Nedostatek APOL1 v proximálních tubulech normálních lidských ledvin a proteinurických APOL1 transgenních myších ledvin
Mar 15, 2022
další informace:ali.ma@wecistanche.com
Natalya A. Požehnání1, Zhenzhen Wu2, Sethu M. Madhavan3, Jonathan W. Choy4,Michelle Chen4, Myung K. Shin4, Maarten HoekID5, John R. Sedor2,6,7, John F. O'Toole2,6,Leslie A. BruggemanID2,6*
1 Rammelkamp Center for Education and Research, MetroHealth Medical Center, Case Western ReserveUniversity School of Medicine, Cleveland, OH, Spojené státy americké, 2 Department of Inflammation & Imunity, Cleveland Clinic, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Spojené státy americké of America, 3 Department of Medicine, Ohio State University, Columbus, OH, Spojené státy americké, 4 Merck & Company, Inc., Kenilworth, NJ, Spojené státy americké, 5 Maze Therapeutics, SouthSan Francisco, CA, Spojené státy americké , 6 Ústav nefrologie, Cleveland Clinic, Case WesternReserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Spojené státy americké, 7 Department of Physiology & Biophysics, Case Western Reserve University School of Medicine, Cleveland, OH, Spojené státy americké.
Abstraktní
Mechanismus patogeneze spojený s polymorfismy APOL1 a rizikem nediabetického chronického onemocnění ledvin (CKD) není plně objasněn. Dřívější studie minimalizovaly kauzální roli cirkulujícího proteinu APOL1, tedy snahy o pochopeníledvinapatogeneze se zaměřila na APOL1 exprimovaný v renálních buňkách. zledvinabuňky, o kterých bylo hlášeno, že exprimují APOL1, theproximálního tubuluvzory výrazů jsou v publikovaných zprávách nekonzistentní a zda je APOL1 syntetizovánproximálního tubulunebo možná APOL1 protein v krvi je filtrován a reabsorbován proximálním tubulem zůstává nejasný. Za použití proteinových a mRNA in situ metod byl zkoumán vzorec exprese APOL1 v ledvinách u normálních lidských a APOL1 bakteriálních transgenních myší s umělým chromozomem s proteinurií a bez proteinurie. Protein APOL1 a mRNA byly detekovány v podocytech a endoteliálních buňkách, ale ne v tubulárním epitelu. V případě proteinurie se plazmatický protein APOL1 nezdál být filtrován nebo reabsorbovánproximálního tubulu. Souběžné zkoumání komerčních protilátek použitých v předchozích studiích naznačuje, že původní zprávy o APOL1 v proximálních tubulech pravděpodobně odrážejí nespecifitu protilátek. Exprese APOL1 v podocytech a endoteliích by jako taková měla zůstat středem zájmu mechanistických studií v APOL1-zprostředkovanýchledvinanemocí.
Úvod
Polymorfismy v genu APOL1 přispívají významným rizikem pro několik forem nediabetické chronickéledvinaonemocnění (CKD) [1–3]. Toto riziko vyplývá z kombinace recesivní dědičnosti variant alel APOL1 plus expozice environmentálnímu stresoru. Patogenní funkce variant APOL1 a jak interagují s environmentálním stresorem způsobujícím CKD nejsou plně známy. Ačkoli je APOL1 konstitutivně přítomen v oběhu, předchozí studie minimalizovaly kauzální roli cirkulujícího proteinu APOL1 [4–7] a snaha porozumětledvinaPatogeneze se zaměřila na APOL1 exprimovaný v renálních buňkách. Vzor exprese APOL1 v ledvinách zůstává nejasný s publikovanými nesrovnalostmi mezi imunohistochemickými výsledky a výsledky hybridizace mRNA in situ, zejména hojným proteinem APOL1 pozorovaným v epitelu proximálního tubulu [8–10]. Vzhledem k tomu, že APOL1 je hojná krev, není jasné, zda je APOL1 filtrován, zejména v případě proteinurie, která by mohla mít za následek reabsorpci proteinu APOL1proximálního tubulu. Objevení se APOL1 v proximálním tubulu, buď genovou expresí nebo reabsorpcí z filtrátu, by naznačovalo apotenciálně důležitou roliproximálního tubuluv patogenezi CKD související s APOL1-.
APOL1 v oběhu je vázán na 500 kDa částici HDL3, známou jako trypanolytický faktor 1, 1000 kDa komplex IgM chudý na lipidy, známý jako trypanolytický faktor 2, a možná další vysokomolekulární komplexy s nízkou hladinou lipidů spojené s komplementem faktory [7, 11–13]. Proteiny produkované dvěma variantními alelami APOL1 asociovanými s CKD, G1 a G2, vážou vysokomolekulární trypanolytické faktory podobně jako běžná alela G0 [14]. Ačkoli je protein APOL1 (42,5 kDa) dostatečně malý, aby prošel limitem omezení velikosti bariéry glomerulární filtrace, není známo, že by cirkuloval nezávisle na těchto komplexech s vysokou molekulovou hmotností [15]. Lipoproteiny a další složky HDL však lze filtrovat [16] a v případě proteinurie se mohou infiltrovat proteiny s větší molekulovou hmotností, které jsou normálně omezeny filtrační bariérou. Není jasné, zda lze při proteinurii filtrovat komplexy obsahující APOL1 nebo APOL1-.
