Aktivace TLR9 indukuje aberantní glykosylaci IgA prostřednictvím cest zprostředkovaných dubnem a IL-6 u nefropatie IgA
Mar 11, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yuko Makita1 , Hitoshi Suzuki1 , Toshiki Kano1 , Akiko Takahata1 , Bruce A. Julian2,3 , Jan Novak3 a Yusuke Suzuki1
KLÍČOVÁ SLOVA: DUBEN; IgA1 s deficitem galaktózy; IgA nefropatie; IL-6; imunitní komplex
IgA1 s nedostatkem galaktózy (Gd-IgA1) hraje zásadní roli ve vývojiIgA nefropatie(IgAN). Patogenní mechanismy ovlivňující produkci Gd-IgA1 však nebyly plně objasněny. Je známo, že aktivace přirozené imunity prostřednictvím Toll-like receptoru 9 (TLR9) je zapojena do produkce Gd-IgA1. Je také známo, že ligand indukující proliferaci (APRIL) a IL-6 zvyšují syntézu Gd-IgA1 v IgAN. S tímto pozadím jsme zkoumali, jak aktivace TLR9 v buňkách sekretujících IgA vede k nadprodukci nefritogenního IgA u ddY myši náchylné k IgAN a v buňkách sekretujících lidský IgA1-. Injekce CpG-oligonukleotidů ligandu TLR9 zvýšila produkci aberantně glykosylovaných imunitních komplexů IgA a IgG-IgA u myší ddY, což zase exacerbovaloporanění ledvin. CpG-oligonukleotidem stimulované myši měly zvýšené hladiny APRIL v séru, které korelovaly s hladinami aberantně glykosylovaných imunitních komplexů IgA a IgG-IgA. in vitro,Aktivace TLR9zvýšil produkci nefritogenního IgA, stejně jako APRIL a IL-6 ve splenocytech myší ddY a v lidských buňkách vylučujících IgA1-. Nicméně, siRNA knock-down APRIL zcela potlačil nadprodukci Gd-IgA1 indukovanou IL-6. Neutralizace IL-6 snížila CpG-oligonukleotidem indukovanou nadprodukci Gd-IgA1. Kromě toho dráhy APRIL a IL{11}} každá nezávisle zprostředkovaly TLR9-indukovanou nadprodukci Gd-IgA1. Aktivace TLR9 tedy zvýšila syntézu aberantně glykosylovaného IgA, což v myším modelu IgAN dále zvýšilo poškození ledvin. APRIL a IL-6 tedy synergicky i nezávisle zvyšují syntézu Gd-IgA1.
Překladové prohlášení
Léčba specifická pro onemocnění zaměřená na IgA1 s deficitem galaktózy může představovat budoucí léčbuIgA nefropatie. Výsledky této studie, která prokázala zapojení ligandu indukujícího proliferaci (APRIL) a interleukinu-6 (IL-6) do nadprodukce aberantně glykosylovaného IgA, podporují zdůvodnění cílení na APRIL a IL{ {3}} u IgA nefropatie (IgAN). Nedávná studie ve skutečnosti prokázala pozitivní účinky monoklonální protilátky anti-APRIL v myším IgAN1 a v současné době probíhá klinická studie s neutralizující protilátkou APRIL u pacientů s IgAN.
IgA nefropatie (IgAN), nejčastější primární glomerulonefritida,2 způsobuje konečné stadium renálního onemocnění u 20 až 40 procent pacientů během 20 let po nástupu tohoto onemocnění. makroskopická hematurie souběžná s infekcí horních cest dýchacích naznačuje, že slizniční imunitní systém hraje důležitou roli v klinických projevech IgAN.4
Cistanchetubulosabráníledvinachoroba, kliknutím sem získáte vzorek
Aberantní glykosylace IgAje centrální v patogenezi IgAN. Glomerulární IgA u pacientů s IgAN je omezena na podtřídu IgA1 a je obohacena o molekuly, které mají některé O-glykany v pantové oblasti deficitní v galaktóze (galaktózově deficitní IgA1 [Gd-IgA1]).5,6 Navíc hladiny Gd v séru – obsahující IgA1 a IgA{11}}imunitní komplexy(IC) s autoprotilátkami specifickými pro Gd-IgA1 jsou u pacientů s IgAN zvýšené.7–9 Mechanismus produkce Gd-IgA1 však stále není zcela objasněn.
V této studii jsme použili myší model ddY náchylný k IgAN. U ddY myší se vyvinou glomerulární poranění napodobující poranění lidí s IgAN.10 Ačkoli myši nemají molekuly IgA s O-glykany typickými pro lidský IgA1, lidský IgAN a tento myší model ddY náchylný k IgAN sdílejí některé rysy specifické pro onemocnění, jako je elevace séra aberantně glykosylovaných IgA a IgG-IgA IC.6,11 Ve skutečnosti aberantní glykosylace IgA v důsledku nedostatku b1,4-galaktosylace N-glykanů indukuje myší IgAN v důsledku zvýšení sérových hladin vysokomolekulárních látek IC obsahující IgA a IgA s následnou depozicí ledvin a glomerulárním poškozením.12 ddY myši vykazují proteinurii a mesangiální proliferativní glomerulonefritidu se společným ukládáním IgA a C3 v glomerulech. Celogenomová asociační studie identifikovala kandidátní lokusy spojené s progresí IgAN u ddY myší.13 Tyto lokusy zahrnují geny funkčně podobné genům spojeným s lidským IgAN.14,15 Tyto nálezy naznačují, že IgAN u ddY myší au lidí může být ovlivněn alespoň částečně stejnými geny náchylnosti. Ačkoli se molekulární rysy myšího IgA a lidského IgA1 liší, aberantně glykosylovaný IgA má tendenci tvořit polymerní IgA a IgG-IgA IC, které následně řídí progresi poškození ledvin u ddY myšího modelu IgAN, stejně jako u lidského IgAN. Model ddY myší má tedy některé společné rysy s lidským IgAN a může být užitečným nástrojem pro analýzu různých patogenetických rysů IgAN.
Toll-like receptory (TLR) jsou klíčové molekuly vrozeného imunitního systému a byly zapojeny do patogeneze IgAN.16–20 Exogenní antigeny odvozené od patogenů aktivují signální dráhu TLR9-MyD88.21 Tento proces vede k významně zvýšila syntézu zánětlivých cytokinů, jako je interferon typu 1 a interleukin-6 (IL-6).22 Nedávno jsme prokázali, že aktivace TLR9 zhoršilaporanění ledvinu ddY myší náchylných k IgAN, se zvýšením sérových hladin IgA a IgG-IgA IC.16 Kromě toho jsou specifické polymorfismy TLR9 spojeny s progresí onemocnění u pacientů s IgAN.16 Sérové hladiny tumor nekrotizujícího faktoru-a a IL{{{{101} 6}} jsou zvýšené u pacientů s IgAN.23 Navíc IL-6 a IL-4 zvyšují produkci IgA1 a zdůrazňují stupeň deficitu galaktózy, čímž zvyšují syntézu Gd-IgA1 pomocí IgA{{13} }vylučování buněčných linií od pacientů s IgAN.24 Tato zjištění naznačují, že IL-6 může být klíčovým mediátorem tohoto procesu.24,25.
