouze malého počtu proteinů v proteomu melanomu a většina z nich byly proteiny související s autofagií a apoptózou. Inhibitory programované buněčné smrti (apoptóza, nekroptóza, ferroptóza a pyroptóza) nezmírnily cytotoxické účinky po poškození lysozomů pomocí DC661. Lysozomální lipidová peroxidace (LLP) je hlavní hnací silou buněčné smrti indukované LMP spojené s expresí kalretikulinu (CALR) na buněčném povrchu. Tuto formu buněčné smrti lze zvrátit pouze použitím antioxidantu N-acetylcysteinu (NAC). Aktivita NAC byla narušena inhibicí importéru lysozomálního cysteinu MFSD12. LLP vyvolal imunogenní fenotypy podporující zabíjení zprostředkované T buňkami. Tato zjištění ukazují, že smrt lysozomálních buněk je potenciálně unikátní formou imunogenní buněčné smrti.
rostlina cistanche zvyšující imunitní systém
Výsledek
Lysozomální inhibice indukuje významné změny v proteomu spojené s autofagií a apoptózou. Abychom stanovili cytotoxické účinky lysozomálních inhibitorů, hodnotili jsme životaschopnost buněčných linií A375P melanomu, RKO karcinomu tlustého střeva a MIA PaCa-2 pankreatického karcinomu léčených vakuolárním inhibitorem H+-ATPázy bafilomycinem-A1 (1 00 nM); inhibitory PPT1 DC661 (3 uM) nebo HCQ (10 uM nebo 30 uM); palmitátový mimetický hexadecylsulfonylfluorid (HDSF; 60 uM); inhibitory katepsinu pepstatin A (PepA; 10 ug/ml), E64 (PepA; 10 ug/ml) nebo PepA+E64; a hydrobromid methylesteru Leu-Leu narušujícího lysozomální membránu (20 uM) po dobu 48 hodin. Pouze bafilomycin-A1 a DC661 způsobily významný pokles životaschopnosti buněk napříč rakovinnými buněčnými liniemi (obrázek 1A a doplňkový obrázek 1A; doplňkový materiál dostupný online v tomto článku; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), přičemž DC661 produkoval výraznější snížení životaschopnosti buněk než u bafilomycinu-A1. Na základě těchto údajů a farmakologických vlastností derivátů chlorochinu podobným lékům jsme zaměřili naši studii na deriváty chlorochinu jako nástroje k pochopení smrti lysozomálních buněk. Nestranná globální proteomová analýza byla aplikována na buňky melanomu A375P ošetřené DC661 (3 μM) nebo méně účinným HCQ (10 μM nebo 30 μM) po dobu 24 hodin. Ze 4 264 vysoce spolehlivých kvantifikovaných proteinů bylo pouze 87 a 55 proteinů významně zvýšeno s DC661 (3 μM) a HCQ (30 μM), v tomto pořadí; navíc bylo 14 a 15 proteinů významně sníženo s DC661 (3 μM) a HCQ (30 μM), v tomto pořadí (absolutní násobná změna větší než 2; q < 0,05) s DC661 (3 μM) nebo HCQ (30 μM), v tomto pořadí ve srovnání s ovládáním vozidla. Nižší dávka HCQ (10 μM) nevykazovala žádné významné změny proteinu ve srovnání s kontrolou s vehikulem. Top 50 proteinů, které byly významně zvýšeny po léčbě DC661, bylo spojeno hlavně s autofagií a apoptózou a podobné změny byly pozorovány u vyšší dávky HCQ (obrázek 1B). Z těchto důvodů jsme se rozhodli zaměřit další studie na silnější DC661. Příklady některých největších změn proteinů spojených s autofagií a apoptózou byly protein 1 vázající tax1- (TAX1BP1; zvýšený 15-násobně); BCL2-interagující protein 3 (BNIP3; zvýšený 6-násobně); soused proteinu genu 1 BRCA1 (NBR1; zvýšené 12-násobně); sekvestozom-1 (SQSTM1/p62; zvýšené 5-násobně); koaktivátor jaderného receptoru 4 (NCOA4; zvýšené 3-násobně); a LC3B (MAP1LC3B; zvýšený 3-krát). Apolipoprotein B-100 (APOB; zvýšený 66-násobně) byl odvozen z fetálního telecího séra a nebyl dále studován. Imunoblotting potvrdil, že léčba DC661 nebo vyššími koncentracemi HCQ vyvolala výrazné zvýšení exprese autofagických cargo receptorů NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 a NCOA4 způsobem závislým na dávce a čase (doplňkový obrázek 1, B a C). CRISPR/Cas9 KO z PPT1 v buňkách A375P fenokopíroval účinky DC661 na tyto proteiny ve srovnání s jejich protějšky WT (doplňkový obrázek 1D). Exprese autofagických cargo receptorů a relativní zvýšení indukované léčbou DC661 však byly variabilní u rakoviny tlustého střeva, rakoviny slinivky břišní a dalších buněčných linií melanomu, ve kterých DC661 vykazuje cytotoxicitu (doplňkový obrázek 1E). To naznačuje, že samotné autofagické cargo receptory, i když jsou zvýšené na proteinové úrovni, pravděpodobně nebudou zodpovědné za buněčnou smrt po léčbě DC661. Abychom to potvrdili, zaměřili jsme se na autofagické cargo receptory TAX1BP1 a BNIP3, protože mají známé proapoptotické účinky v rakovinných buňkách (obrázek 1C). TAX1BP1 je autofagický cargo adaptér (11) a také reguluje apoptózu indukovanou inhibitory syntézy proteinů nebo činidly poškozujícími DNA v rakovinných buňkách (12). Knockdown TAX1BP1 pomocí siRNA (obrázek 1D) neovlivnil DC{119}}indukovanou cytotoxicitu v krátkodobých (obrázek 1E) a dlouhodobých testech životaschopnosti (obrázek 1F). Tyto výsledky ukázaly, že TAX1BP1 nehraje zásadní roli v DC{126}}zprostředkované cytotoxicitě. BNIP3 je proapoptotický protein, který narušuje mitochondriální bioenergetiku a reguluje mitofágii (13). Efektivní knockdown BNIP3 (obrázek 1G) neovlivnil DC{131}}indukovanou cytotoxicitu (obrázky 1, H a I). Tyto výsledky ukázaly, že cytotoxické účinky DC661 jsou nezávislé na expresi BNIP3. Dále jsme studovali účinky vyčerpání buněk kanonických autofagických genů potřebných pro produkci autofagozomů na účinnost DC661 tím, že jsme potlačili unc{136}} jako autofagii aktivující kinázu 1 (ULK1) a gen 7 související s autofagií (ATG7). Efektivní knockdown ULK1 nebo ATG7 (doplňkový obrázek 2, A a B) inhiboval autofagický tok (doplňkový obrázek 2C), ale neovlivnil DC661-indukovanou cytotoxicitu (obrázek 1, J–M). Tyto výsledky ukázaly, že nepřítomnost základního mechanismu autofagie nezruší cytotoxické účinky DC661. Lysozomální inhibice pomocí DC661 indukuje mnohočetné dráhy programované buněčné smrti. Kanonické hledisko je, že smrt lysozomálních buněk je způsobena apoptózou (5). Imunoblotting odhalil, že léčba DC661 vedla k aktivaci kaspázy-3, -7 a -9 a štěpení PARP-1, což potvrzuje, že DC661 aktivoval apoptózu (obrázek 2A). Inhibitor pan-kaspázy Z-VAD-FMK zabránil aktivaci kaspázy pomocí DC661, ale neinhiboval akumulaci LC3B a p62, což dokazuje, že aktivace apoptózy a blokáda autofagie jsou oddělitelné po lysozomální inhibici (obrázek 2B). Blokování apoptózy pomocí ZVAD-FMK nezvýšilo ani neomezilo cytotoxicitu DC661, což naznačuje, že apoptóza je pro smrt lysozomálních buněk postradatelná (obrázek 2, C a D). Cytotoxické účinky DC661 byly podobné u Bax/Bak double-KO primárních buněk kostní dřeně neschopných podstoupit apoptózu a WT buněk (obrázek 2E). Blokáda apoptózy neovlivnila DC{171}}indukovanou cytotoxicitu u buněk rakoviny tlustého střeva a rakoviny pankreatu (doplňkový obrázek 2, D–F). Protože jsme zjistili, že apoptóza je postradatelná pro buněčnou smrt indukovanou DC{173}}, zkoumali jsme, zda DC661 indukuje nekroptózu, další formu programované buněčné smrti regulovanou proteinkinázou interagující s receptorem (RIPK) a proteinem podobným kinázové doméně smíšené linie ( MLKL). Hladiny fosforylovaných a aktivovaných forem RIPK a MLKL byly po léčbě DC661 zvýšeny z 0,1–1 μM (obrázek 2F). Při 3 μM DC661 byla nepřítomnost fosforylovaného RIPK1, ale perzistentní fosforylovaný MLKL, což naznačuje, že při této vyšší koncentraci by mohly být zapojeny další formy buněčné smrti. Předběžná léčba inhibitory RIPK1 nekrostatiny-1 nebo nekrostatiny-1 nebo inhibitorem MLKL nekrosulfonamidem zabránila fosforylaci RIPK1 po léčbě DC661 (1 μM) v melanomových buňkách (obrázek 2G), ale nepodařilo se zachránit DC{192 }} indukovala cytotoxicitu v buňkách melanomu (obrázek 2H) nebo rakovině tlustého střeva nebo buňkách rakoviny slinivky břišní (doplňkový obrázek 2G). Tyto nálezy naznačují, že nekroptóza je aktivována, ale postradatelná pro buněčnou smrt zprostředkovanou DC{195}}.