K vyřešení těchto problémů jsme zkoumali expresi genu APOL1 i proteinu u člověkaledvinatkáně a ledvin z humanizovaných transgenních myších modelů, které znovu vytvářejí expresi přirozeného lidského APOL1. Pro tyto studie jsme ověřili specifitu komerčních anti-APOL1 protilátek, která mohla přispět k předchozím nesrovnalostem ve vzorcích exprese ledvin. Kromě toho byly vytvořeny modely transgenních myší APOL1proteinurickýkřížením s modelem nefropatie spojené s HIV (HIVAN), CKD silně spojené s nosičstvím rizikových alel APOL1, aby se určilo, zda by proteinurie změnila vzhled proteinu APOL1 v tubulárním epitelu.
Klikněte na organickéCistanche pro chronické onemocnění ledvin
Materiály a metody
Lidské tkáně a myší modely
Člověk fixovaný ve formalínu, zalitý v parafínuledvina(n {{0}}) a jaterní (n=3) tkáň z normálních okrajů resekcí rakoviny byla získána z biorepozitáře Cleveland Clinic Lerner Research Institute. Již dříve byly popsány tři transgenní myší linie exprimující 47 kb lidský genomový fragment v bakteriálním umělém chromozomu (BAC) zahrnujícím promotor a kódující oblasti lidského genu APOL1 pro každou alelu G0, G1 nebo G2 [17, 18]. Každá z transgenních linií BAC-APOL1 byla �10 generací zpětně křížena s FVB/Nj, genetickým pozadím citlivým na HIVAN. Myší HIVAN modelovaný k vyvolání proteinurie byl kongenní Tg26 HIVAN4 [19], který rozvíjí proteinurii a progresivní fokální segmentální glomerulosklerózu jako rodičovský model Tg26 (Jackson Laboratory #22354), ale progrese onemocnění je pomalejší. Ve všech studiích bylo onemocnění ledvin monitorováno každý týden po odstavení pomocí měření proteinurie (tj. množství bílkovin ve spontánně vyloučené moči) analýzou moči pomocí diagnostických proužků (Uristix, Siemens Healthcare). Humánní koncový bod pro onemocnění ledvin schválený IACUC v tomto modelu byla proteinurie dosahující 4 plus na měrce. Žádné zvíře nedosáhlo tohoto humánního koncového bodu před předem stanoveným koncovým bodem studie, protože tato studie vyžadovala počáteční stadium renální dysfunkce (proteinurie na měrce 2 plus až 3 plus) jako funkčníledvinystále ještě schopné filtrace a reabsorpce. Všechna zvířata si udržovala normální hmotnost a vykazovala typické úrovně péče a aktivity a během studie netrpěla bolestí ani úzkostí. Všechna zvířata byla dvakrát týdně sledována veterinárními techniky, kteří nebyli spojeni s touto studií, z hlediska celkového zdraví a pohody a žádná zvířata nevyžadovala analgetika nebo jinou podpůrnou péči. Každá linie transgenních myší BAC-APOL1 byla křížena s myším modelem HIVAN4 a byla usmrcena v 8. 10 týdne věku, kdy jejich onemocnění ledvin progredovalo na hladinu proteinurie 2 plus pomocí proužku moči (G0 n=15, G1 n=11, G2 n=9). Terminální odběry moči, krve a tkáně byly provedeny v hluboké isofluranové anestezii, po které následovala bezprostředně (ještě v anestezii) eutanazie s použitím cervikální dislokace. Albuminurie byla hodnocena elektroforézou na polyakrylamidovém gelu 1 ul moči s následným barvením Coomassie. Použití lidské tkáně bylo přezkoumáno a schváleno Cleveland Clinic IRB (IRB-06-050). Bylo upuštěno od informovaného souhlasu, protože tkáň byla považována za vyřazenou a byly shromážděny neidentifikovatelné údaje. Všechny studie na zvířatech byly přezkoumány a schváleny výbory Institutional Animal Care and Use Committees na Cleveland Clinic a Case Western ReserveUniversity (IACUC-2430).
Tkáňová imunofluorescence
Fixováno ve formalínu, zalité v parafínuledvinatkáňové řezy byly podrobeny získání antigenu, jak bylo popsáno dříve [8]. Protilátky použité ke zkoumání exprese APOL1 v tomto článku byly králičí anti-lidské APOL1 (Sigma, HPA018885, šarže E105260, ředění 1:400). Kromě jiných komerčních monoklonálních protilátek byly také hodnoceny četné šarže této králičí polyklonální protilátky Sigma a výsledky jsou shrnuty v doplňkové tabulce 1A 1C a doplňkovém obrázku 1 v datech S1. Je třeba poznamenat, že mnoho z těchto šarží polyklonálních protilátek bylo vyčerpáno a od Sigmy již nejsou dostupné. Mezi další primární protilátky patří králičí anti-myší APOA1 (ThermoFisher, ředění 1:500), kozí anti-myší CD31 (R&D Systems, ředění 1:200), morčecí anti-nefrin (USB, 1:200) a myší anti GLEPP1 ( dar Rogera Wigginse, 1:50). Ke značení byl použit lektin Lotus tetragonolobus značený FITC (VectorLabs).proximálního tubulubuňky, jak bylo popsáno dříve [8]. Pro testování komerčních protilátek proti lidskému APOL1 byly ledvinové tkáně fixovány za použití různých metod a zalité do parafínu pro imunohistochemii za použití různých metod získávání antigenu. Podrobnosti pro každou z těchto metod zpracování jsou uvedeny v Doplňkových podrobných metodách v S1 Data.