Gen superrodiny ligandu tumor nekrotizujícího faktoru 13 (TNFSF13) kóduje ligand indukující proliferaci (APRIL), který je centrálním cytokinem pro zrání a přežití B lymfocytů.26 APRIL sdílí některé signální receptory důležité pro vývoj B lymfocytů s jiným Ligand superrodiny TNF, faktor aktivující B-buňky (BAFF). BAFF se také podílí na afinitním zrání B buněk. Celogenomová asociační studie identifikovala TNFSF13 jako jeden z kandidátních genů asociovaných s IgAN.27 U pacientů s IgAN jsou sérové hladiny APRIL zvýšené28 a hladiny jsou spojeny s renální prognózou.28
Abychom lépe porozuměli základním mechanismům zapojeným do nadprodukce aberantně glykosylovaného IgA prostřednictvím aktivace TLR9 ligandem CpG oligodeoxynukleotidů (ODN), použili jsme ddY myši náchylné k IgAN a lidské buňky sekretující IgA1-.
VÝSLEDEK
Aktivace TLR9 zhoršila poškození ledvin u ddY myší prostřednictvím zvýšené produkce nefritogenního IgA
TLR9 může být aktivován odpovídajícími ligandy, jako je CpG-ODN. K testování účinku aktivace TLR9 na myším modelu IgAN jsme použili injekci ligandu u ddY myší náchylných k IgAN. U myší injikovaných CpG-ODN se rozvinula mesangiální proliferace a expanze extracelulární matrix (obrázek la). Renální histologické skóre založené na mezangiální proliferaci a expanzi mezangiální matrice u myší, kterým byl injikován CpG-ODN, bylo významně vyšší než u kontrolních myší (P < 0.01;="" obrázek="" 1a).="" hladiny="" albuminu="" v="" moči="" u="" myší="" injikovaných="" cpg-odn="" byly="" významně="" zvýšené="" ve="" srovnání="" s="" hladinami="" u="" kontrolních="" myší="" (p="">< 0.{{20}}1;="" obrázek="" 1a).="" pouze="" u="" myší="" injikovaných="" cpg-odn="" se="" vyvinuly="" mezangiální="" depozita="" iga,="" igg="" a="" komplementu="" c3="" (obrázek="" 1b).="" myši="" s="" injekcí="" cpg-odn="" vykazovaly="" významně="" vyšší="" sérové="" hladiny="" iga="" (p="">< 0,01)="" a="" igg="" (p="">< 0,01)="" než="" kontrolní="" myši="" (obrázek="" 1c).="" sérový="" iga="" od="" myší,="" kterým="" byly="" injikovány="" cpg-odn="" myši,="" měl="" nižší="" reaktivitu="" s="" aglutininem-i="" ricinus="" communis="" (rca-i)="" a="" aglutininovými="" lektiny="" sambucus="" nigra="" než="" od="" kontrolních="" myší="" (obrázek="" 1c),="" což="" ukazuje="" na="" nižší="" obsah="" galaktózy="" a="" kyseliny="" sialové="" na="" n="" -glykany="" myšího="" iga.="" kromě="" toho="" byla="" hladina="" igg-iga="" ic="" v="" séru="" u="" myší="" injikovaných="" cpg-odn="" významně="" vyšší="" než="" u="" kontrolních="" myší="" (p="">< 0,05;="" obrázek="" 1c).="" tato="" zjištění="" tomu="">Aktivace TLR9CpG-ODN vedlo k nadprodukci aberantně glykosylovaných IgA a IgG-IgA IC, což vedlo kimunitní komplexukládání a poškození ledvin.
B buňky a dendritické buňky byly zapojeny do odpovědí CpG-ODN
Zkoumali jsme, které typy buněk se podílejí na indukci nadprodukce aberantně glykosylovaného IgA v reakci na CpG-ODN. B buňky a dendritické buňky (DC) byly izolovány ze slezin ddY myší pomocí anti-myší CD19 a CD11c protilátek tříděním buněk aktivovaným FL fluorescencí, v daném pořadí. CpG-ODN stimulace izolovaných B buněk vyvolala nadprodukci IgA. Kromě toho CpG-ODN významně zvýšil produkci IgA, když byly B buňky společně kultivovány s DC (doplňkový obrázek S1). Tyto výsledky naznačují, že CpG-ODN přímo aktivoval B buňky a že DCS dále zvýšil produkci IgA po aktivaci TLR9.
Nadprodukce APRIL zvýšila syntézu aberantně glykosylovaných IgA a IgG-IgA IC
Hodnotili jsme, zda se APRIL a/nebo BAFF podílely na syntéze nefritogenního IgA indukovaného aktivací TLR9. Injekce CpG-ODN myším ddY významně zvýšila sérové hladiny APRIL a BAFF (obrázek 2a). Hladiny exprese APRIL ve splenocytech korelovaly s produkcí aberantně glykosylovaného IgA a tvorbou IgG-IgA IC (obrázek 2b). Hladiny exprese BAFF ve splenocytech korelovaly s produkcí aberantně glykosylovaného IgA, ale ne s tvorbou IgG-IgA IC (obrázek 2b). Kromě toho sérové hladiny APRIL, ale ne BAFF, významně korelovaly se zvýšenými sérovými hladinami aberantně glykosylovaného IgA a IgG-IgA IC u myší s injekcí CpG-ODN (obrázek 2c). Tato zjištění naznačují, že jak APRIL, tak BAFF se mohou podílet na produkci aberantně glykosylovaného IgA, i když APRIL se může více podílet na produkci IgG-IgA IC.