Obrázek 1. Inhibice lysozomální autofagie indukuje významné změny v apoptóze a autofagických proteinech. (A)
Lysozomy jsou jedním z hlavních úložišť železa. Dysregulovaný intracelulární metabolismus železa spojený se sníženou redukční kapacitou může vyvolat neapoptotickou buněčnou smrt známou jako ferroptóza. Charakteristickým znakem feroptózy je upregulace prostaglandin-endoperoxid syntázy 2 (PTGS2), homologu regulátoru transportu kationtů 1 (CHAC1) a cysteinyl-tRNA syntetázy (CARS) (14). Všechny 3 tyto markery ferroptózy byly transkripčně upregulovány léčbou DC661 (obrázek 3A), což naznačuje, že lysozomální inhibice indukuje ferroptózu. DC661 vyvolal posun fluorescence v buňkách A375P ošetřených C11–BODIPY, což ukazuje na peroxidaci lipidů, charakteristickou pro feroptózu. Tento DC661-indukovaný posun byl významně obrácen v přítomnosti inhibitorů ferroptózy ferrostatinu-1 nebo lip roxstatinu-1 podávaných v účinné koncentraci (obrázek 3B a doplňkový obrázek 3A), což dále naznačuje, že DC661 indukovaná ferroptóza. Inhibice ferroptózy však nezachránila cytotoxicitu spojenou s DC661 (obrázek 3, C a D). Společné ošetření rakovinných buněk chelátorem železa deferoxaminem (DFO) a DC661 nezachránilo cytotoxicitu DC661 (obrázek 3E). Léčba ferostatinem-1, roxstatinem na rty-1 nebo DFO nezachránila DC661 inhibici krátkodobé životaschopnosti nebo dlouhodobého klonogenního růstu buněk rakoviny melanomu, tlustého střeva a slinivky břišní (doplňkový obrázek 3, B –E a doplňkový obrázek 4, A–D). Tato data ukazují, že ferroptóza je aktivována, ale není nutná pro DC661-zprostředkovanou buněčnou smrt. Pyroptóza je forma programované buněčné smrti spojené se zánětlivou odpovědí, která zahrnuje aktivaci kaspáz, které zpracovávají gastrin (GSDM), což umožňuje tvorbu pórů na plazmatické membráně a následné uvolnění molekulárních vzorců spojených s poškozením, jako je vysoká pohyblivost. skupinový box 1 (HMGB1). Léčba DC661 v mnoha buněčných liniích melanomu (A375P, A375, WM35 a WM793) vedla k aktivaci iniciační kaspázy-8 a -9 a popravčí kaspázy-7, typické pro pyroptózu, a produkovala štěpení GSDME o plné délce, podobného rozsahu jako u známého induktoru pyroptózy PLX4720 a PD0325901 (doplňkový obrázek 5A). DC661 produkoval silnější extracelulární uvolňování HMGB1 než známý induktor pyroptózy, BRAF a inhibice MEK v 1% FBS (15), což odráží funkční důsledek aktivované pyroptózy. Dále jsme testovali, zda by inhibice pyroptózy pomocí GSDME KO zlepšila cytotoxické účinky DC661. Léčba DC661 indukovala akumulaci LC3II a SQSTM1/p62 a aktivaci kaspázy, ale uvolňování HMGB1 bylo v lidských buňkách GSDME-KO WM35 téměř úplně zrušeno, což dokazuje, že bylo dosaženo funkčního důsledku inhibice pyroptózy (obrázek 3F). Ošetření DC661 však produkovalo stejnou cytotoxicitu v YUMM1.7 WT, prázdném vektoru (EV) a buňkách Gsdme KO1 a KO2 v podmínkách 10% i 1% FBS (obrázek 3G a doplňkový obrázek 5B). Jedním společným výsledkem mnoha forem buněčné smrti je uvolnění LDH. DC661 produkoval významné zvýšení uvolňování LDH, a to nemohlo být zvráceno apoptózou, nekroptózou nebo inhibicí ferroptózy (doplňkový obrázek 5C). Tyto výsledky ukázaly, že DC661 indukuje více způsobů buněčné smrti, včetně apoptózy a pyroptózy, stejně jako nekroptózy a ferroptózy, ale žádný z těchto způsobů buněčné smrti není vyžadován pro buněčnou smrt indukovanou DC661-. Inhibice katepsinu nebo chelace vápníku nezabrání buněčné smrti z permeabilizace lysozomální membrány. Když jsme prokázali, že aktivace kaspázy (která je nutná pro apoptózu a pyroptózu) je pro buněčnou smrt indukovanou DC661- postradatelná, předpokládali jsme, že uvolňování katepsinu z lysozomů může způsobit buněčnou smrt závislou na kaspáze. Chemická (DC661) nebo genetická (PPT1 siRNA [siPPT1]) inhibice PPT1 způsobila permeabilizaci lysozomální membrány (LMP), zatímco HDSF, méně účinný ireverzibilní inhibitor PPT1, který se rychle vyčerpává v buněčné kultuře, nemohl vyvolat LMP, jak bylo změřeno galektin-3–pozitivní puncta (obrázek 4A). LMP vede k uvolňování katepsinů a dalšího lysozomálního obsahu do cytoplazmy a považuje se za klíčový proximální rys buněčné smrti založené na lysozomech. LMP indukovaná DC661 byla spojena s významným zvýšením aktivity cytoplazmatického katepsinu-L, která byla významně blokována inhibitorem cysteinové proteázy E64 (obrázek 4B). Předchozí zprávy naznačovaly, že uvolňování katepsinu z rozbitých lysozomů podporuje aktivaci kaspázy, což vede k apoptotické buněčné smrti (16–18). Úplná inhibice katepsinu nezabránila štěpení kaspázy (obrázek 4C) a nezachránila DC{92}}indukovanou cytotoxicitu v krátkodobých a dlouhodobých testech životaschopnosti u melanomu (obrázek 4, D a E), rakoviny tlustého střeva a pankreatu rakovinné buňky (doplňkový obrázek 6, A–C). Tyto výsledky jsou v rozporu s kanonickým pohledem na lysozomální buněčnou smrt způsobenou katepsinem zprostředkovanou buněčnou smrtí. Kromě uvolňování katepsinu z prosakujících lysozomů se uvolňování vápníku z lysozomů podílí na buněčné dysfunkci, když je narušena PPT1 (19). Léčba DC661 vedla k rozsáhlému uvolňování vápníku, které bylo zrušeno předúpravou chelátoru buněčného permanentního vápníku (Ca{101}}), BAPTA-AM. (Obrázek 4F). Je pozoruhodné, že BAPTA-AM nezabránil DC 661-indukované LMP (obrázek 4G) nebo štěpení kaspázy (doplňkový obrázek 6, D a E), a co je nejdůležitější, nezachránil DC{108}}indukovanou cytotoxicitu ( Obrázek 4H). Tato zjištění byla také pozorována u buněčných linií RKO a MIA PaCa{110}}, u kterých nebyly pozorovány žádné významné rozdíly v hodnotách IC50 u BAPTA-AM a DC661 (doplňkový obrázek 6F), což naznačuje, že buněčná smrt spojená s LMP je nezávisí na vápníku nebo katepsinech.