Exprese genu a proteinu APOL1
Plazmatická koncentrace proteinu APOL1 byla stanovena pomocí elektrochemiluminiscenčního imunotestu Meso Scale Discovery, jak bylo popsáno dříve [5]. Koncentrace byla stanovena ve vztahu ke známému roztoku lidského lipoproteinu s vysokou hustotou kalibrovaného kapalinovou chromatografií-hmotnostní spektrometrií. Hladiny proteinů APOL1 a APOA1 v séru byly porovnány pomocí Western blottingu, jak bylo popsáno dříve [20].
hybridizace mRNA in situ
Exprese genu APOL1 byla zkoumána u myší a lidíledvinaa jaterní tkáň využívající hybridizaci mRNA in situ. Manuální hybridizační souprava RNAScope in situ (ACDBio) byla použita pro tkáň fixovanou ve formalínu a zalitou v parafínu podle pokynů soupravy pro detekci buď s jednou sondou, nebo s duální sondou. Sondy zahrnovaly lidský APOL1 (katalogové číslo 439871), myší nefrin (Nphs1, katalogové číslo 433571) a myší CD31 (Pecam1, katalogové číslo 316721). Předběžné úpravy byly 15 minut vaření a 30-minutové štěpení proteázou. In situhybridizační signál se objeví jako tečky; jedna tečka na deset buněk je očekávané pozadí.
Výsledek
Několik komerčních protilátek proti lidskému APOL1 (doplňková tabulka 1A v datech S1) bylo zkoumáno na specificitu k lidskému APOL1 pomocí tkáňových nebo proteinových extraktů z člověka a myši.ledvinya buňky. Protože myši nemají ortolog lidského APOL1, myší buňky a tkáně by neměly být imunoreaktivní vůči protilátkám proti lidskému APOL1. Při Western blotu byla většina komerčních monoklonálních a polyklonálních protilátek schopna detekovat APOL1, i když několik slabě detekovaných APOL1 se silnější detekcí nespecifických proteinů (pruhy gelů, které se neshodovaly s molekulovou hmotností APOL1, doplňková tabulka 1B v datech S1). Většina protilátek detekovala další nespecifické proteiny, které se lišily v závislosti na zdroji proteinových extraktů (doplňková tabulka 1B v datech S1). Některé z těchto nespecifických gelových pásů by mohly být eliminovány předúpravou proteinových extraktů deglykosylačními enzymy (nejsou zobrazeny), což naznačuje, že rozpoznání epitopu bylo závislé na glykanech. Při imunohistochemickém testování byla ledvina myši divokého typu použitá jako negativní kontrola porovnána s ledvinou transgenní myši APOL1 (doplňková tabulka 1C v datech S1). Mnoho protilátek proti APOL1 chybně detekovalo proteiny u myší divokého typuledvinyvčetně velmi silného imunobarvení v tubulech (doplňkový obrázek 1 v datech S1). Na základě těchto validačních studií jsme vybrali šarži polyklonálních protilátek Sigma s omezenou detekcí mimo cíl, abychom prozkoumali vzorce exprese APOL1.
V lidskémledvinyProtein APOL1 byl detekován imunofluorescencí v glomerulích, ale ne tubulech (obr. 1A). Podobné vzorce exprese v lidských ledvinách byly pozorovány za použití hybridizace mRNA in situ. APOL1 mRNA byla přítomna v glomerulech, peritubulárních kapilárách a větších cévách ledviny, ale ne v žádném segmentu tubulů (obr. 1B). Předchozí studie u příjemců transplantátu lidských jater prokázala, že cirkulující protein APOL1 je z velké části produkován játry [21]. V lidských játrech byly vzorce exprese proteinu APOL1 a mRNA podobné, s expresí detekovanou v hepatocytech a vaskulárním endotelu. U myší byla exprese APOL1 kvalitativně nižší v hepatocytech zóny 1 a 2 ve srovnání s hepatocyty zóny 3, zatímco u lidí měly hepatocyty ve všech třech zónách podobnou úroveň exprese (doplňkový obrázek 2 v datech S1). Myší jaterní tkáně byly od zdravých dospělých, zatímco lidské jaterní tkáně byly normální okraje z resekcí rakoviny, které měly také histopatologický důkaz steatózy, což potenciálně přispívalo k tomuto rozdílu.