Obrázek 1|CpG-oligodeoxynukleotidem (ODN) stimulací indukovaná produkce nefritogenního IgA. Injekce CpG-ODN zvýšila krevní hladiny aberantně glykosylovaného imunitního komplexu IgA a IgG-IgA (IC) a zhoršila poškození ledvin u myší ddY. (a) ddY myši před vývojemIgA nefropatie(IgAN) byly ip injikovány CpG-ODN třikrát týdně po dobu 12 týdnů. Při histologické analýze glomerulárních lézí myši s injekcí CpG-ODN vykazovaly proliferaci mesangiálních buněk a expanzi extracelulární matrix. Pravý panel ukazuje hodnocení renálních poranění semikvantitativním skórováním. Renální histologická skóre, hodnocená procenty glomerulů s výše uvedenými lézemi, ukázala, že poškození ledvin u myší, kterým byl injikován CpG-ODN, bylo exacerbováno. Hladiny albuminu v moči u myší injikovaných CpG-ODN byly významně zvýšené ve srovnání s hladinami u kontrolních myší. Pruhy ve spodních panelech ¼ střední ± SEM. (b) Imunohistochemická analýza glomerulárních depozit IgA, IgG a C3. Pouze u myší injikovaných CpG-ODN se vyvinuly mezangiální depozita IgA, IgG a C3. (c) Sérové hladiny IgA, IgG a IgG-IgA IC byly významně zvýšeny po léčbě CpG-ODN po dobu 12 týdnů. Sérový IgA u myší injikovaných CpG-ODN vykazoval významně nižší reaktivitu s aglutininem-I Ricinus communis (RCA-I) a lektiny aglutininu Sambucus nigra (SNA) než IgA u kontrolních myší. Tyto výsledky ukazují, že injekce CpG-ODN zvýšila sérové hladiny aberantně glykosylovaného IgA. Jsou zobrazeny jednotlivé body. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01.="" od,="" optická="" hustota.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">
Obrázek 2|Korelace mezi nadprodukcí ligandu indukujícího proliferaci (APRIL) a aberantně glykosylovaným IgA u myší injikovaných CpG-oligodeoxynukleotidem (ODN). (a) Injekce CpG-ODN myším ddY zvýšila sérové hladiny aktivačního faktoru B-buněk (BAFF) a APRIL. (b) Hladiny exprese BAFF v celých splenocytech korelovaly se sníženou reaktivitou s lektinem Ricinus communis aglutinin-I (RCA-I), ale nekorelovaly s tvorbou imunitního komplexu IgG-IgA (IC). Mezitím byly hladiny exprese APRIL spojeny s produkcí aberantně glykosylovaného IgA a tvorbou IgG-IgA IC. (c) U myší s injekcí CpG-ODN byly sérové hladiny APRIL spojeny se sníženou reaktivitou IgA s lektinem RCA-I a zvýšenými hladinami IC IgG-IgA. Sérové hladiny BAFF nekorelovaly s produkcí glykosylovaného IgA a tvorbou IgG-IgA IC. Pruhy ¼ střední - SEM. *P < 0.05.="" od,="" optická="">
IL-6 indukoval produkci aberantně glykosylovaného IgA
Sérové hladiny IL{{0}} u myší injikovaných CpG-ODN byly významně vyšší ve srovnání s kontrolními myšmi (P < 0,05;="" obrázek="" 3a).="" pomocí="" splenocytů="" ddy="" myší="" náchylných="" k="" igan="" jsme="" zkoumali,="" zda="" tlr9-indukovaná="" buněčná="" aktivace="" a="" nadprodukce="" aberantně="" glykosylovaného="" iga="" byly="" zprostředkovány="" il-6.="" stimulace="" cpg-odn="" zvýšila="" produkci="" il-6="" splenocyty="" in="" vitro.="" přidání="" il{10}}="" do="" kultivačního="" média="" splenocytů="" zvýšilo="" produkci="" iga.="" navíc="" il-6="" zvýšil="" syntézu="" aberantně="" glykosylovaného="" iga="" a="" tvorbu="" igg-iga="" ic="" a="" zvýšil="" produkci="" april="" (obrázek="" 3a).="" il-6–neutralizační="" protilátka="" snižovala="" celkový="" iga="" indukovaný="" cpg-odn,="" aberantně="" glykosylovanou="" produkci="" iga="" a="" tvorbu="" igg-iga="" ic="" (obrázek="" 3b).="" tato="" zjištění="" naznačují,="" že="" aktivace="" tlr9="" byla="" zprostředkována,="" alespoň="" částečně,="" il-="" 6.="" kromě="" toho="" se="" na="" produkci="" aberantně="" glykosylovaného="" iga="" může="" podílet="" další="" dráha(y)="" zprostředkovaná="">
cistanchemůže zlepšitledvinafunkce
DUBEN a IL-6 posílily syntézu Gd-IgA1 v lidských buňkách vylučujících IgA1-
Dále jsme testovali, zda jsou APRIL a IL-6 společné hlavním mediátorům, které zvyšují produkci nefritogenního IgA v lidských buňkách vylučujících IgA1-. Suplementace CpG-ODN zvýšila zvýšení IL-6, expresi APRIL, produkci proteinu APRIL a produkci IgA a Gd-IgA1 (obrázek 4a). Stimulace IL-6 a APRIL zvýšila produkci IgA a Gd-IgA1 (obrázek 4b, c). Účinky stimulace CpG-ODN na produkci IgA a Gd-IgA1 byly částečně sníženy IL-6-neutralizujícími protilátkami (obrázek 4d). Kromě toho malý, interferující (si)RNA knockdown APRIL také snížil produkci IgA a Gd-IgA1 indukovanou stimulací IL-6 (obrázek 4b), což ukazuje, že APRIL a IL-6 synergicky podporují tvorbu Gd -IgA1.
DISKUSE
Mesangiální IgA v lidském IgAN je vyloučen z podtřídy IgA1, která vykazuje abnormální O-glykosylaci. 29,30 Lidský IgA1 má pantovou oblast s O-glykany, která chybí v myším IgA.6,31,32 Nicméně aberantní glykosylace N-glykanů se účastní patogeneze myšího modelu IgAN u ddY myší, přičemž zvýšení aberantně glykosylovaného IgA a IC obsahujícího IgA.11,12 Aberantní modifikace sacharidů IgA v O- nebo N-glykanech jsou charakteristické vlastnosti nefritogenních IC obsahujících IgA.
Několik studií prokázalo aktivaci TLR9 v progresi IgAN.17–19 V této studii jsme ukázali, že aktivace TLR9 ip injekcí CpG-ODN u ddY myší zhoršila poškození ledvin doprovázená depozity glomerulárních IgA a IgG, pravděpodobně proto, zvýšených sérových hladin aberantně glykosylovaných IgA a IgG-IgA IC. Navíc jsme ukázali, že aktivace TLR9 se podílela na syntéze Gd-IgA1 v buněčných liniích secernujících lidský IgA1-.