Obrázek 2. DC661-indukovaná apoptóza a nekroptóza. (A)
Obrázek 3. Ferroptóza a pyroptóza indukovaná DC661-. (A)
LLP pohony LMP. Po zjištění, že inhibitory hlavních cest buněčné smrti (apoptóza, nekroptóza, ferroptóza a pyroptóza), katepsiny (PepA a E64) a iontové chelátory (BAPTA-AM [Ca2+] a DFO [Fe{{3} }]) nezabránilo buněčné smrti pomocí DC661 a při zjištění důkazů peroxidace lipidů pomocí C-11-BODIPY jsme provedli globální lipidomovou analýzu 2 a 4 hodiny po léčbě DC661. DC661 indukoval časné a trvalé 3- až 10-násobné zvýšení v každé třídě lysofosfolipidů (obrázek 5A). Na rozdíl od toho byly pozorovány minimální nebo žádné změny ve fosfolipidových třídách, včetně fosfatidylcholinu, fosfatidylethanolaminu, fosfatidylserinu, fosfatidylinositolu, fosfatidylglycerolu a kyseliny fosfatidové (doplňkový obrázek 7A). Lysofosfolipidové druhy mohou být generovány ROS, který oxiduje řetězec nasycených mastných kyselin, který je pak odštěpen fosfolipázami (20). Abychom zjistili, zda antioxidanty mohou zabránit poškození lipidů zprostředkovanému ROS, zkoumali jsme DC661-indukovanou cytotoxicitu v přítomnosti pan-ROS scavengeru N-acetylcysteinu (NAC) (21, 22) a domnělých inhibitorů peroxidace lipidů Trolox (23 ) a vitamín C (kyselina askorbová) (24, 25). Na rozdíl od jiných dosud testovaných činidel společná léčba s NAC zachránila cytotoxicitu spojenou s DC661- napříč mnoha buněčnými liniemi (obrázek 5B a doplňkový obrázek 7B). Dlouhodobé testy CFU ukázaly, že NAC, na rozdíl od všech zde testovaných inhibitorů buněčné smrti, iontových chelátorů a inhibitorů katepsinu, zabránil cytotoxickým účinkům DC661 v buňkách A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 a MC38 ( Obrázek 5C a doplňkový obrázek 7C). Je zajímavé, že Trolox a vitamín C nezachránily cytotoxicitu DC661 u lidského melanomu, kolorektálního karcinomu, buněk rakoviny pankreatu a myšího melanomu a buněk kolorektálního karcinomu (obrázek 5D a doplňkový obrázek 7, D–H). Tato disparita nás přiměla otestovat, zda NAC, Trolox a vitamín C ovlivňují LMP. Naše výsledky ukázaly, že NAC byl jediný antioxidant, který významně redukoval DC661-indukovanou LMP (obrázek 5E). Předpokládali jsme, že LLP řídí produkci LMP pomocí DC661, kterou může vrátit NAC, ale ne Trolox a vitamín C. Ke studiu procesu LLP jsme použili fluorescenční sondu FOAM-LPO (26), která se specificky lokalizuje do lysozomu a produkuje spektrální posun z 586 na 512 nm (červená až zelená) při vystavení lipidovým peroxidům. Zjistili jsme, že DC661 indukoval LLP ve srovnání s kontrolou (obrázek 5F). NAC snížil peroxidaci lipidů v lysozomech buněk melanomu ošetřených DC661-, zatímco Trolox a vitamín C nedokázaly snížit LLP (obrázek 5F). NAC, Trolox a vitamín C samy o sobě neměly žádný významný vliv na peroxidaci lipidů. Knockdown PPT1 (doplňkový obrázek 8A) nebo léčba vysokými koncentracemi HCQ (doplňkový obrázek 8B) také indukovala LMP, kterou bylo možné zvrátit pomocí NAC, zatímco chemická inhibice ULK1 nevyvolala LMP (doplňkový obrázek 8C). Důležité je, že knockdown siPPT1 také zahrnoval LLP, který by mohl být zvrácen pomocí NAC (doplňkový obrázek 8D) Tyto výsledky ukázaly, že inhibice PPT1 indukuje LLP, kterou lze zachránit pomocí NAC, a je pravděpodobně příčinou LMP indukované inhibicí PPT1-. Dále tato zjištění naznačují, že LLP je rozhodující pro smrt lysozomálních buněk.
Čínská bylina cistanche rostlina-Protinádorová
Import cysteinu do lysozomů pomocí MFSD12 zeslabuje smrt lysozomálních buněk. Ze 3 inhibitorů peroxidace lipidů pouze NAC zabránil LLP. Nedávná zpráva ukázala, že hlavní doména superrodiny facilitátoru obsahující 12 (MFSD12) je základní složkou importéru cysteinu pro lysozomy a melanosomy (27). Usoudili jsme, že NAC nebo jeho metabolit cystein je transportován do lysozomu prostřednictvím MFSD12, kde se cystein oxiduje na svůj disulfid, cystein. Abychom tuto hypotézu otestovali, porovnali jsme schopnost NAC zachránit cytotoxicitu DC661 v buňkách siNT a siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Naše výsledky ukázaly, že NAC zachránil DC661-indukovanou LMP v buňkách siNT, ale nezachránil LMP v buňkách siMFSD12 (obrázek 6A). NAC snížil LLP buněk siNT-A375P ošetřených DC661-, ale ne buněk siMFSD12. Buňky siMFSD12 ošetřené DMSO nebo NAC měly zvýšenou bazální LLP (obrázek 6B) ve srovnání s buňkami siNT. Zatímco NAC zachránil DC661 cytotoxicitu v siNT buňkách, schopnost NAC zachránit DC661 cytotoxicitu byla zcela zrušena v siMSFD12 buňkách (obrázek 6C). To ukázalo, že knockdown MFSD12 blokuje cytoprotektivní účinky NAC proti DC661. NAC je deacetylován acylázou v cytosolu (28). Abychom určili, zda léčba NAC produkuje akumulaci cysteinu nebo cystinu v lysozomech, použili jsme techniku lysozomální imunoprecipitace (Lyso-IP) (29) k čištění lysozomů z buněk A375P ošetřených DMSO a NAC (obrázek 6D a doplňkový obrázek 9A) a provedli jsme cílená metabolomika pro kvantifikaci NAC a příbuzných metabolitů. Jak se očekávalo, NAC byl detekován v lyzátu celých buněk ošetřených NAC a souvisejících nenavázaných frakcích. Hladiny L-cysteinu byly podstatně zvýšeny v lysozomech ošetřených NAC. L-cystin byl detekovatelný pouze v lysozomech ošetřených NAC. Překvapivě jsme nenašli významné zvýšení glutathionu (sníženého) ve skupinách léčených NAC (obrázek 6E); to bylo překvapivé, protože se běžně věří, že ošetření NAC indukuje zvýšenou produkci glutathionu, korigující redoxní rovnováhu. Tyto výsledky naznačují, že cystein importovaný do lysozomů prostřednictvím importéru MFSD12 je kritický pro záchranu LLP, LMP a smrti lysozomálních buněk. LLP je imunogenní. Některé formy regulované buněčné smrti indukované DC661 (pyroptóza, nekroptóza, ferroptóza) byly identifikovány jako imunogenní. Dříve byla imunogenní buněčná smrt popsána u chemoterapeutických léků na základě charakteristických znaků, které zahrnují zobrazení molekulárních vzorů spojených s poškozením, včetně exprese CALR na buněčném povrchu a uvolňování proteinu HMGB1 a adenosintrifosfátu (ATP) (30). CALR působí jako signál „sněz mě“, když je vystaven buněčným povrchům během buněčného stresu. Extracelulární uvolňování HMGB1 a ATP působí jako signál „najdi mě“ rozpoznávaný fagocytujícími buňkami. Porovnali jsme dva modely: buňky B16F10, které v modelech syngenních nádorů téměř zcela postrádají lymfocyty infiltrující nádor, a buňky MC38, které v modelech syngenních nádorů mají lymfocyty infiltrující nádor. Nejprve jsme prokázali, že léčba DC661 nebo siPpt1 významně indukuje povrchovou expresi CALR, která může být zcela zrušena společným ošetřením NAC v buňkách MC38 (obrázky 7, A a B). Podobné nálezy byly pozorovány u buněk B16F10 (obrázek 7C). Inhibitory hlavních cest buněčné smrti (apoptóza, nekroptóza, ferroptóza a pyroptóza) nedokázaly zabránit povrchové expresi CALR (obrázek 7D). Aby se určilo, zda je imunogenní buněčná smrt indukovaná DC661 způsobena upregulací MHC I. třídy, byly buňky B16F10 a MC38 ošetřeny DC661 (3 uM) nebo DMSO po dobu 24 hodin. Zjistili jsme, že léčba DC661 nezvýšila expresi MHC třídy I a upregulaci imunoproteazomu (obrázek 7E a doplňkový obrázek 9, B a C).