Příznaky selhání ledvin Cistanche
Pozorovaný vzor exprese v lidské tkáni byl potvrzen u tří transgenních myších linií exprimujících lidský BAC zahrnující celou genomickou oblast APOL1 buď pro alely G0, G1 nebo G2 [17, 18]. Protein APOL1 byl hojný v podocytech a byl také přítomen v endoteliálních buňkách glomerulárních kapilár, peritubulárních kapilár a endotelu větších cév (obr. 2A). Nebyl detekován žádný protein APOL1proximálního tubulunebo jakýkoli jiný tubulární segment (obr. 2B). Také podobně jako u lidí měly BAC-APOL1 transgenní myši hojný APOL1 v krvi (obr. 3) a exprimovaly APOL1 protein a mRNA v jaterních hepatocytech (doplňkový obrázek 2 v S1 datech). VledvinaTento cirkulující protein APOL1 by také mohl být detekován v krvi zachycené ve vaskulárních prostorech (obr. 2B). Nebyl žádný rozdíl ve vzorcích exprese APOL1 mezi myšmi exprimujícími APOL1-G0, -G1 nebo -G2 (obr. 2B) a je v souladu s předchozími studiemi na lidských biopsiích od pacientů s různými APOL1 genotypy[8, 10, 22]. Vzory exprese proteinu APOL1 byly také potvrzeny použitím mRNA v situhybridizaci (obr. 4). Byly zkoumány všechny tři genotypy APOL1, ale nebyly zjištěny žádné rozdíly na základě genotypu APOL1. V souladu s člověkemledvina(Obr. 1), APOL1 byl exprimován v podocytech (typ buněk potvrzen ekoznačením pomocí Nphs1) a vaskulární endoteliální (typ buněk potvrzený ekoznačením pomocí Pecam1), včetně glomerulárních kapilár, peritubulárních kapilár a větších cév. Exprese APOL1 nebyla detekována vproximální tubulynebo jakýkoli jiný trubkový segment.
Obr. 1. Exprese proteinu APOL1 a mRNA u člověkaledvina. A. Exprese proteinu APOL1 imunofluorescenční mikroskopií s použitím validovaných protilátek anti-APOL1, se společným imunobarvením s GLEPP1 k identifikaci podocytů a DAPI jako jaderného barviva. B. Exprese APOL1 mRNA hybridizací in situ. Exprese byla zřejmá v podocytech ("P") a vaskulárním endotelu glomerulárních kapilár ("E"), peritubulárních kapilárách ("1", šipky) a epiteliích větších cév ("2"), ale ne tubulárních epitelech. Měřítko=40μm
Cistanche-ledvina
U žádné z myší BAC-APOL1 se spontánně nerozvinula proteinurie, což je v souladu s původním popisem těchto myších modelů [17, 18], ale vyvinula se u nich silná proteinurie při křížení s modelem nefropatie spojené s HIV (obr. 5). Pomocí imunofluorescence bylo pozorováno imunobarvení nespecifickou anti-APOL1 protilátkou u myší divokého typu a HIVANledvinyvětšinou v kapsli Bowman (obr. 6A). U křížených myší s proteinurií byl protein APOL1 evidentní v glomerulech, ale žádný protein APOL1 nebyl detekován infiltrátem nebo uvnitřproximální tubuly(Obr. 6B). Westernovým přenosem nemohl být APOL1 detekován ve vyloučené moči proteinurických myší (data nejsou uvedena). Nebyl také žádný rozdíl ve vzoru exprese APOL1 meziproteinurickýMyši exprimující APOL{{0}}G0, -G1 nebo -G2. Tyto stejné myší ledviny byly imunobarveny na APOA1 a apolipoprotein, který je filtrován, jako pozitivní kontrola pro vaskulární distribuci aproximálního tubulureabsorpční vzorce. Podobně jako APOL1 byl APOA1 v plazmě snadno detekován v glomerulárních kapilárách. Protože je však APOA1 filtrován, byl také přítomen v kapičkách reabsorpce proteinů na kartáčkovém lemu proximálního tubulu (obr. 6C). V případě proteinurie se zvýšil počet a velikost kapiček APOA1-obsahujících reabsorpciproximálního tubuluokraj kartáče. Asimilární vzor v proximálním tubulu nebyl u APOL1 pozorován.