Obrázek 3|Vliv CpG-oligodeoxynukleotidu (ODN) a interleukinu (IL)-6 na kultivované splenocyty ddY myší. (a) Sérové hladiny IL-6 u myší injikovaných CpG-ODN byly významně vyšší ve srovnání s kontrolními myšmi. Stimulace CpG-ODN zvýšila produkci IL-6 splenocytů ddY myší v kultuře. Inkubace splenocytů ddY myší s rekombinantním IL-6 zvýšila produkci celkového IgA a aberantně glykosylovaného IgA, což vedlo k vytvoření imunitního komplexu IgG-IgA (IC). Rekombinantní IL-6 zvýšil nadprodukci ligandu indukujícího proliferaci (APRIL). (b) Splenocyty v kultuře byly stimulovány CpG-ODN v přítomnosti nebo nepřítomnosti IL-6-neutralizační protilátky. Anti–IL-6 protilátka snižovala produkci celkového IgA a aberantně glykosylovaného IgA a následně snižovala tvorbu IgG-IgA IC indukovanou CpG-ODN. Sloupce ¼ průměr ± SEM. * P < 0.05,="" **p="">< 0,01.="" od,="" optická="" hustota;="" pbs,="" fyziologický="" roztok="" pufrovaný="" fosfátem;="" rca-i,="" ricinus="" communis="" aglutinin-i;="" sna,="" sambucus="" nigra="">
Obrázek 4|Účinek suplementace CpG-oligodeoxynukleotidu (ODN) nebo ligandu indukujícího proliferaci (APRIL) na lidské IgA1-secernující buněčné linie na IgA1, IgA1 s deficitem galaktózy (Gd-IgA1) a interleukin (IL){{ 9}} produkce. (a) Suplementace CpG-ODN zvýšila produkci IL-6. CpG-ODN zvýšil genovou expresi APRIL. Analýza Western blot prokázala, že CpG-ODN zvyšuje hladiny proteinu APRIL. Výsledky byly vyhodnoceny denzitometricky. Stimulace pomocí CpG-ODN indukovala produkci IgA a Gd-IgA1. (b) Knockdown malé interferující RNA (siRNA) v dubnu snížil nadprodukci IgA a Gd-IgA1 vyvolanou IL-6. (c) IgA{{2{{30}}}}buňky produkující IgA stimulované rekombinantním APRIL produkovaly více IgA a Gd-IgA1. (d) Buňky vylučující IgA{23}} byly inkubovány s anti-IL{24}} protilátkou po stimulaci CpG-ODN. Zvýšená produkce IgA a Gd-IgA1 indukovaná CpG-ODN byla snížena anti-IL-6 protilátkou a siRNA knockdownem APRIL. Sloupce ¼ průměr ± SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01.="" gadph,="" glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza;="" pbs,="" fyziologický="" roztok="" pufrovaný="">
Hodnotili jsme mechanismus, kterým aktivace TLR9 zprostředkovávala zvýšenou produkci aberantně glykosylovaného IgA. BAFF a APRIL jsou známé svou rolí v přežití a diferenciaci B-buněk. McCarthy et al.33 prokázali, že u transgenních myší s nadměrnou expresí BAFF se vyvíjejí mezangiální depozita IgA s poškozením ledvin a močovými abnormalitami.33 Nedávno jsme prokázali, že genová exprese APRIL je zvýšená v tonzilárních germinálních centrech pacientů s IgAN. Nadměrná exprese APRIL v tonzilových germinálních centrech navíc korelovala se sérovými hladinami Gd-IgA1 a závažností onemocnění u pacientů s IgAN.34 Tato zjištění naznačují, že BAFF i APRIL se mohou podílet na patogenezi IgAN. Nicméně souvislost mezi BAFF/APRIL a aktivací TLR9 je nejasná. V této studii aktivace TLR9 zvýšila genovou expresi a sérové hladiny APRIL. Sérové hladiny aberantně glykosylovaného IgA korelovaly s hladinami exprese BAFF a APRIL ve splenocytech. Sérové hladiny IgG-IgA IC však korelovaly s hladinami exprese APRIL, ale ne BAFF. Kromě toho byly hladiny APRIL v séru spojeny s nadprodukcí aberantně glykosylovaných IgA a IgG-IgA IC u myší aktivovaných TLR9-. V buňkách vylučujících IgA1-aktivace TLR9 také indukovala nadprodukci Gd-IgA1 prostřednictvím APRIL. Tyto výsledky naznačují, že APRIL hraje důležitou roli v TLR{18}}indukované nadprodukci nefritogenního IgA a tvorbě IgG-IgA IC.
Měla by být objasněna odezva podle typu buněk pro určení role B a T buněk a DC. V této studii jsme hodnotili úlohu B buněk a plazmocytoidních DC. TLR9 je exprimován DC, B buňkami a makrofágy, ale ne T buňkami.35–37 Příspěvek BAFF/APRIL k protilátkové odpovědi nezávislé na T buňkách je znám.38,39 Zde jsme testovali, zda aktivace TLR9 může zvýšit syntézu aberantně glykosylovaný IgA a tvorba IgG-IgA IC prostřednictvím APRIL způsobem nezávislým na T buňkách. Použili jsme také klonované buněčné linie vylučující lidský IgA1- a ukázali jsme, že aktivace TLR9 zvýšila produkci Gd-IgA1 prostřednictvím APRIL a IL-6, což naznačuje, že proces je nezávislý na T buňkách. Dále jsme hodnotili role B buněk a DC. Ukázali jsme, že CpG-ODN specifické pro B buňky a DC zvýšily produkci aberantně glykosylovaného IgA v celých splenocytech. Dále jsme zkoumali, zda stimulace CpG-ODN in vitro může zvýšit produkci IgA. CpG-ODN stimulace izolovaných B buněk vyvolala nadprodukci IgA. Kromě toho CpG-ODN významně zvýšil produkci IgA, když byly B buňky kokultivovány s DC (doplňkový obrázek S1). Tyto výsledky naznačují, že aktivace CpG-ODN vede k většímuProdukce IgA a aberantní glykosylaceje zprostředkován TLR9 způsobem nezávislým na T buňkách.
Je známo, že IL-6 zvýrazňuje proliferaci buněk produkujících imunoglobulin a terminální diferenciaci plazmatických buněk.40–42 Kromě toho může být IL-6 také primárním kandidátem na cytokin pro diferenciaci T folikulárních pomocných buněk .43,44 T folikulární pomocné buňky jsou nezbytné pro dozrávání afinity B-buněk, rekombinaci změn tříd a vytváření paměťových B-buněk a plazmatických buněk v germinálním centru.43,44 V modelu myší s lupusem IL-6 nedostatek zabránil diferenciaci T folikulárních pomocných buněk a expanzi B-buněk v germinálním centru, což mělo za následek sníženou produkci autoprotilátek.45 Tato studie objasnila, že aktivace TLR9 pomocí CpG-ODN zvýšila produkci IL-6 ve splenocytech myšího IgAN. IL-6 indukoval nadprodukci aberantně glykosylovaného IgA a IgG-IgA IC v myším modelu IgAN. V lidských buňkách vylučujících IgA1- jsme potvrdili, že IL-6 zvyšuje produkci Gd-IgA1.24 Naše zjištění naznačují, že IL-6 může být jednou z hlavních molekul vyvolávajících nadprodukci nefritogenního IgA zprostředkované aktivací TLR9.