Obrázek 4. Inhibice katepsinu nebo chelace vápníku nezabrání buněčné smrti indukované DC661-. (A)
Abychom porozuměli účinkům inhibice autofagie na aktivaci T buněk, provedli jsme experiment in vitro priming a kokultivace s použitím splenocytů C57BL6/J, jak bylo popsáno dříve (31). Pro primární aktivaci jsme vystavili splenocyty buňkám B16F10 nebo MC38 ošetřeným DC661- nebo DMSO. Dále byly tyto aktivované splenocyty kultivovány s živými buňkami B16F10 nebo MC38 a byla měřena cytotoxicita (obrázek 8A). Splenocyty primované buňkami B16F10 ošetřenými DC661-produkovaly významné zvýšení IFN- ve srovnání se splenocyty vystavenými buňkám B16F10 ošetřeným DMSO. Zabíjení proliferujících B16F10 buněk zprostředkované aktivovanými T buňkami bylo významně zvýšeno u splenocytů aktivovaných DC661- ve srovnání se splenocyty aktivovanými DMSO (obrázek 8, B a C). Buňky MC38 ošetřené DC661 produkovaly ještě více IFN- a primárně aktivované T buněčné cytotoxicity ve srovnání s buňkami B16F10 (obrázek 8, D a E). Souběžné ošetření NAC s DC661 dokázalo úplně zrušit uvolňování IFN- ze splenocytů a otupit cytotoxicitu T lymfocytů (obrázek 8, F a G). Knockdown calreticulinu pomocí siCalr v buňkách MC38 (doplňkový obrázek 9D) zrušil účinnost primární aktivace léčby DC661 a významně snížil cytotoxicitu aktivovaných T-buněk (obrázek 8, H a I). Celkově vzato tato data podporují mechanickou úlohu upregulace CALR spojené s LLP při podpoře protinádorové buněčné T buněčné imunity. Dále jsme tato zjištění in vitro rozšířili na in vivo studii protinádorové vakcinace na modelech imunokompetentních a imunodeficientních myší. Pro tento test byly in vitro zmražené a rozmrazené buňky B16F10 nebo MC38 ošetřené DC{40}}injikovány subkutánně do levého boku, aby byly imunokompetentní myši C57BL/6 nebo NOD/SCID chráněny před opětovnou expozicí živými nádorovými buňkami stejného druhu, které byly injikovány O 7 dní později do pravého boku (obrázek 9A). Buňky B16F10 ošetřené DC661-nezabránily rejekci nádoru navzdory in vitro testům, což naznačuje, že DC661 indukoval imunogenní buněčnou smrt (obrázek 9B a doplňkový obrázek 9E). Naproti tomu inokulace jednoho boku buňkami MC38 ošetřenými DC661-podporovala úplné odmítnutí živých buněk MC38 implantovaných na opačném boku (obrázek 9C a doplňkový obrázek 9F). Abychom určili, zda je adaptivní imunita kritická pro účinek vakcíny, který se zdálo mít DC661 s nádory MC38, opakovali jsme experiment na myších NOD/SCID. Překvapivě jsme zjistili, že buňky MC38 ošetřené DC661-neindukovaly odmítnutí nádorů po opětovné expozici u imunodeficientních NOD/SCID myší (obrázek 9D a doplňkový obrázek 9G), což naznačuje, že pro pozorovaný účinek vakcíny byla nutná adaptivní imunita. Abychom otestovali robustnost tohoto zjištění, vybrali jsme další dobře známou imunogenní myší rakovinnou buněčnou linii, CT26, a provedli jsme vakcinační experiment, jak je uvedeno výše. Jak se očekávalo, implantace buněk CT26 ošetřených DC661- do jednoho boku myši vyvolala účinek podobný vakcíně a zabránila růstu živých buněk CT26 implantovaných do druhého boku (obrázek 9E a doplňkový obrázek 9H). Naše zjištění naznačují, že DC661-indukovaná LLP je kritická pro imunogenní buněčnou smrt zprostředkovanou LMP, která je zvrácena importem cysteinu do lysozomu lysozomálním transportérem MFSD12 (obrázek 9F).
Diskuse
Lysozomální inhibice se v preklinických studiích jeví jako slibný terapeutický přístup a klinické studie HCQ přinesly povzbudivé, ale smíšené výsledky (1, 32). PPT1 je molekulárním cílem HCQ a silnější inhibitory PPT1, jako je DC661 (2) a GNS561 (3), indukují buněčnou smrt zprostředkovanou LMP in vitro. Přesný mechanismus smrti lysozomálních buněk a jeho role v imunogenicitě nádoru nebyly plně objasněny. Protinádorová imunita je posílena, když je inhibice autofagie kombinována s imunoterapií (9, 10, 31). Navrhované mechanismy pro buněčnou vnitřní imunogenicitu po autofagické inhibici zahrnují MHC třídy I a upregulaci imunoproteazomu, které oba podporují zlepšené zpracování a prezentaci antigenu. Kromě toho ztráta autofagických proteinů nebo inhibice autofagie chlorochinem zesílila odpověď CD8+ T buněk zvýšením povrchových hladin MHC třídy I v dendritických buňkách (33). Již dříve jsme ukázali, že systémová inhibice PPT1 může repolarizovat makrofágy z fenotypu M2 na M1. Inhibitory PPT1 mohou zvýšit hladiny STING, což vede k uvolňování IFN a zvýšení zabíjení zprostředkovaného T buňkami v modelech melanomu (31). Zde jsme ukázali, že LLP sama o sobě produkuje imunogenní formu buněčné smrti vlastní nádorové buňce. Zjistili jsme, že lysozomální inhibice indukovala velmi málo změn proteinů v rakovinných buňkách a nejvýrazněji zvýšené proteiny zahrnovaly autofagické cargo receptory a regulátory apoptózy. Náš přístup zaměřený na některé z těchto genů napříč funkcemi ukázal, že proteiny indukované léky pravděpodobně nebyly hlavními regulátory buněčné smrti. Genetická inhibice ULK1 nebo ATG7 také nezachránila cytotoxicitu DC661. Prokázali jsme, že lysozomální inhibice aktivuje více forem programované buněčné smrti, včetně apoptózy, nekroptózy, ferroptózy a pyroptózy, ale každá z nich byla postradatelná pro cytotoxicitu vyvolanou léky. Je třeba poznamenat, že mechanismy programované buněčné smrti se mohou překrývat a společné zacílení více mechanismů buněčné smrti by mohlo poskytnout cytoprotekci proti buněčné smrti po permeabilizaci lysozomální membrány. Naše práce vyloučila mechanismy lysozomální buněčné smrti závislé na katepsinu a vápníku a zdůraznila význam LLP jako kritického determinantu buněčné smrti. Našli jsme důkaz LLP, který byl reverzibilní antioxidantem, který byl transportován do lysozomu, NAC a byl kritický pro permeabilizaci lysozomální membrány a cytotoxicitu. NAC byl jediným činidlem schopným zmírnit nebo zvrátit DC661-indukovanou buněčnou smrt a tato kapacita byla závislá na přítomnosti lysozomálního cysteinového transportéru MFSD12. Nedostatek lysozomální penetrace je pravděpodobně důvodem, proč jiné domnělé inhibitory peroxidace lipidů, Trolox a vitamin C, nebyly schopny zabránit cytotoxicitě DC661. NAC se přeměňuje na cystein, který je importován do lysozomů a oxiduje na svou disulfidovou formu, cystin. Cystin je exportován do cytosolu dalším lysozomálním transportérem, cystinózou, kde je redukován na cystein, který remobilizuje vnitřní zdroje živin, reaktivuje cíl rapamycinového komplexu 1 a podporuje autofagii (34). Tento oxidačně-redukční cyklus cysteinu na cystin (lysozomy) a zpět na cystein (cytosol) by mohl být možným záchranným mechanismem NAC proti cytotoxicitě DC661 nebo obecnějšímu lysozomálnímu poškození v jiných kontextech onemocnění, kde se NAC ukázalo jako užitečné terapeuticky (35) . NAC nejen revertoval DC661-indukované LLP a LMP, ale také povrchovou expresi imunogenního markeru buněčné smrti kalretikulinu. Exprese proteinu CALR na buněčném povrchu byla vyžadována pro zvýšenou cytotoxicitu zprostředkovanou T buňkami indukovanou splenocyty aktivovanými DC661-, což dokazuje, že lysozomální inhibice vytváří specifickou formu imunogenicity vlastní buňky.
Zatímco předchozí studie prokázaly, že lysozomální inhibice může zvýšit protinádorovou aktivitu inhibice imunitního kontrolního bodu u zavedených nádorů na boku (9, 31), naše studie je první, která nám prokázala účinek podobný vakcíně u nádorů MC38, ale ne u nádorů B16. nádorové buňky předem ošetřené DC661 před implantací. To demonstruje, že smrt lysozomálních buněk může vyvolat imunogenicitu vlastní buňky, ale tyto změny samy o sobě nejsou dostačující k tomu, aby zvrátily „imunitně chladné“ nádorové mikroprostředí na „imunitně horké“ nádorové mikroprostředí. Naše předchozí studie na modelech nádorového mikroprostředí „imunního chladu“ B16 a na myších modelech genetického inženýrství BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 (31) prokázaly, že systémová lysozomální inhibice vyvolala účinky na makrofágy spojené s nádorem a supresorové buňky odvozené od myeloidních buněk, které byly dostatečné k posílení účinnost imunoterapie. Může se stát, že imunogenicita vlastní buňky také hraje roli v těchto imunitních studených nádorech, které se stávají citlivějšími na ICD po lysozomální inhibici. Účinek lysozomální inhibice podobný vakcíně pozorovaný v kontrolovaném laboratorním prostředí se může, ale nemusí promítnout do klinické praxe, ale mohl by vysvětlit, proč někteří pacienti léčení dabrafenibem, trametinibem a HCQ u dříve léčeného mutantního melanomu BRAF měli tak hlubokou a trvalou reagovat na tento režim (32). Je zapotřebí další studie, abychom pochopili, jak inhibice PPT1 produkuje lysozomální ROS a peroxidaci lipidů. PPT1-závislá regulace V-ATPázy a lysozomální acidifikace není dostatečným vysvětlením, protože bafilomycin inhibuje lysozomální acidifikaci, ale neprodukuje LMP (data nejsou uvedena). Důsledky těchto zjištění naznačují, že lysozomální inhibitory, které zvyšují vlastní imunogenicitu nádorových buněk, lze racionálně kombinovat s terapiemi, které zvyšují aktivaci T-buněk nebo infiltraci do mikroprostředí nádoru, což potenciálně přináší synergické účinky.