Obr. 2. Exprese proteinu APOL1 u BAC-APOL1 transgenní myšiledviny. A. Imunofluorescenční barvení na APOL1, nefrin (k identifikaci podocytů) a CD31 (k identifikaci endoteliálních buněk) v ledvinách transgenní myši BAC-APOL1 (je zobrazena myš G1). B. Porovnání vzorů exprese APOL1 ve všech třech transgenních liniích APOL1.Proximální tubulybyly identifikovány značením fluorescenčním lektinem Lotus tetragonolobus (LT). APOL1 byl přítomen ve vaskulárním endotelu (šipky), v podocytech (šipky) a zachycen ve vaskulárních prostorech (�), ale ne v tubulárním epitelu. Měřítko=40μm
Obr. 3. Protein APOL1 v oběhu v modelech transgenních myší BAC-APOL1. Hladiny proteinu APOL1 v plazmě byly měřeny imunotestem u transgenních myší ve srovnání se sourozenci divokého typu (WT) stejného věku (WT,n=10; G0, n=6; G1, n { {11}}; G2, n=10; všechna zvířata byli samci, přibližně ve věku 21 týdnů). Hladiny exprese APOL1 v každé transgenní linii byly všechny významně odlišné od WT (P<0.0001). data="" are="" mean±sd,="" one="" measurement="" per="" animal,="" with="" significance="" determined="" by="" one-way="">
Diskuse
Protilátková specificita byla uznána jako jeden z nejvýznamnějších problémů ovlivňujících reprodukovatelný výzkum [23]. My a jiní jsme původně uvedli, že je přítomen protein APOL1proximální tubulynormálních a nemocných subjektů [8, 9]. Nicméně naše pokračující práce s jinými anti-APOL1 protilátkami a použitím mRNA in situ hybridizace ukázaly, že APOL1 nebyl exprimován v proximálních tubulech [10]. Zbývající možností je, že krev proteininu APOL1 je filtrována a reabsorbována, což má za následek výskyt proteinu APOL1 v krvi.proximaltubuly. Použitím in situ metod, které se nespoléhají na protilátky, spolu s nově dostupnými lidskými BAC-APOL1 transgenními myšmi, nemohl být v tubulárním epitelu detekován ani APOL1 protein, ani APOL1 mRNA. V případě proteinurie nebyl APOL1 také filtrován. V našich rukou králičí polyklonální protilátka Sigma konzistentně rozpoznává lidský APOL1, ale mnoho rozdílů s rozpoznáváním jiných proteinů. Polyklonální šarže králíka Sigma použitá ve studiích zde nereplikuje silnéproximálního tubulubarvení pozorované u předchozích šarží prodávaných pod stejným katalogovým číslem. I když by monoklonální protilátky eliminovaly variace vlastní výrobním šaržím polyklonálních protilátek, komerční testované monoklonální protilátky měly významnou nespecifitu nebo nízkou citlivost na APOL1. Nedávná zpráva popisující vývoj a validaci velkého počtu monoklonálních protilátek proti lidskému APOL1 také neidentifikovala barvení proximálních tubulů u lidí.ledviny[24].
Důkazy protiproximálního tubuluexprese APOL1 nebo role proximálního tubulu u CKD souvisejících s APOL1-se hromadí z několika dalších skupin. Studie využívající podobné humanizované modely transgenních myší APOL1 vytvořené s fosmidy také nenalezly expresi APOL1 v proximálním tubulu pomocí metod detekce proteinů i mRNA [25]. Použití transgenních modelů s indukovatelnou expresí APOL1, které omezují expresi buď na podocyty nebo tubuly, naleznou proteinurii a renální patologii, pouze když je APOL1 exprimován v podocytech, a ne v tubulu [6]. Jako potvrzující důkaz u lidí několik studií zkoumajících proteom lidské moči [26–30] neidentifikovalo protein APOL1 v moči, což také naznačuje, že APOL1 není filtrován v žádném detekovatelném množství.
Naše studie nevylučují možné uvolnění malých množství APOL1 do primárního filtrátu z podocytů buď sekrecí, nebo pasivním uvolněním, když podocyt zemře a lýzuje. Na rozdíl od APOL1 exprimovaného a secernovaného hepatocyty, hlavní podocyty transkriptinu APOL1 nemají kompletní signální peptid [15] a neexistuje žádný nezvratný důkaz, že podocyty secernují APOL1. Alternativně některé studie pozorovaly, že vysoké hladiny APOL1 vyvolané onemocněním mohou také produkovat vzácné alternativně sestřižené izoformy s různými sekvencemi signálních peptidů, které možná umožňují sekreci [24, 31–33]. Tyto potenciální alternativní zdroje infiltrátu APOL1 by byly pod limity detekce v testech, které jsme my a další výzkumníci použili vledvinatkáně a moči a bylo by nepravděpodobným vysvětlením robustní exprese APOL1 dříve hlášené v proximálních tubulech. Kromě toho není jasné, zda by tato potenciální nízká hladina infiltrátu APOL1 odvozeného z podocytů měla fyziologický význam, vzhledem k tomu, že u lidí nejsou bazální hladiny exprese APOL1 spojeny s CKD. Naše studie také nemohou vyloučit možné rozdíly v expresi APOL1 mezi lidmi a transgenními myšmi BAC-APOL1. Funkce podocytů aproximaltubulyv krevní filtraci a reabsorpci jsou u lidí a myší v zásadě podobné, nicméně existují uznávaná omezení použití myší s ohledem na replikaci lidských glomerulárních onemocnění ledvin [34].
Obr. 4. Exprese mRNA APOL1 v modelech transgenních myší BAC-APOL1. Duplexní mRNA in situ hybridizace pro expresi genu (AD)APOL1 a nefrinu (Nphs1) a expresi (EK) APOL1 a CD31 (Pecam1) k identifikovaným podocytům nebo endoteliálním buňkám. Exprese APOL1 byla detekována v peritubulárních kapilárách (šipky "1"), arteriolách (šipky "2"), glomerulárních kapilárách (šipky "3"), podocytech (šipky "4") a větších (interlobulárních) tepnách ("5") a žíly ("6"), ale neproximální tubuly("PT") nebo jakýkoli jiný trubkový segment. Zobrazené obrázky pocházejí z myší BAC-APOL1-G0 a BAC-APOL1-G1.