APRIL hraje důležitou roli při přepínání třídy IgA a diferenciaci plazmocytoidů.46,47 IL-6 podporuje terminální diferenciaci B buněk na plazmatické buňky sekretující IgA.41,42 Tato studie prokázala, že IL{{7} } stimulace indukovala produkci APRIL. Poté jsme předpokládali, že existuje souvislost mezi APRIL a IL-6 zprostředkovaná aktivací TLR9, která indukuje produkci aberantně glykosylovaného IgA. Zjistili jsme, že IL-6–neutralizující protilátka zcela neblokovala CpG-ODN-indukovanou nadprodukci Gd-IgA1 a že knockdown siRNA APRIL snížil nadprodukci Gd-IgA1 indukovanou IL-6. Tato data naznačují, že APRIL a IL-6 synergicky podporují produkci Gd-IgA1 zprostředkovanou aktivací TLR9. Kromě toho jak IL-6-neutralizující protilátka, tak siRNA knockdown APRIL snížily produkci IgA a Gd-IgA1 více než samotná IL-6-neutralizující protilátka. Aktivační dráha TLR9 tedy zahrnuje synergické účinky IL-6 a APRIL na produkci protilátek a glykosylaci (obrázek 5). Nedávné studie také ukázaly, že IL-6 v kombinaci s APRIL indukuje tvorbu a přežívání plazmatických buněk.48,49 Budoucí studie však vyžadují objasnění mezibuněčných signálních drah mezi APRIL a IL-6 v produkci nefritogenního IgA.
cistancheproledvinainfekce
Závěrem,Aktivace TLR9exacerbované poškození ledvin u myšího modelu IgAN zvýšením produkce aberantně glykosylovaného IgA a tvorby IgG-IgA IC. V tomto procesu nadprodukce APRIL a IL-6 indukovaná aktivací TLR9 zvýšila produkci nefritogenního IgA. Kromě toho tato studie objasnila, že APRIL a IL-6 fungují synergicky, stejně jako nezávisle, při produkci aberantně glykosylovaného IgA. Tato zjištění mohou být základem budoucího vývoje nových terapeutických přístupů pro IgAN.
Obrázek 5|Synergická role mezi Toll-like receptorem 9 (TLR9), ligandem indukujícím proliferaci (APRIL) a interleukinem (IL)-6 v buňkách produkujících IgA u IgA nefropatie (IgAN). Aktivace TLR9 indukovala produkci APRIL a IL-6, což mělo za následek
nadprodukci aberantně glykosylovaného IgA. APRIL a IL-6 fungují synergicky a podporují tvorbu aberantně glykosylovaného IgA. Kromě toho, že APRIL indukuje produkci IL-6, jak již bylo uvedeno, může IL-6 také zlepšit syntézu APRIL. Kromě toho, APRIL a IL-6 nezávisle podporují produkci aberantně glykosylovaného IgA. NF-kB, jaderný faktor-kB.
METODY
Zvířata a experimentální protokoly
ddY myš náchylná k IgAN je známý model spontánního IgAN s variabilním výskytem a rozsahem glomerulárního poškození napodobujícího lidský IgAN.10 ddY myši jsou rozděleny do 3 skupin na základě manifestacepoškození ledvin: myši s časným nebo pozdním nástupem a klidové myši. Onemocnění s časným nástupem u ddY myší se projevuje proteinurií a glomerulárními depozity IgA po 20 týdnech věku.13 Proto jsme použili ddY myši ve věku 18 týdnů k vyhodnocení, zda aktivace TLR9 v tomto modelu zhoršila IgAN. Celkem 30 samic myší ddY (SLC Japan, Shizuoka, Japonsko) bylo chováno ve zvířecím zařízení Juntendo University, Tokio, Japonsko. Myši byly krmeny běžným krmivem (Oriental Yeast Co., Tokio, Japonsko) a vodou ad libitum a byly umístěny ve specifické místnosti bez patogenů. Experimentální protokol byl schválen Etickou kontrolní komisí pro pokusy na zvířatech Lékařské fakulty Juntendo University. Ve věku 6 týdnů byly myši náhodně rozděleny do 2 skupin. Jedna skupina dostávala CpG-ODN injekčně ip 3krát týdně po dobu 12 týdnů; druhé skupině (kontrolní) byla injekčně podána non-CpG-ODN. CpG-ODN a non-CpG-ODN byly chemicky syntetizovány (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Kanagawa, Japonsko). Sekvence ODN jsou TCGTCGTT TTCGGCGCGCGCCG nebo TGCTGCTTTTGGGGGGCCCCCC (50/30) pro CpG nebo non-CpG ODN, v daném pořadí.
Stanovení IgA, IgG, IgG-IgA IC a aberantně glykosylovaného IgA v myším séru
Vzorky krve byly odebrány z bukální žíly. Sérové IgA, IgG a IgG-IgA IC byly měřeny sendvičovým enzymem vázaným imunosorbentním testem (ELISA; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) s použitím modifikované metody založené na naší předchozí zprávě.50 Testy vázající lektin byly slouží k přístupu ke glykoformě IgA. V tomto testu byly použity biotinylovaný RCA-I (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a lektin z kůry Sambucus nigra (Vector Laboratories), které rozpoznávaly galaktózu a kyselinu sialovou připojenou ke galaktóze (převážně v a2,6 vazbě).51 Zředěná séra bylo přidáno 100 ng IgA na jamku. Mikrotitrační destičky potažené 1 mg/ml kozího anti-myšího IgA (100 ml/jamka) pro kvantifikaci sérového IgA byly inkubovány s těmito vzorky a poté byl přidán biotinylovaný aglutinin Sambucus nigra nebo RCA-I. Byl aplikován konjugát avidin-křenová peroxidáza (ExtrAvidin; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Sérové hladiny aberantně glykosylovaného vázaného IgA byly vyjádřeny v jednotkách (1 jednotka jako optická hustota 1,0 měřená při 490 nm). Sérové hladiny APRIL a BAFF byly měřeny pomocí myší APRIL ELISA kitu (MyBioSource, San Diego, CA) a myší BAFF ELISA kitu (R&D Systems, Minneapolis, MN), podle protokolů výrobce.