Obrázek 5. N-acetylcystein zabraňuje DC661-indukované buněčné smrti. (A)
Metody
Buněčná kultura. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) a myší B16F10 (CRL-6475) buněčné linie byly zakoupeny od ATCC. Lidské linie A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 a myší YUMM1.7 (WT, Gsdme EV a Gsdme KO1 a KO2) byly získány interně. Myší buňky MC38 a CT26 poskytl Andy Minn, University of Pennsylvania. Primární buňky kostní dřeně FL5.12 a IL-3-dependentní Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) byly získány od Kathryn E. Wellen, University of Pennsylvania. Lidskou buněčnou linii Panc-1 (CRL-1469, ATCC) poskytl Ben Z. Stanger, University of Pennsylvania. Myší buněčná linie YUMMER 1.7 byla získána od Xiaowei (George) Xu, University of Pennsylvania. Všechny buněčné linie byly dvakrát ročně testovány na Mycoplasma zařízeními University of Pennsylvania Core a autentizovány pomocí krátkého tandemového opakování otisků pomocí jádra Wistar Institute Genomics. Buněčné linie A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 a Bax/Bak DKO byly kultivovány v RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Buněčné linie A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10 a MC38 byly kultivovány v DMEM (Invitrogen, 11995); a YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV a Gsdme KO1 a KO2) buňky (15) byly kultivovány v DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Kultivační média byla doplněna 10% fetálním bovinním sérem (12306C, MilliporeSigma) a 1× antibiotickým antimykotickým roztokem (Gibco, 15140-122). Buněčné linie FL5.12 a Bax/Bak DKO byly udržovány v kompletním médiu RPMI doplněném 50 uM merkaptoethanolu (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) a 0,35 ng/ml a 3,5 ng /mL IL-3. Buněčné linie YUMMER1.7 a YUMM1.7 (WT, Gsdme EV a Gsdme KO) byly udržovány v kompletním médiu doplněném 1x MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Buňky WM35 a WM793 byly kultivovány v médiu MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), obsahujícím 10 % FBS v 1× Leibovitz L-15 médiu (Corning, 10-045-CV), 7,5 % w/v hydrogenuhličitan sodný ( Corning, 25-035-CI), 1× antibiotický antimykotický roztok (Gibco, 15140-122) a 5 ug/ml inzulínu (MilliporeSigma, I0516). Buňky byly pěstovány při 37 stupních v přítomnosti 5% CO2. Chemikálie a činidla. Zakoupené chemikálie zahrnovaly HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) a DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo{100}}, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) byl použit k barvení buněk na vápník podle pokynů výrobce. Seznam protilátek a inhibitorů je uveden v Doplňkové tabulce 1 a Doplňkové tabulce 2.
Obrázek 6. NAC obrací LLP způsobem závislým na MFSD12-. (A–C)
Extrakce a digesce proteinů pro analýzu kapalinovou chromatografií – tandemovou hmotnostní spektrometrií pro proteomiku. {{0}}.7 × 106 buněk melanomu A375P bylo kultivováno v 60 mm kultivačních miskách. Buňky byly ošetřeny DMSO (kontrola), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) nebo HCQ (3{{70}} μM) po dobu 24 hodin při přibližně 5{{ 112}% soutok. Zmrazené buněčné pelety byly lyžovány pomocí 50 mM Tris pH 7,4, 1 % SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/ml pepstatinu, a 1 ug/ml leupeptinu. Vyčeřené lyzáty (každý 1 0 ug) byly podrobeny elektroforéze 0,5 cm do bis-tris gelu, následovala fixace a barvení koloidní Coomassie. Každý 0,5 cm pruh gelu byl vyříznut, odbarven, redukován tris (2-karboxyethyl)fosfinem, alkylován jodacetamidem a štěpen trypsinem, jak bylo popsáno dříve (36). Digesty (1 ug) byly analyzovány kapalinovou chromatografií – tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) na hmotnostním spektrometru Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) v souladu s nanoAQUITY UPLC (Waters). Analytická separace byla provedena na 1,7 μm × 250 mm Peptide BEH C18 koloně (Waters, 186003546) s použitím 245-minutového gradientu s 0,1% kyselinou mravenčí ve vodě (mobilní fáze A) a acetonitrilu (mobilní fáze B) následovně : 5 %–30 % B po dobu 225 minut, 30 %–80 % B po dobu 5 minut, 15-minutové držení na 80 % B a návrat k výchozím podmínkám. Úplná MS spektra byla získána při rozlišení 70000, s rozsahem skenování 400–2000 m/z, cílem automatického řízení zisku 3 × 106 iontů a maximální dobou nástřiku 50 milisekund. Spektra MS2 závislá na datech byla získána pro 20 nejhojnějších iontů s rozlišením 17 500, s šířkou izolace 1,5 m/z, cílem automatického řízení zisku 5 × 104 iontů a maximální dobou vstřikování 50 milisekund. Peptid match byl nastaven na preferovaný a nepřiřazené a jednotlivě nabité ionty byly odmítnuty (37). Nezpracovaná MS data byla analyzována pomocí MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) s databází lidských sekvencí Uniprot (přístupná 10. října 2019) a společnou databází kontaminantů, včetně trypsinu, keratinu, hovězích proteinů, a mykoplazma (38). Při hledání byla použita specificita tryptického peptidu s maximálně 2 chybějícími štěpeními, fixní modifikace na cysteinu (karbamidomethylace) a variabilní oxidace methioninu nebo N-terminální acetylace (39). Pro peptidy a proteiny byla použita mezní hodnota 1 % FDR. Shoda mezi běhy byla povolena; proteiny byly kvantifikovány pomocí kvantifikace bez značení (40). Statistická analýza byla provedena pomocí Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Bylo požadováno, aby proteiny byly identifikovány alespoň 3 jedinečnými peptidy a měly 3 platné hodnoty (nenulová kvantifikace) v rámci skupiny vzorků a kontaminanty a reverzní proteiny byly odfiltrovány ze souboru dat. Chybějící hodnoty byly dopočítány z normálního rozdělení. Párová srovnání mezi podmínkami byla provedena na úrovni proteinu pomocí 2-sledovaného Studentova t-testu s FDR na základě permutace s s{92}}}.1 a 250 randomizacemi. Významné změny byly definovány jako FDR menší než 5 % a absolutní násobek změny větší než 1,5 nebo 2,0, jak je uvedeno. Lyso-IP. Buňky A375P byly infikovány lentivirem pLJC5-Tmem{103}}xHA a selektovány pomocí 1 mg/ml puromycinu (MilliporeSigma, P4512). Přibližně 3 x 106 HA-značených buněk A375P bylo ošetřeno buď 10 mM NAC nebo kontrolou s vodným vehikulem po dobu 24 hodin v kultivačních podmínkách popsaných dříve. Po ošetření byly buňky promyty v PBS, sklizeny v 0,5 ml studeného KPBS a jemně homogenizovány pomocí 20 tahů v 2 ml Dounce homogenizátoru. Asi 2,5 % homogenátu bylo vyhrazeno pro analýzu lyzátu celých buněk a zbytek byl centrifugován při 3,{120}} g po dobu 2 minut při 4 stupních, aby se odstranily zbytky buněčné membrány. Homogenátový supernatant byl poté přenesen do čisté 1,5 ml zkumavky a inkubován s 50 ul anti-HA kuličkami (Pierce, 88836) nebo anti-DDK/Flag kuličkami (OriGene, TA150042) po dobu 15 minut při 4 stupních. Vzorky pak byly vysráženy umístěním zkumavek na DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) a jemně třepány po dobu 2 minut při teplotě místnosti. Supernatant byl rezervován pro analýzu nenavázaných frakcí. IP byla promyta 3krát KPBS obsahujícím 8 mM CaCl2. Lyso-IP byl extrahován v 80% MeOH pro metabolomickou analýzu. Extrakce a analýza lipidů pomocí LC-MS/MS pro globální lipidom. Buňky melanomu A375P byly nasazeny na 60 mm misky v množství 0,7 x 106 buněk na misku. Když byly buňky na přibližně 50% konfluenci, byly ošetřeny DMSO (kontrola), DC661 (3 uM) nebo HCQ (30 uM) po dobu 24 hodin. Buňky byly 2krát promyty HBSS, seškrábnuty do ledově chladného methanolu a přeneseny do skleněných zkumavek pro extrakci lipidů směsí chloroform/methanol/0,88% NaCl (2:1:1) obsahující vnitřní lipidový standard EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Vzorky byly vortexovány a poté sonikovány vodní lázní po dobu 5 minut na ledu. Po centrifugaci při 500 g po dobu 15 minut při 40 stupních byla spodní fáze přenesena do jiné skleněné zkumavky. Horní fáze byla reextrahována pomocí syntetické spodní fáze. Po sonikaci a odstředění byla spodní fáze spojena s první nižší fází odběru. Vzorky byly vysušeny pod dusíkem, resuspendovány v 10% chloroformu/90% methanolu a přeneseny do skleněných LTQ lahviček. Lipidové vzorky byly analyzovány na hmotnostním spektrometru Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X a systému Vanquish Horizon UHPLC. K analytické separaci byla použita kolona Accucore C30 (2,1 mm x 150 mm, Thermo Fisher Scientific) s 50:50 acetonitril/voda a 88:10:2 isopropanol/acetonitril/voda, každá obsahující 5 mM mravenčan amonný a 0,1 % kyseliny mravenčí. LC-MS/MS data byla získána odděleně v pozitivní a negativní polaritě s následujícími parametry přístroje: MS1 sken 120, 000 rozlišení; datově závislý MS2 na 20 nejhojnějších iontech s rozlišením 15,{184}}; 0,4 m/z šířka izolace; a stupňovitou normalizovanou srážkovou energii 20:30:40 (43).