Obr. 5. BAC-APOL1 transgenní myší modely vyvinuly podobnou proteinurii, když byly kříženy s HIVANmyším modelem. A. Příklad proteinurie u jednoduchých a duálních transgenních myší hodnocených gelovou elektroforézou moči (barvení Coomassie). Šipka označuje albumin a další proteiny v moči s nízkou molekulovou hmotností (hvězdička) jsou u myší neobvyklým nálezem. B. Western blot myšího séra u stejných jednoduchých a duálních transgenních myší vykazujících udržení vysokých hladin sérového proteinu APOL1 při proteinurii. APOA1 Western blot jako kontrola pro běžný sérový protein, který je volně filtrován. Je ukázán reprezentativní blot; počet vyšetřených zvířat v každé genotypové skupině byl: divoký typ, n=3; HIVAN4, n=6; G0 x HIVAN4, n=6; G1 x HIVAN4, n=3; G2 x HIVAN4,n=4
Zde prezentovaná práce a další publikované studie ukázaly významné podobnosti mezi lidmi [8–10, 24] a transgenními myšími APOL1 expresními vzory [17, 18, 24]. Produkovatelné a konzistentní pozorování z těchto kombinovaných studií je exprese APOL1 v podocytech a v endoteliálních buňkách glomerulárních kapilár, peritubulárních kapilár a větších krevních cév. Kromě toho zde uvedená pozorování nepřímo podporují závěry z předchozích studií [4, 5], že cirkulující protein APOL1 pravděpodobně nepřispěje kledvinapatogenezi onemocnění, protože není zdrojem APOL1 lokalizovaného v ledvinách. Hodnocení příspěvku APOL1 exprimovaného v podocytech a endotelu je logickým cílem budoucích studií zkoumajících mechanismus příspěvku rizikové varianty APOL1 k patogenezi CKD.
Obr. 6. APOL1 se neobjevuje v proximálních tubulech vproteinurickýBAC-APOL1 transgenní myši. A. Kontrolní imunobarvení u netransgenních (divokého typu) a proteinurických myší HIVAN4 na APOL1 spolu s fluorescenční vazbou lektinu Lotustetragonolobus ("LT") k vymezeníproximálního tubuluokraj kartáče. Protože myši divokého typu a myši HIVAN4 nemají APOL1, barvení pozorované v parietálních buňkách (šipky) je artefakt. B. Imunobarvení pro APOL1 inproteinurickýBACtransgenní myši každého genotypu APOL1 (jsou uvedeny reprezentativní obrázky, počet zvířat vyšetřených v každé genotypové skupině byl stejný jako na obr. 5). Obrázky ukazujíproximální tubulyna přechodu s Bowmanovou kapslí. Orámovaná oblast je zvětšena pod každým panelem spolu s izolovanými fluorescenčními kanály zobrazenými černobíle. C. Pozitivní kontrolní imunobarvení na filtrovaný lipoprotein, APOA1 a fluorescenčně značený lektin Lotus tetragonolobus ("LT"). Jsou zobrazeny duální transgenní myš APOL1-G0a APOL1-G0 x HIVAN4 s proteinurií; pod každým příslušným barevným panelem jsou jednotlivé fluorescenční kanály (černé a bílé) v rámečku pro LT lektin nebo APOA1. Bílé šipky označují glomerulární kapiláry obsahující cirkulující protein APOA1 uvnitř kapilárních lumen, červené šipky označují APOA1 v kapičkách reabsorpce proteinů na kartáčkovém okraji proximálních tubulů. Měřítko=40μm.
Podpůrné informace
Údaje S1. Doplňkové obrázky a tabulky. (PDF)
S1 Nezpracované obrázky. Originální, neoříznuté gelové obrázky. (PDF)
Poděkování
Děkujeme Williamu Baldwinovi a Nině Dvorině za pomoc s validačními studiemi protilátek
Autorské příspěvky
Konceptualizace: Sethu M. Madhavan, Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, JohnF. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Kurátor dat: Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Myung K. Shin, Leslie A. Bruggeman. Formální analýza: Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Myung K. Shin ,Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Akvizice financování: John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Vyšetřování: Natalya A. Blessing, Zhenzhen Wu , Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, Leslie A. Bruggeman. Metodologie: Zhenzhen Wu, Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, Michelle Chen, LeslieA. Bruggeman. Administrace projektu: Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A. Bruggeman. Zdroje: Myung K. Shin. Dozor: Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A.Bruggeman. Ověření: Myung K. Shin. Psaní – původní návrh: Natalya A. Blessing, Leslie A. Bruggeman. Psaní – recenze a úpravy: Zhenzhen Wu, Sethu M. Madhavan, Jonathan W. Choy, MichelleChen, Myung K. Shin, Maarten Hoek, John R. Sedor, John F. O'Toole, Leslie A.Bruggeman.