Test na Gd-IgA1 produkovaný lidskými buňkami sekretujícími IgA1-
Sendvičový test ELISA pro Gd-IgA1 byl zkonstruován pomocí protilátky specifické pro Gd-IgA1 (IBL, Japonsko). hodiny při pokojové teplotě. Vzorky byly aplikovány a inkubovány po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Destičky byly promyty a inkubovány po dobu 2 hodin při pokojové teplotě s 1:1000- zředěnou myší anti-lidskou IgA11-řetězcově specifickou monoklonální protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (Southern Biotech, Birmingham, AL). Po promytí byly destičky vyvolány roztokem o-fenylendiaminu SIG-MAFAST (Sigma-Aldrich) a reakce byla zastavena přidáním 1M kyseliny sírové (Wako, Osaka, Japonsko). Hladiny Gd-IgA1 byly extrapolovány odkazem na standardní křivku (4-parametr logistické křivky) optické hustoty při 490 nm a vyjádřené v jednotkách. Enzymaticky generovaný Gd-IgA1 z lidské plazmy IgA152 byl sériově naředěn (1,37–1000 ng/ml), aby se vytvořila standardní křivka. V této studii byla 1 jednotka definována jako 1 ng/ml standardního Gd-IgA1.52
Hodnocení renálního poškození u ddY myší
Ledvinywere removed after perfusion with normal saline solution. Renal tissue specimens for microscopic examination were fixed in 20% formaldehyde, embedded in paraffin, cut into 3-mm-thick sections, and then stained with periodic acid–Schiff. Specimens were quantitatively analyzed to determine the percentage of glomeruli with segmental and global sclerosis and/or mesangial cell proliferation and/or increase in the mesangial matrix. Each section was scored semiquantitatively for percentages of glomeruli with aforementioned lesions (0, 0%; 1, 1% to 24%; 2, 25% to 49%; and 3, >50 procent z 20 glomerulů).13,53,54 Celkové maximální skóre pro každý řez bylo 9. Renální vzorky pro imunofluorescenci byly ponořeny do směsi s optimální teplotou řezání (Sakura Finetek Japan Co., Tokyo, Japan) a skladovány při -80 stupních Vzorky byly nařezány na 3- mm silné řezy, fixovány acetonem při -20 stupních po dobu 5 minut, promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, blokovány blokovacím činidlem (DS Pharma Biomedical Co., Osaka, Japonsko) při teplotě místnosti po dobu 30 minut a poté inkubovány při teplotě místnosti po dobu 2 hodin s následujícími primárními protilátkami: kozí anti-myší IgA, Alexa konjugovaný kozí anti-myší IgG a potkaní anti-C3 (Bethyl Laboratories). Po dalších 3 promytích fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem byla sklíčka upevněna montážním médiem (Dako, Tokio, Japonsko). Vzorky byly analyzovány a zobrazeny pomocí konfokální laserové mikroskopie (Olympus Corporation, Tokio, Japonsko).
Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase
RNA z buněk sleziny byla extrahována pomocí roztoku Torizol (Invitrogen, Tokio, Japonsko) a purifikována pomocí RNeasy Mini Kit (74106; Qiagen, Valencia, CA). Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase byla provedena pomocí systému polymerázové řetězové reakce Applied Biosystems 7500 Real-Time za použití SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Tokyo, Japonsko) a specifických primerů: myší TLR9 přímý primer TCTCCCAACATGGTTCTCCGTCG, reverzní primer TGCAGTCCAGGCCATGA; myší MyD88 dopředný primer GCACCTGTGTCTGGTCCATT, reverzní primer CTGTTGGA CACCTGGAGACA; a housekeeping gen glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy přímý primer CATTGTGGAAG GGCTCATGA, reverzní primer TCTTCTGGGTGGCAGTGATG. Podmínky amplifikace byly následující: předehřívání na 95 stupňů po dobu 20 sekund a poté 40 cyklů denaturace na 95 stupňů po dobu 3 sekund a žíhání a extenze na 60 stupňů po dobu 30 sekund. Testy genové exprese TaqMan specifické pro Homo sapiens (Life Technologies, Carlsbad, CA) byly zakoupeny pro primer APRIL, Hs00601664_g1, Mm03809849-s1 a BAFF, Mm01168134-m1 . Podmínky cyklování polymerázové řetězové reakce TaqMan byly následující: předehřívání na 95 stupňů po dobu 20 sekund a poté 40 cyklů denaturace na 95 stupňů po dobu 3 sekund a žíhání a extenze na 60 stupňů po dobu 30 sekund
In vitro studie se splenocyty ddY myší
Splenocyty byly kultivovány v médiu Roswell Park Memorial Institute – 1640 doplněném 20 procenty fetálního telecího séra, 100 mg/ml streptomycinu a 100 U/ml penicilinu. Červené krvinky byly lyžovány v Red Blood Cell Lysing Buffer (R7757; Sigma-Aldrich) při pokojové teplotě po dobu 1 minuty, následovalo promytí v médiu Roswell Park Memorial Institute–1640.50 5 procent CO2. Jako ligand TLR9 byl použit CpG-ODN třídy C (TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG). Rekombinantní IL-6, anti-IL{15}} protilátka a kontrola izotypu potkaního IgG1 byly získány od R&D Systems. Buňky byly kultivovány buď s médiem nebo doporučenými koncentracemi CpG-ODN, 10 ng/ml rekombinantního IL-6 a 100 ng/ml anti-IL6 protilátky. IgA, aberantně glykosylovaný IgA, IgG-IgA IC a APRIL produkované splenocyty byly měřeny pomocí ELISA po 72-hodinové inkubaci in vitro.
Studie in vitro s buněčnými liniemi vylučujícími lidský IgA1-
B buňky z krve zdravého člověka byly imortalizovány virem Epstein-Barrové, subklonovány za vzniku buněčných linií vylučujících IgA1-a kultivovány, jak je popsáno.9 Dále jsme potvrdili expresi receptorů pro APRIL/BAFF a IL -6. Buňky byly kultivovány v médiu Roswell Park Memorial Institute-1640 doplněném 20 procenty fetálního telecího séra, streptomycinem a penicilinem ve zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních s 5 procenty CO2. Jako ligand TLR9 byl použit CpG-ODN třídy B (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT). Rekombinantní IL-6, rekombinantní APRIL, protilátka anti-IL{12}} a kontrolní protilátka kozího IgG byly získány od R&D Systems. Buňky byly kultivovány buď s médiem nebo doporučenými koncentracemi CpG-ODN, 50 ng/ml rekombinantního IL-6, 40 ng/ml rekombinantního APRIL a 100 ng/ml anti-IL-6 protilátky po dobu 72 hodin
Western blotting
Supernatanty z buněk sekretujících IgA{0}} byly separovány elektroforézou na gelu s dodecylsulfátem sodným a polyakrylamidem za redukčních podmínek za použití 5% až 15% gradientových deskových gelů. Gely byly přeneseny na polyvinylidendifluoridové membrány a inkubovány s protilátkami specifickými pro APRIL (Abcam Inc., Cambridge, MA) a glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Abcam Inc). Bloty byly vizualizovány chemiluminiscencí za použití zesílené chemiluminiscence (GE Healthcare, Tokio, Japonsko) a luminiscenčního detektoru (Konica Minolta Healthcare, Tokio, Japonsko). Výsledky byly vyhodnoceny denzitometricky.
DUBEN knockdown siRNA
Buňky vylučující lidský IgA1- byly kultivovány v 24-jamkových kultivačních destičkách a transfekovány siRNA specifickou pro APRIL (GS8741, Qiagen) nebo necílenou kontrolou siRNA (GS10673, Qiagen) pomocí transfekčního protokolu podle pokynů výrobce . Po inkubaci po dobu 24 hodin byly buňky inkubovány s 50 ng/ml rekombinantního IL-6 (R&D Systems) po dobu 72 hodin. Po inkubaci byly buňky a supernatanty sklizeny pro měření IgA a Gd-IgA1.