Obrázek 7. N-acetylcystein zabraňuje DC661-indukované povrchové expresi kalretikulinu. (INZERÁT)
Lipidy byly identifikovány a kvantifikovány pomocí LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Identifikované druhy lipidů byly filtrovány podle očekávaných aduktů a stupně identifikace na základě třídy. Plochy píku byly normalizovány podle standardů EquiSPLASH pro podporované třídy a dále normalizovány na základě celkové plochy pro každý vzorek, aby se korigovaly odchylky v počtu buněk. Statistická analýza byla provedena na log-transformovaných datech pomocí Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Extrakce a analýza metabolitů pomocí LC-MS/MS pro metabalone. Polární metabolity byly extrahovány z celých buněk, Lyso-IP nevázaných frakcí a Lyso-IP vázaných vzorků pomocí 80% methanolu a byly skladovány při –8{{30}} stupních před kapalinovou chromatografií – analýza hmotnostní spektrometrie (LC-MS). Extrakty byly analyzovány pomocí LC-MS za použití Thermo Scientific Q-Exactive HF-X hmotnostního spektrometru se sondou HESI II v souladu se systémem Thermo Vanquish Horizon UHPLC. LC separace byla provedena pomocí kolony ZIC-HILIC (2,1 mm × 150 mm, velikost částic 5 μm, EMD Millipore) s ochrannou kolonou ZIC-HILIC (2,1 mm × 20 mm, EMD Millipore) udržovanou při 45 stupních s průtokem 0,2 ml/min. Chromatografie byla prováděna za kyselých podmínek, aby se snížila reaktivita thiolových skupin. Mobilní fáze A byla voda a B byl acetonitril, obě obsahující 0,1% kyselinu mravenčí. Gradient LC byl 85 % B po dobu 2 minut, 85 % B až 20 % B po dobu 15 minut, 20 % B až 85 % B po dobu 0,1 minuty a 85 % B po dobu 8,9 minut. Autosampler byl udržován ve 4 stupních a 4 ul každého vzorku byly injikovány na analýzu. Byly použity následující parametry MS: průtoková rychlost pláště plynu, 40 AU; průtok pomocného plynu, 10 AU; průtok plynu, 2 AU; teplota pomocného plynového ohřívače, 350 stupňů; rozprašovací napětí, 3,75 kV pro kladný režim a 3,5 kV pro záporný režim; kapilární teplota, 375 stupňů; a úroveň RF trychtýře, 40 %. Všechny vzorky byly analyzovány plnou MS s přepínáním polarity. Úplné MS skeny byly získány od 65 do 975 m/z při 120,000 rozlišení s automatickým cílem řízení zisku 1 × 106 iontů a maximální dobou nástřiku 100 milisekund. Nezpracovaná data byla analyzována pomocí TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Cílené metabolity byly identifikovány přesnou hmotností a retenčním časem v jejich preferované polaritě na základě analytických standardů. Detekce píku používala algoritmus ICIS s vyhlazováním 1. Relativní kvantifikace byla provedena pomocí integrované plochy píku a tyto hodnoty byly korigovány na celkové množství na vzorek (definované jako celková plocha píku). Úprava PPT1-CRISPR/Cas9. A375P PPT1-necílové a KO buňky byly připraveny, jak bylo popsáno dříve (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) byl dar od Feng Zhang (plasmid Addgene, 48139). Oliga vodící RNA (IDT) byly hybridizovány, fosforylovány a poté ligovány do plasmidu pX459 štěpeného a defosforylovaného BbsI podle protokolů Zhang lab, dostupných prostřednictvím Addgene. Ligované plazmidy byly transformovány do buněk Stbl3 (Invitrogen). Sekvenování plasmidových preparátů potvrdilo přítomnost požadovaných sekvencí vodící RNA. Buňky A375P byly transfekovány pomocí Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015) a následně puromycinová selekce. Surveyor testy potvrdily editaci genu PPT1 pomocí CRISPR/Cas9 a knockdown PPT1 byl potvrzen Western blotováním s protilátkou PPT1 (Origene). Sekvence pro vodící RNA oligo jsou následující: necílová vodicí RNA vpřed (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), necílová vodicí RNA reverzní (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), humánní PPT1 vodicí RNA 1 vpřed (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), humánní PPT1 vodicí RNA 3 zpětná vazba 3GGAG1 humánní PPT1 vodicí RNAG1GAG1 vpřed (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) a lidskou PPT1 vodící RNA 3 reverzní (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Klony pěstované z jednotlivých buněk použité v tomto článku zahrnují následující: klon C8 je lidský průvodce 1 a klon B5 je lidský průvodce 3. Imunoblotting. Jeden milion buněk byl umístěn na misku o průměru 10 cm a ošetření bylo provedeno následující den; buňky byly odebrány seškrábáním. Celobuněčné lyzáty byly připraveny s použitím lyzačního pufru SDS. Koncentrace proteinu byla měřena pomocí soupravy Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30–50 ug proteinu bylo použito pro SDS-PAGE a bylo přeneseno na membránu PVDF (Bio-Rad, 1620177). Membrána byla blokována pomocí 5% BSA nebo 5% odstředěného mléka podle optimalizovaných podmínek a inkubována s primární protilátkou přes noc při 4 stupních. PVDF membrány byly promyty 1x TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS{111}}) a inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s druhově specifickou sekundární protilátkou konjugovanou s HRP. Membrány byly následně promyty a vyvinuty pomocí substrátu Pierce ECL Western blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) a autoradiografických filmů (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Pro studie pyroptózy byly proteinové lyzáty separovány pomocí SDS-PAGE a přeneseny na PVDF membrány. Po blokování v 5% BSA byly PVDF membrány inkubovány s uvedenými primárními protilátkami přes noc při 4 stupních, promyty v PBS/Tween a inkubovány se sekundárními protilátkami spojenými s peroxidázou. Imunoreaktivita byla detekována pomocí HRP-konjugovaných sekundárních protilátek (CalBioTech), chemiluminiscenčního substrátu (Thermo Fisher Scientific) a zobrazovacího systému ChemicDoc MP (Bio-Rad). Pro experimenty zahrnující supernatant byly buňky kultivovány v médiu bez FBS, aby se zabránilo narušení SDS-PAGE. Buněčné supernatanty byly sklizeny a centrifugovány po dobu 10 minut při 500 g při 4 stupních, aby se odstranily buněčné zbytky. Výsledné supernatanty byly 10x koncentrovány pomocí Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) centrifugací po dobu 30 minut při 4500 g při 4 stupních. Koncentráty byly smíchány se vzorkovým pufrem a analyzovány pomocí Western blotu, jak je popsáno výše. Barvení proteinového gelu bylo provedeno pomocí barvení Ponceau red. Test aktivity LMP a kathepsinu L. Lidský plazmid pEGFP-hGal3 byl darem od Tamotsu Yoshimori (plazmid Addgene, 73080) a byl použit k vytvoření linie A375P-galektin{139}}. Byla zakoupena kostra kontrolního plazmidového vektoru pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Plazmidy byly transfekovány (1 ug/ml) do buněk A375P použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) podle protokolu výrobce; transfekované buňky byly stabilně selektovány pomocí G418 (Gibco, 10131035). U LMP bylo spočítáno celkem 25 A375P-galektin{152}} punktapozitivních buněk ve více obrazových polích. Procento bodově pozitivních buněk bylo vypočteno v každém poli zvlášť a pro každou skupinu bylo vypočteno průměrné procento. Testovací souprava Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) byla použita podle protokolu výrobce. Buňky byly zobrazeny pod inverzním mikroskopem Zeiss Axio Observer 7. Surová integrovaná intenzita Magic Red byla vypočtena pomocí softwaru Fiji - ImageJ (NIH). Test životaschopnosti buněk MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-difenyltetrazoliumbromid). 2 000 buněk bylo naočkováno v triplikátech do každé jamky 96-jamkové destičky a 3-denní MTT testy byly provedeny pomocí sady Cell viability Kit (Roche, 11465007001) podle protokolu výrobce. Předběžné ošetření inhibitorem bylo prováděno po dobu 1 hodiny, poté následovalo společné ošetření buněk inhibitory s nebo bez DC661. K výpočtu IC50 byla použita metoda nelineární regrese (proložení křivky).
cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém
Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity
【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Test tvorby kolonií. 2,000 buněk na jamku bylo nasazeno do 6-jamkové destičky a ošetřeno následující den; buňky byly ponechány pod ošetřením celkem 8 dní. Kolonie vytvořené v každé jamce byly promyty PBS, fixovány studeným methanolem při –20 stupních po dobu 20 minut a obarveny 0,5% vodným roztokem Crystal violet (V5265; MilliporeSigma).
Test vyloučení barviva trypanovou modří. Reakční směs pro test trypanové modři byla připravena smícháním 1 dílu 0,4% trypanové modři (25- 900-CI, Corning) a 1 dílu naředěných vzorků buněk. Směs byla inkubována po dobu 1 minuty a buňky byly spočítány na Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).
Obrázek 8. DC661-indukovaná povrchová exprese kalretikulinu aktivuje T buňky proti nádorovým buňkám. (A)
Obrázek 9. Inokulace buněk ošetřených DC661-ve specifických kontextech vede k odmítnutí nádoru. (A)
PĚNA-LPO. LLP byl studován pomocí fluorescenční sondy FOAMLPO. FOAM-LPO byl syntetizován, jak bylo popsáno dříve (26). Buňky byly kultivovány na 8jamkovém μSlide (ibid, 80807) a ošetřeny inhibitory as DC661 nebo bez něj. Buňky byly inkubovány s médiem obsahujícím FOAM-LPO (1 M) v atmosféře 5 % C02 a 95 % vzduchu po dobu 5 minut při 37 stupních. Buňky byly dvakrát promyty médiem a poté byly buňky pozorovány pod mikroskopem (invertovaný mikroskop Zeiss Axio Observer 7), aby se detekoval posun fluorescence z 586 na 512 nm v reakci na LLP. qRT-PCR a primery. Buňky A375P (3 x 105) byly kultivovány v 60 mm miskách a byly ošetřeny DMSO nebo DC661 (3 uM) po dobu 24 hodin. Celková RNA byla izolována pomocí soupravy pro izolaci RNA (QIAGEN, 74134) podle protokolu výrobce. cDNA byla syntetizována pomocí soupravy iScript Reverse Transscriptase kit s 500 ng purifikované RNA podle protokolu výrobce (Thermo Scientific, K1642). Reakce qPCR byla nastavena pomocí SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) obsahující 1 μl cDNA. Všechna měření byla provedena trojmo a BACTIN byl použit jako vnitřní standard pro výpočty ACT. Analýza genové exprese byla provedena pomocí následujících primerů: PTGS2/COX-2 vpřed (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 zpětně (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS vpřed (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARSG vpřed (GACCAGGACTG1) (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 vzad (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN vpřed (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) a BACTIN vzad (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).
transfekce siRNA. Genetické knockdown studie pro lidské ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 a MFSD12 byly provedeny na buněčných liniích A375P. Studie genetické inhibice pro myší Ppt1 a Calreticulin byly provedeny v buňkách MC38. Necílová siRNA (sc{{1{152}}}}), lidská ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), myš Ppt1/Cln1 (sc-142398) a Calreticulin /Calregulin (sc{29}}) siRNA byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology. Tyto siRNA se skládají ze skupin 3–5 cílově specifických siRNA. Průtoková cytometrie. Indukce ferroptózy byla měřena pomocí C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Buňky A375P byly nasazeny na 6-jamkovou destičku a ošetřeny DMSO, ferrostatinem{{40}} (10 μM), rtovým roxstatinem-1 (2 μM), elastinem (5 μM ), DC661 (3 μM), nebo kombinaci po dobu 24 hodin. Buňky byly sklizeny centrifugací při 300 g po dobu 5 minut. Buňky byly resuspendovány v 500 ul 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) obsahujícím 1 μM C11-BODIPY a inkubovány při 37 stupních po dobu 15 minut. Buňky byly peletovány a resuspendovány v 500 ul 1X HBSS a intenzita fluorescence byla měřena na cytometru BD LSRII s použitím 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Kvantifikace exprese kalretikulinu na buněčném povrchu pro imunogenní buněčnou smrt byla provedena, jak bylo popsáno dříve (45) průtokovou cytometrií. Buňky B16F10 nebo MC38 byly kultivovány a ošetřeny NAC (10 mM) nebo DC661 (3 uM) po dobu 24 hodin. Buňky MC38 byly ošetřeny siPpt1 nebo siNT po dobu 48 hodin v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10 mM NAC po dobu 24 hodin. Buňky byly obarveny protilátkou CALR (Cell Signaling Technology, 12238), druhou kozí anti-králičí protilátkou Alexa Fluor 647 (Invitrogen) a propidium jodidem (PI) (Biolegend, 421301). Obarvené vzorky byly získány na průtokovém cytometru BD LSRII s použitím 710/50 Blue a 670/30 Red pro zachycení fluorescence PI a CALR (zařízení University of Pennsylvania Flow Core) a analýza byla omezena na CALR-pozitivní a PI-negativní buňky. aby se zabránilo falešně pozitivním událostem. Priming T buněk a procento cytotoxicity. Nádorové buňky B16 nebo MC38 (5 x 104) byly kultivovány a ošetřeny NAC (10 mM) nebo DC661 (1 uM nebo 3 uM) po dobu 24 hodin. Pro genetickou inhibici Calr byly buňky MC38 ošetřeny siRNA Calr nebo necílovou siRNA (siNT) po dobu 48 hodin, poté následovalo ošetření buď DMSO nebo 3 uM DC661 po dobu 24 hodin. Splenocyty byly poté kultivovány s DC661 s nebo bez B16 nebo MC38 buněk v přítomnosti IL{102}} (5 IU/ml) a kokultivovány po dobu 72 hodin. Aktivace byla potvrzena IFN-ELISA (Biolegend, 430815) supernatantu. Primované splenocyty byly poté společně kultivovány s čerstvě kultivovanými buňkami B16 nebo MC38 s poměry cíl-efektor (B16 nebo MC38 ke splenocytům) 1:20 a 1:50 pro buňky B16 a MC38, v daném pořadí. Uvolňování LDH spojené se smrtí buněk B16 nebo MC38 a poté procento cytotoxicity bylo měřeno podle protokolu výrobce (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Protinádorové vakcinační testy a studie chemoterapie se zavedenými modely rakoviny. Šest až osm týdnů staré samice myší WT C57BL/6, myši NOD/SCID a BALB/c byly získány z The Jackson Laboratory. Pro protinádorové vakcinační experimenty byly buňky WT B16F10, MC38 a CT26 ošetřeny DC661 (3 uM) po dobu 36 hodin v 175 cm2 baňkách. Poté byly supernatanty a oddělené buňky shromážděny v 50ml zkumavce Falcon. Buňky byly odstředěny a promyty ledově chladným PBS. Pro vakcinaci bylo 150 ul buněčné suspenze injikováno sc do levého boku imunokompetentních myší C57BL/6, imunodeficientních NOD/SCID myší (1,8 x 104 buněk B16F10, 1,5 x 106 buněk MC38 na myš) nebo syngenních myší BALB/c (3. × 106 buněk CT26 na myš). Zmražené a rozmražené buňky resuspendované v PBS byly injikovány jako negativní kontrola. O týden později byly do pravého boku injikovány živé rakovinné buňky stejného typu (3 × 104 buněk B16F10, 2 × 105 buněk MC38 nebo 5 × 105 buněk CT26 na myš) se stejným objemem Matrigelu (Corning, 354248). očkovaných myší. Nádory byly měřeny pomocí elektronického posuvného měřítka a objem byl vypočten jako L × W2 × 0,5. Nádorový růst byl pravidelně sledován po následující dny a nepřítomnost nádorů byla považována za indikaci účinné protinádorové vakcinace. Vakcinační studie DC661-MC38 byly opakovány u NOD/SCID myší. Statistika. Statistická významnost byla stanovena pomocí Studentova nepárového, 2-tailed t-testu při porovnání 2 skupin. Když byly porovnány více než 2 skupiny, byl použit 1-test ANOVA. Nulová hypotéza byla významně zamítnuta, pokud hodnota P byla menší než 0,05. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Schválení studie. Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny v souladu s protokoly schválenými Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Pennsylvania.