Reference
1. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI a kol. Asociace trypanolytických variant ApoL1 sledvinanemoc u Afroameričanů. Věda. 2010; 329(5993):841–5.https://doi.org/10.1126/science.1193032 PMID: 20647424
2. Genovese G, Tonna SJ, Knob AU, Appel GB, Katz A, Bernhardy AJ, et al. Riziková alela pro fokální segmentální glomerulosklerózu u Afroameričanů se nachází v oblasti obsahující APOL1 a MYH9. Kidney Int. 2010; 78(7):698-704. https://doi.org/10.1038/ki.2010.251 PMID: 20668430
3. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A, et al. Missense mutace v genu APOL1 jsou vysoce spojeny s rizikem onemocnění ledvin v konečném stádiu, které bylo dříve připisováno genu MYH9. Hum Genet. 2010; 128(3):345–50. https://doi.org/10.1007/s00439-010-0861-0 PMID:20635188
4. Bruggeman LA, O'Toole JF, Ross MD, Madhavan SM, Smurzynski M, Wu K a kol. Hladiny apolipoproteinu L1 v plazmě nekorelují s CKD. J. Am. Soc. Nephrol. 2014; 25(3):634–44. https://doi.org/10.1681/ASN.2013070700 PMID: 24231663
5. Kozlitina J, Zhou H, Brown PN, Rohm RJ, Pan Y, Ayanoglu G, et al. Plazmatické hladiny rizikové variantyAPOL1 nesouvisí s onemocněním ledvin v populační kohortě. J. Am. Soc. Nephrol.2016; 27(10):3204–19. https://doi.org/10.1681/ASN.2015101121 PMID: 27005919
6. Beckerman P, Bi-Karchin J, Park AS, Qiu C, Dummer PD, Soomro I, et al. Indukuje transgenní expresi lidských rizikových variant APOL1 v podocytechledvinaonemocnění u myší. Nat. Med. 2017; 23(4):429–38. https://doi.org/10.1038/nm.4287 PMID: 28218918
7. Weckerle A, Snipes JA, Cheng D, Gebre AK, Reisz JA, Mura M, et al. Charakterizace cirkulujících proteinových komplexů APOL1 u Afroameričanů. J Lipid Res. 2016; 57(1):120–30. https://doi.org/10.1194/jlr.M063453 PMID: 26586272
8. Madhavan SM, O'Toole JF, Konieczkowski M, Ganesan S, Bruggeman LA, Sedor JR. Lokalizace APOL1 u normálních ledvin a nediabetických ledvin. J. Am. Soc. Nephrol. 2011; 22(11):2119–28.https://doi.org/10.1681/ASN.2011010069 PMID: 21997392
9. Ma L, Shelness GS, Snipes JA, Mura M, Antinozzi PA, Cheng D, et al. Lokalizace APOL1 proteinu a mRNA u člověkaledvina: neonemocněná tkáň, primární buňky a imortalizované buněčné linie. J. Am.Soc. Nephrol. 2015; 26(2):339–48. https://doi.org/10.1681/ASN.2013091017 PMID: 25012173
10. Madhavan SM, O'Toole JF, Konieczkowski M, Barisoni L, Thomas DB, Ganesan S, et al. Varianty APOL1 mění C-terminální konformační dynamiku a vazbu na SNARE protein VAMP8. JCI Insight.2017; 2(14):e92581. https://doi.org/10.1172/jci.insight.92581 PMID: 28724794
11. Raper J, Fung R, Ghiso J, Nussenzweig V, Tomlinson S. Charakterizace nového trypanozomového lytického faktoru z lidského séra. Imunita proti infekci. 1999; 67 (4): 1910–6. https://doi.org/10.1128/IAI.67.4.{10}}.1999 PMID: 10085035
12. Smith AB, Esko JD, Hajduk SL. Zabíjení trypanozomů lidským proteinem souvisejícím s haptoglobinem. Věda. 1995; 268(5208):284–6. https://doi.org/10.1126/science.7716520 PMID: 7716520
13. Vanhamme L, Paturiaux-Hanocq F, Poelvoorde P, Nolan DP, Lins L, Van Den Abbeele J, et al. Apolipoprotein LI je trypanozomový lytický faktor lidského séra. Příroda. 2003; 422(6927):83–7. https://doi.org/10.1038/nature01461 PMID: 12621437
14. Gutierrez OM, Judd SE, Irvin MR, Zhi D, Limdi N, Palmer ND a kol. Rizikové varianty nefropatie APOL1 jsou spojeny se změněnými profily lipoproteinů s vysokou hustotou u Afroameričanů. Nefrolová dialýza Transplantace. 2016; 31(4):602–8. https://doi.org/10.1093/ndt/gfv229 PMID: 26152403
15. Duchateau PN, Pullinger ČR, Cho MH, Eng C, Kane JP. Genová rodina apolipoproteinu L: tkáňově specifická exprese, sestřih, promotorové oblasti; objev nového genu. J Lipid Res. 2001; 42(4):620–30.PMID: 11290834
16. Yang H, Fogo AB, Kon V. Ledviny: klíčové modulátory hladin a funkce lipoproteinů s vysokou hustotou. CurrOpin Nephrol Hypertens. 2016; 25(3):174–9. https://doi.org/10.1097/MNH.0000000000000217 PMID:27008596
17. Okamoto K, Rausch JW, Wakashin H, Fu Y, Chung JY, Dummer PD, et al. Riziková alela APOL1 RNA přispívá k renální toxicitě aktivací proteinkinázy R. Comm. Biol. 2018; 1:188. https://doi.org/10.1038/s42003-018-0188-2 PMID: 30417125