Statistická analýza
Korelace mezi různými parametry byla analyzována pomocí analýzy rozptylu. Data byla vyjádřena jako průměr ± SD nebo střední hodnoty. Hodnoty P < {{0}}},05="" byly="" považovány="" za="" statisticky="" významné.="" všechny="" statistické="" analýzy="" byly="" provedeny="" pomocí="" graphpad="" prism="" verze="" 6.0="" pro="" windows="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="">
cistancheproledvinapříznaky onemocnění
ZVEŘEJNĚNÍ
Všichni autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.
PODĚKOVÁNÍ
Tato studie byla částečně podpořena grantem JSPS KAKENHI č. 18K08252 a projektem praktického výzkumu pro onemocnění ledvin od Japonské agentury pro lékařský výzkum a vývoj, AMED. JN a BAJ byly částečně podpořeny granty Národního zdravotního ústavu DK078244 a DK082753. Děkujeme paní Terumi Shibata za její vynikající technickou pomoc. Děkujeme také paní Takako Ikegami a paní Tomomi Ikeda (Divize molekulárního a biochemického výzkumu, Juntendo University Graduate School of Medicine) a paní Tamami Sakanishi (Division of Cell Biology, Juntendo University Graduate School of Medicine) za jejich vynikající technickou pomoc .
DOPLŇKOVÝ MATERIÁL
Doplňkový soubor (PDF)
Obrázek S1. B buňky aktivované CpG-oligodeoxynukleotidem (ODN) a dendritické buňky (DC) dále zvyšují produkci IgA. B buňky a DC byly izolovány ze slezin ddY myší. Stimulace CpG-ODN zvýšila produkci IgA v izolovaných B buňkách. Toto zvýšení bylo dále zesíleno společnou kultivací B buněk s DC. *P < 0.05.="" podrobné="" metody="" jsou="" uvedeny="" v="" doplňkových="" metodách.="" doplňkové="">
REFERENCE
1. Myette JR, Kano T, Suzuki H a kol. Protilátka cílená na ligand indukující proliferaci (APRIL) je bezpečná a účinná léčba myší nefropatie IgA. Kidney Int. 2019;96:104–116.
2. Levy M, Berger J. Celosvětová perspektiva IgA nefropatie. Am J Kidney Dis. 1988;12:340–347.
3. D'Amico G. Nejběžnější glomerulonefritida na světě: IgA nefropatie. QJ Med. 1987;64:709–727.
4. Feehally J, Beattie TJ, Brenchley PE, et al. Sekvenční studie IgA systému u recidivující IgA nefropatie. Kidney Int. 1986;30:924–931.
5. Wyatt RJ, Julian BA. IgA nefropatie. N Engl J Med. 2013;368:2402–2414.
6. Suzuki H, Yasutake J, Makita Y a kol. IgA nefropatie a IgA vaskulitida s nefritidou mají společný rys zahrnující galaktózově deficitní IgA1- orientovanou patogenezi. Kidney Int. 2018;93:700–705.
7. Glasslock RJ. Analýza aktivity protilátek u IgA nefropatie. J Clin Invest. 2009;119:1450–1452.
8. Moldoveanu Z, Wyatt RJ, Lee JY a kol. Pacienti s IgA nefropatií mají zvýšené hladiny IgA1 s deficitem galaktózy v séru. Kidney Int. 2007;71: 1148–1154.
9. Suzuki H, Moldoveanu Z, Hall S, a kol. Buněčné linie vylučující IgA1-od pacientů s nefropatií IgA produkují aberantně glykosylovaný IgA1. J Clin Invest. 2008;118:629–639.
10. Imai H, Nakamoto Y, Asakura K, et al. Spontánní glomerulární depozice IgA u ddY myší: zvířecí model IgA nefritidy. Kidney Int. 1985;27:756–761.
11. Okazaki K, Suzuki Y, Otsuji M, et al. Vývoj modelu časného nástupu IgA nefropatie. J Am Soc Nephrol. 2012;23:1364–1374.
12. Nishie T, Miyaishi O, Azuma H, et al. Vývoj onemocnění podobné nefropatii imunoglobulinu A u myší s deficitem beta-1,4-galaktosyltransferázy-I. Am J Pathol. 2007;170:447–456.
13. Suzuki H, Suzuki Y, Yamanaka T, a kol. Skenování celého genomu v novém modelu nefropatie IgA identifikuje lokus citlivosti na myším chromozomu 10, v oblasti syntenické pro lidský IGAN1 na chromozomu 6q22-23. J Am Soc Nephrol. 2005;16:1289–1299.
14. Takei T, Iida A, Nitta K, et al. Asociace mezi jednonukleotidovými polymorfismy v genech pro selektin a nefropatií imunoglobulinu A. Am J Hum Genet. 2002;70:781–786.
15. Gharavi AG, Yan Y, Scolari F, a kol. IgA nefropatie, nejčastější příčina glomerulonefritidy, je spojena s 6q22-23. Nat Genet. 2000;26:354–357.
16. Suzuki H, Suzuki Y, Narita I a kol. Toll-like receptor 9 ovlivňuje závažnost IgA nefropatie. J Am Soc Nephrol. 2008;19:2384–2395.
17. Nakata J, Suzuki Y, Suzuki H a kol. Změny v nefritogenním sérovém IgA1 s deficitem galaktózy u IgA nefropatie po tonzilektomii a terapii steroidy. PLoS One. 2014;9:e89707.
18. Sato D, Suzuki Y, Kano T, a kol. Tonsillární exprese TLR9 a účinnost tonzilektomie se steroidní pulzní terapií u pacientů s IgA nefropatií. Transplantace nefrolového číselníku. 2012;27:1090–1097.
19. Coppo R, Camilla R, Amore A, et al. Exprese Toll-like receptoru 4 jsou zvýšené v cirkulujících mononukleárních buňkách pacientů s nefropatií imunoglobulinu A. Clin Exp Immunol. 2010;159:73–81.
20. Maiguma M, Suzuki Y, Suzuki H a kol. Dietní zinek je klíčovým environmentálním modifikátorem v progresi IgA nefropatie. PLoS One. 2014;9: e90558.
21. Kawai T, Akira S. Signalizace k NF-kappaB Toll-like receptory. Trends Mol Med. 2007;13:460–469.
22. Kuwata H, Matsumoto M, Atarashi K, et al. IkappaBNS inhibuje indukci podskupiny genů závislých na Toll-like receptorech a omezuje zánět. Imunita. 2006;24:41–51.
23. Rostoker G, Rymer JC, Barnard G, et al. Nerovnováha sérových prozánětlivých cytokinů a jejich solubilních receptorů: předpokládaná role v progresi idiopatické IgA nefropatie (IgAN) a nefritidy Henoch Schönleinovy purpury a potenciální cíl imunoglobulinové terapie? Clin Exp Immunol. 1998;114:468–476.