Čínská bylina cistanche rostlina-Protinádorová
Reference
1. Zeh HJ a kol. Randomizovaná předoperační studie fáze II inhibice autofagie s vysokými dávkami hydroxychlorochinu a gemcitabinu/Nab-paclitaxelu u pacientů s rakovinou pankreatu. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.
2. Rebecca VW a kol. PPT1 podporuje růst nádorů a je molekulárním cílem derivátů chlorochinu u rakoviny. Cancer Discov. 2019;9(2):220–229.
3. Brun S, a kol. GNS561, nový inhibitor autofagie aktivní proti rakovinným kmenovým buňkám u hepatocelulárního karcinomu a jaterních metastáz z kolorektálního karcinomu. J Rakovina. 2021;12(18):5432–5438.
4. Brun S, a kol. GNS561, inhibitor PPT1 v klinickém stádiu, je účinný proti hepatocelulárnímu karcinomu prostřednictvím modulace lysozomálních funkcí. Autofagie. 2022;18(3):678–694.
5. Oberle C, a kol. Permeabilizace lysozomální membrány a uvolňování katepsinu je Bax/Bak-závislá, zesilující událost apoptózy ve fibroblastech a monocytech. Cell Death Differ. 2010;17(7):1167–1178.
6. Boya P, Kroemer G. Permeabilizace lysozomální membrány při buněčné smrti. Onkogen. 2008;27(50):6434–6451.
7. Rebecca VW a kol. Jednotný přístup k zacílení degradační a růstové signalizační role lysozomu. Cancer Discov. 2017;7(11):1266–1283.
8. Tang R a kol. Ferroptóza, nekroptóza a pyroptóza v protinádorové imunitě. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.
9. Yamamoto K, a kol. Autofagie podporuje imunitní únik rakoviny pankreatu degradací MHCI. Příroda. 2020;581(7806):100–105.
10. Deng J, a kol. Inhibice ULK1 překonává narušenou prezentaci antigenu a obnovuje protinádorovou imunitu u rakoviny plic mutantu LKB1. Nat Cancer. 2021;2(5):503–514.
11. Lazarou M, a kol. Ubikvitinkináza PINK1 rekrutuje autofagické receptory k indukci mitofágie. Příroda. 2015;524(7565):309–314.
12. Choi YB, a kol. TAX1BP1 omezuje virem indukovanou apoptózu tím, že usnadňuje svěděním zprostředkovanou degradaci mitochondriálního adaptéru MAVS. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.
13. Rikka S, a kol. Bnip3 narušuje mitochondriální bioenergetiku a stimuluje mitochondriální obrat. Cell Death Differ. 2011;18(4):721–731.
14. Leu JI, et al. Mechanistický základ pro poruchu ferroptózy v buňkách exprimujících afrocentrickou S47 variantu p53. Proč Natl Acad Sci USA A. 2019;116(17):8390–8396.
15. Erkes DA, et al. Mutantní inhibitory BRAF a MEK regulují imunitní mikroprostředí nádoru prostřednictvím pyroptózy. Cancer Discov. 2020;10(2):254–269.
16. Serrano-Puebla A, Boya P. Permeabilizace lysozomální membrány při buněčné smrti: nové důkazy a důsledky pro zdraví a nemoci. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.
17. Thirusangu P, a kol. Quinakrinem indukovaná autofagie u rakoviny vaječníků spouští katepsinem-L zprostředkovanou permeabilizaci lysozomální/mitochondriální membrány a buněčnou smrt. Rakovina (Basilej). 2021;13(9):2004.
18. Michallet MC, a kol. Apoptóza závislá na katepsinu spouštěná supraoptimální aktivací T lymfocytů: možný mechanismus tolerance vysokých dávek. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.
19. Mondal A, a kol. Deficit Ppt1-disreguluje lysozomální Ca++ homeostázu, což přispívá k patogenezi u myšího modelu onemocnění CLN1. J Zdědit Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM a kol. Lipidové biomarkery odvozené od fosfolipáz a reaktivních forem kyslíku u zdravých a nemocných lidí a zvířat – zaměření na lysofosfatidylcholin. Přední Physiol. 2021;12:732319.
21. Fu R, a kol. Účinnost N-acetylcysteinu ve fenotypové supresi myších modelů Niemann-Pickovy choroby typu C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.
22. Boz Z a kol. N-acetylcystein zabraňuje oxidačnímu stresu vyvolanému olanzapinem v mHypoA-59 hypotalamických neuronech. Sci Rep. 2020;10(1):19185.
23. Khare S, a kol. ASS1 a ASL potlačují růst karcinomu ledvin z jasných buněk prostřednictvím změněného metabolismu dusíku. Rakovina Metab. 2021; 9(1):40.
24. Gęgotek A, et al. Srovnání ochranného účinku kyseliny askorbové na interakce redoxních a endokanabinoidních systémů in vitro kultivované fibroblasty lidské kůže vystavené UV záření a peroxidu vodíku. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.
25. De Raedt T, a kol. Využití zranitelnosti rakovinných buněk k vývoji kombinované terapie pro nádory vyvolané ras. Cancer Cell. 2011;20(3):400–413.
26. Zhang X, a kol. Monitorování peroxidace lipidů v pěnových buňkách pomocí lysozomově zacílené a poměrové sondy. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.
27. Wei CY, a kol. Analýza založená na bioinformatice odhaluje zvýšený MFSD12 jako klíčový promotor buněčné proliferace a potenciální terapeutický cíl u melanomu. Onkogen. 2019;38(11):1876–1891.
28. Aldini G, a kol. N-Acetylcystein jako antioxidant a činidlo narušující disulfidy: důvody proč. Free Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Lysozomální metabolomika odhaluje regulaci efluxu aminokyselin z lysozomů závislou na V-ATPáze a mTOR. Věda. 2017;358(6364):807–813.
30. Zhou J, et al. Imunogenní buněčná smrt v terapii rakoviny: Současné a vznikající induktory. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, a kol. Inhibice PPT1 zvyšuje protinádorovou aktivitu anti-PD-1 protilátky u melanomu. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.
32. Mehnert JM, et al. BAMM (BRAF autofagie a inhibice MEK u melanomu): studie fáze I/II s dabrafenibem, trametinibem a hydroxychlorochinem u pokročilého BRAFV600-mutovaného melanomu. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. Makroautofagické proteiny kontrolují hladiny MHC I. třídy na dendritických buňkách a formují antivirové odpovědi CD8(+) T buněk. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.
34. Jouandin P, a kol. Mobilizace lysozomálního cysteinu formuje odpověď TORC1 a růst tkáně na hladovění. Věda. 2022;375(6582):eabc4203.
35. Schwalfenberg GK. N-acetylcystein: přehled klinické užitečnosti (starý lék s novými triky). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.
36. Beer LA, et al. Systematický objev sérových biomarkerů mimoděložního těhotenství pomocí profilování 3-D proteinu ve spojení s kvantifikací bez označení. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, a kol. Primárním účinkem na proteom ARID1A-mutovaného ovariálního karcinomu z jasných buněk je downregulace mevalonátové dráhy na post-transkripční úrovni. Mol Cell Proteomics. 2016;15(11):3348–3360.
38. Cox J, Mann M. MaxQuant umožňuje vysokou míru identifikace peptidů, individuální přesnosti hmotnosti v rozsahu ppb a kvantifikaci proteinů v rámci celého proteomu. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.
39. Cox J, et al. Andromeda: vyhledávač peptidů integrovaný do prostředí MaxQuant. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.
40. Cox J, et al. Přesná kvantifikace bez značení v celém proteomu díky zpožděné normalizaci a extrakci maximálního poměru peptidů, nazývané MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.
41. Tyanova S, et al. Výpočetní platforma Perseus pro komplexní analýzu (prote)omických dat. Metody Nat. 2016;13(9):731–740.
42. Tyanova S, Cox J. Perseus: bioinformatická platforma pro integrativní analýzu proteomických dat ve výzkumu rakoviny. Metody Mol Biol. 2018;1711:133–148.
43. Alicea GM, a kol. Změny v metabolismu lipidů starých fibroblastů indukují rezistenci melanomových buněk závislou na věku k cílené léčbě prostřednictvím přenašeče mastných kyselin FATP2. Cancer Discov. 2020;10(9):1282–1295.
44. Ran FA a kol. Genomové inženýrství pomocí systému CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.
45. Liu P a kol. Kvantifikace expozice kalretikulinu spojené s imunogenní buněčnou smrtí. Metody Enzymol. 2020;632:1–13.