18. Ryu JH, Ge M, Mescher S, Rosenberg AZ, Descente M, Roshanravan H, et al. Varianty renálního rizika APOL1 podporují akumulaci cholesterolu ve tkáních a kultivovaných makrofázích z transgenních myší APOL1. PLoS One. 2019; 14(4):e0211559. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0211559 PMID:30998685
19. Prakash S, Papeta N, Sterken R, Zheng Z, Thomas RL, Wu Z a kol. Identifikace lokusu náchylnosti k nefropatii HIVAN4. J. Am. Soc. Nephrol. 2011; 22(8):1497-504. https://doi.org/10.1681/ASN.2011020209 PMID: 21784893
20. Bruggeman LA, Wu Z, Luo L, Madhavan SM, Konieczkowski M, Drawz PE a kol. U transgenních modelů APOL1-G0 nebo APOL1-G2 se rozvine preeklampsie, ale neledvinyChoroba. J. Am. Soc. Nephrol. 2016; 27(12):3600–10. https://doi.org/10.1681/ASN.2015111220 PMID: 27026370
21. Shukha K, Mueller JL, Chung RT, Curry MP, Friedman DJ, Pollak MR a kol. Většina ApoL1 je vylučována játry. J. Am. Soc. Nephrol. 2017; 28(4):1079-83. https://doi.org/10.1681/ASN.2016040441 PMID:27932478
22. Sampson MG, Robertson CC, Martini S, Mariani LH, Lemley KV, Gillies CE a kol. Integrativní genomika identifikuje nové asociace s rizikovými genotypy APOL1 u černých NEPTUNOVÝCH subjektů. J. Am. Soc.Nephrol. březen 2016; 27(3):814–23. https://doi.org/10.1681/ASN.2014111131 PMID: 26150607
23. Bradbury A, Pluckthun A. Reprodukovatelnost: Standardizujte protilátky používané ve výzkumu. Příroda. 2015; 518(7537):27–9. https://doi.org/10.1038/518027a PMID: 25652980
24. Scales SJ, Gupta N, De Mazière AM, Posthuma G, Chiu CP, Pierce AA, et al. Apolipoprotein L1-specifické protilátky detekují endogenní APOL1 uvnitř endoplazmatického retikula a na plazmatické membráně podocytů. J. Am. Soc. Nephrol. 2020; 31(9):2044–64. https://doi.org/10.1681/ASN.2019080829 PMID: 32764142
25. Aghajan M, Booten SL, Althage M, Hart CE, Ericsson A, Maxvall I a kol. Léčba antisense oligonukleotidy zlepšuje proteinurii indukovanou IFN-gama u APOL1-transgenních myší. JCI Insight. 2019; 4(12).https://doi.org/10.1172/jci.insight.126124 PMID: 31217349
26. Adachi J, Kumar C, Zhang Y, Olsen JV, Mann M. Lidský močový proteom obsahuje více než 1500 proteinů, včetně velkého podílu membránových proteinů. Genome Biol. 2006; 7(9):R80. HTTPS://doi.org/10.1186/gb-2006-7-9-R80 PMID: 16948836
27. Li QR, Fan XK, Li RX, Dai J, Wu CC, Zhao SL a kol. Komplexní a neprefrakcionační přístup na úrovni proteinů pro lidský močový proteom: fosforylace v moči. Rychlé CommMas Spectrom. 2010; 24(6):823–32. https://doi.org/10.1002/rcm.4441 PMID: 20187088
28. Marimuthu A, O'Meally RN, Chaerkady R, Subbannayya Y, Nanjappa V, Kumar P, et al. Komplexní mapa lidského močového proteomu. J Proteome Res. 2011; 10(6):2734-43. https://doi.org/10.1021/pr2003038 PMID: 21500864
29. Santucci L, Candiano G, Petretto A, Bruschi M, Lavarello C, Inglese E, et al. Od stovek k tisícům: Rozšíření normálního lidského urinomu. Data Brief. 2014; 1:25–8. https://doi.org/10.1016/j.dib.2014.08.006 PMID: 26217681
30. Zhao M, Li M, Yang Y, Guo Z, Sun Y, Shao C a kol. Komplexní analýza a anotace normálního lidského močového proteomu. Vědecké zprávy. 2017; 7(1):3024. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03226-6 PMID: 28596590
31. Cheatham AM, Davis SE, Khatua AK, Popik W. Blokování 5' sestřihového místa exonu 4 morfolinooligomerem spouští změnu izoformy proteinu APOL1. Vědecké zprávy. 2018; 8(1):8739. https://doi.org/10.1038/s41598-018-27104-x PMID: 29880816
32. Khatua AK, Cheatham AM, Kruzel ED, Singhal PC, Skorecki K, Popik W. Exon 4-kódovaná sekvence je hlavním determinantem cytotoxicity apolipoproteinu L1. Am J Physiol Cell Physiol. 2015; 309(1):C22–37. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00384.2014 PMID: 25924622
33. Nichols B, Jog P, Lee JH, Blackler D, Wilmot M, D'Agati V, et al. Dráhy vrozené imunity regulují gen apolipoprotein L1 pro tefropatii.ledvinyInt. 2015; 87(2):332–42. https://doi.org/10.1038/ki.2014.270 PMID: 25100047
34. Pippin JW, Brinkkoetter PT, Cormack-Aboud FC, Durvasula RV, Hauser PV, Kowalewska J, et al. Indukovatelné modely hlodavců získaných onemocnění podocytů. Am J. Physiol Renální Physiol. 2009; 296(2):F213–29. https://doi.org/10.1152/ajprenal.90421.2008 PMID: 18784259