24. Suzuki H, Raska M, Yamada K, et al. Cytokiny mění IgA1 O-glykosylaci dysregulací enzymů C1GalT1 a ST6GalNAc-II. J Biol Chem. 2014;289:5330–5339.
25. Yamada K, Huang ZQ, Raska M, et al. Inhibice signalizace STAT3 snižuje produkci autoantigenu IgA1 u IgA nefropatie. Kidney Int Rep. 2017;2:1194–1207.
26. Schneider P, MacKay F, Steiner V, a kol. BAFF, nový ligand z rodiny tumor nekrotizujících faktorů, stimuluje růst B buněk. J Exp Med. 1999;189: 1747–1756.
27. Kiryluk K, Li Y, Scolari F, a kol. Objev nových rizikových lokusů pro IgA nefropatii implikuje geny zapojené do imunity proti střevním patogenům. Nat Genet. 2014;46:1187–1196.
28. Han SS, Yang SH, Choi M, et al. Role člena superrodiny TNF 13 v progresi IgA nefropatie. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3430–3439.
29. Hiki Y, Odani H, Takahashi M, et al. Hmotnostní spektrometrie prokazuje under-O glykosylaci glomerulárního IgA1 u IgA nefropatie. Kidney Int. 2001;59: 1077–1085.
30. Allen AC, Bailey EM, Brenchley PE a kol. Mesangiální IgA1 u IgA nefropatie vykazuje aberantní O-glykosylaci: pozorování u tří pacientů. Kidney Int. 2001;60:969–973.
31. Hiki Y. O-vázané oligosacharidy pantové oblasti IgA1: role jejich aberantní struktury ve výskytu a/nebo progresi IgA nefropatie. Clin Exp Nephrol. 2009;13:415–423.
32. Městecký J, Tomana M, Moldoveanu Z, et al. Role aberantní glykosylace molekul IgA1 v patogenezi IgA nefropatie. Kidney Blood Press Res. 2008;31:29–37.
33. McCarthy DD, Kujawa J, Wilson C, et al. U myší s nadměrnou expresí BAFF se rozvine komenzální flflóra závislá nefropatie spojená s IgA. J Clin Invest. 2011;121:3991–4002.
34. Muto M, Manfroi B, Suzuki H a kol. Stimulace Toll-like receptoru 9 indukuje aberantní expresi ligandu indukujícího proliferaci B buňkami germinálního centra tonzily u IgA nefropatie. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1227–1238.
35. Latz E, Schoenemeyer A, Visintin A, et al. TLR9 signalizuje po translokaci z ER do CpG DNA v lysozomu. Nat Immunol. 2004;5:190–198.
36. Hornung V, Rothenfusser S, Britsch S, et al. Kvantitativní exprese Toll-like receptoru 1-10 mRNA v buněčných podskupinách lidských mononukleárních buněk periferní krve a citlivost na CpG oligodeoxynukleotidy. J Immunol. 2002;168:4531–4537.
37. Kadowaki N, Ho S, Antonenko S, et al. Podskupiny prekurzorů lidských dendritických buněk exprimují různé toll-like receptory a reagují na různé mikrobiální antigeny. J Exp Med. 2001;194:863–869.
38. He B, Xu W, Santini PA a kol. Střevní bakterie spouštějí přepínání třídy imunoglobulinu A(2) nezávislé na T buňkách indukcí epiteliální buněčné sekrece cytokinu APRIL. Imunita. 2007;26:812–826.
39. Mackay F, Schneider P. Rozluštění kódu BAFF. Nat Rev Immunol. 2009;9: 491–502.
40. Kunimoto DY, Nordan RP, Strober W. IL-6 je účinný kofaktor IL-1 při syntéze IgM a IL-5 při syntéze IgA. J Immunol. 1989;143:2230–2235.
41. Beagley KW, Eldridge JH, Lee F a kol. Interleukiny a syntéza IgA. Lidský a myší interleukin 6 indukují vysokou rychlost sekrece IgA v B buňkách s IgA. J Exp Med. 1989;169:2133–2148.
42. Ramsay AJ, Manžel AJ, Ramshaw IA, et al. Role interleukinu-6 ve slizničních IgA protilátkových odpovědích in vivo. Věda. 1994;264:561–563.
43. Nurieva RI, Chung Y, Martinez GJ a kol. Bcl6 zprostředkovává vývoj T folikulárních pomocných buněk. Věda. 2009;325:1001–1005.
44. Poholek AC, Hansen K, Hernandez SG, et al. In vivo regulace Bcl6 a vývoje pomocných folikulárních buněk T. J Immunol. 2010;185: 313–326.
45. Jain S, Park G, Sproule TJ, a kol. Interleukin 6 urychluje mortalitu tím, že podporuje progresi onemocnění podobné systémovému lupus erythematodes u myší BXSB.Yaa. PLoS One. 2016;11:e0153059.
46. Litinskiy MB, Nardelli B, Hilbert DM, et al. DC indukují CD40-nezávislé přepínání imunoglobulinových tříd prostřednictvím BLyS a APRIL. Nat Immunol. 2002;3:822–829.
47. Castigli E, Wilson SA, Scott S, a kol. TACI a BAFF-R zprostředkovávají přepínání izotypů v B buňkách. J Exp Med. 2005;201:35–39.
48. Jourdan M, Chen M, Robert N, et al. IL-6 podporuje tvorbu lidských plazmatických buněk s dlouhou životností v kombinaci s faktory APRIL nebo solubilními faktory stromálních buněk. Leukémie. 2014;28:1647–1656.
49. Chu VT, Fröhlich A, Steinhauser G, et al. Eozinofily jsou nezbytné pro udržení plazmatických buněk v kostní dřeni. Nat Immunol. 2011;12: 151–159.
50. Suzuki H, Suzuki Y, Aizawa M, et al. Th1 polarizace u myší IgA nefropatie řízená buňkami získanými z kostní dřeně. Kidney Int. 2007;72: 319–327.
51. Chintalacharuvu SR, Emancipator SN. Glykosylace IgA produkovaného myšími B buňkami je pozměněna Th2 cytokiny. J Immunol. 1997;159:2327–2333.
52. Yasutake J, Suzuki Y, Suzuki H a kol. Nový přístup nezávislý na lektinu k detekci IgA1 s deficitem galaktózy u IgA nefropatie. Transplantace nefrolového číselníku. 2015;30:1315–1321.
53. Katafuchi R, Kiyoshi Y, Oh Y, et al. Glomerulární skóre jako prognostika u IgA nefropatie: jeho užitečnost a omezení. Clin Nephrol. 1998;49:1–8.
54. Ballardie FW, Roberts IS. Kontrolovaná prospektivní studie prednisolonu a cytotoxických látek u progresivní IgA nefropatie. J Am Soc Nephrol. 2002;13: 142–148.
